Name: Proteína de filme infravermelho eletroquímica demonstrada por estudo de oxidação de2 H pela hidrogenase NiFe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a técnica PFIRE para estudar a química do sítio ativo da hidrogenase [NiFe] sob controle eletroquímico e condições de espectroscopia infravermelha. Este método revela estados redox durante a catálise.

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O trabalho de K.A.V. e P.A.A. foi apoiado pelo Conselho Europeu de investigação (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), engenharia e ciências físicas pesquisa Conselho IB Catalyst award EP/N013514/1 e pesquisas de ciências biológicas e biotecnologia Conselho (BB/L009722/1 e BB/N006321/1). R.H. foi apoiada pelo Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica e Lincoln College, Oxford. Os autores reconhecem Mr. Charlie Jones, Sr. Charlie Evans e pessoal da oficina mecânica (departamento de química) para assistência na concepção e fabrico de spectroelectrochemical células utilizadas neste trabalho.

1. recriando o compartimento interno de amostra de um espectrômetro FTIR dentro de uma caixa de luvas anaeróbica, seca e requisitosgerais Experimental
<ol><li>Use um espectrômetro FTIR comercial, equipado com um detector de Telureto (MCT) externo de mercúrio cádmio e acessório ATR. Limpar o corpo do aparelho com ar seco ou dinitrogênio, ou alternativamente, usar um espectrômetro com um banco óptico evacuado.</li>
	<li>Coloque o espectrômetro sobre uma mesa estável, livre de vibração à mesma altura como um anaeróbio (< 1 ppm O2), secar o porta-luvas (ponto de orvalho <-75 º C). Desvie o feixe do espectrómetro de IR para o porta-luvas, através de uma janela transparente de IR suficientemente grande para acomodar o feixe desfocado. Nota: É importante que o espaço entre o porta-luvas e espectrômetro também é purgado ou evacuado, especialmente se um material higroscópico janela, tais como NaCl ou KBr, por exemplo, é usado.</li>
	<li>
Replica o compartimento de amostra interna do aparelho dentro do porta-luvas.
	<ol>
<li>Direcionar o feixe dentro do porta-luvas para um espelho elipsoidal fora do eixo, idealmente com o mesmo comprimento focal como o espelho de focagem interno do espectrómetro. Nota: É útil ter dois espelhos de avião adicional colocados antes este espelho de focagem, a fim de permitir que tanto a altura e a direção do feixe de IR ser ajustadas dentro do porta-luvas; Isto irá compensar qualquer imprecisão na colocação inicial do espectrómetro.</li>
		<li>Colocar um detector MCT externo, completo com um apropriado focagem óptica (como uma lente de distância focal curta ZnSe ou espelho parabólico fora do eixo, com uma distância focal curta) dentro do porta-luvas, posicionado como replicar as dimensões da amostra interna compartimento do espectrómetro.</li>
		<li>Ajuste o 'foco' do feixe IR para ser aproximadamente equidistante entre o espelho de focalização e o detector do MCT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legal o dewar do detector MCT externo com nitrogênio líquido.</li>
	<li>Monte o acessório ATR no compartimento de amostra do porta-luvas. Alinhe a entrada e saída de focagem óptica e acessório ATR para atingir a taxa de transferência máxima para o detector MCT. Se necessário, utilize uma abertura ou outra atenuação apropriada (por exemplo, uma grade de arame) para evitar supersaturação do sinal do detector. Nota: para os dados apresentados aqui, um acessório ATR de cinco-reflexão com todos os sistema ótico reflexivo e um Si trapezoidal removível, elemento de reflexão interna (IRE) é usado (Crystal GmbH, dimensões ca 5 × 8 × 1 mm3, ângulo rosto 39,5 °). A ira é montada em uma placa removível base usinado a partir de poliéter éter cetona (PEEK).</li>
	<li>Use uma caixa de luvas para abrigar o compartimento de amostra recriada com feedthroughs adequados para permitir a conexão de um potentiostat alojados externamente (conexões BNC apertadas de gás são úteis para essa finalidade), acesso a gás e cabos para transferir o sinal do MCT detector. É importante reter qualquer blindagem do cabo do detector para evitar a introdução de ruído ou interferência para as medições.</li>
	<li>Coloque uma bomba peristáltica, capaz de taxas de fluxo maiores que 60 mL/min dentro do porta-luvas. Uma visão esquemática do espectrómetro, ATR acessória, peristáltica bomba e potentiostat de configuração é mostrada na Figura 1.</li>
	<li>Construa uma célula de spectroelectrochemical, como mostrado esquematicamente na Figura 2, que sela para a ATR acessório. A célula deve conter um eletrodo de contador de alta área de superfície (Pt fio ou gaze), uma conexão para o eletrodo de trabalho (haste de carbono) e um eletrodo de referência em miniatura. A célula deve conter pelo menos duas portas adicionais como entrada e saída para o fluxo rápido de soluções através da célula. Nota: Um eléctrodo de referência de calomelano saturado em miniatura é ideal para esta finalidade. 36
</li>
</ol>2. preparação de partículas de negro de carbono modificado com Escherichia coli Hydrogenase 1
<ol><li>Em uma caixa de luvas anaeróbica 'molhada', misture 20 mg de alta área de superfície partículas de negro de carbono (> 1.000 m3/g) com 1 mL de água de ultra alta pureza (resistividade > 18 cm MΩ) em um tubo de microcentrifugadora. Dispersar as partículas por sonication de baixa potência (< 100 W) pelo menos 15 min, ou até que a dispersão é uniforme e faz não sedimentos dentro de 1h, para dar uma dispersão de negro de carbono com uma carga de cerca de 20 mg/mL.</li>
	<li>
Tomar uma alíquota de Escherichia coli hidrogenase 1 (Hyd1, aproximadamente 50 µ l, preparada de acordo com um procedimento publicado55) em uma concentração de ~ 7 mg proteína/mL e trocá-lo em um buffer de baixa força iônica em um pH próximo ao ponto isoelétrico (para exemplo fosfato de potássio, 15 mM, pH 5.8, sem sal adicional). Para obter melhores resultados, use uma preparação enzimática é tão ativa quanto possível. Realize a troca do amortecedor por concentração e diluição, em um dispositivo de filtragem centrífuga com um peso molecular apropriado corte (50 kDa funciona bem para Hyd1).
	<ol>
<li>Adicione o Hyd1 para o dispositivo de filtro.</li>
		<li>Dilua com cerca de 450 µ l de tampão de troca.</li>
		<li>Reconcentrar a um volume de 50 µ l usando centrifugação suave (< ~ 2700 × g) para evitar a precipitação irreversível.</li>
		<li>Repita os passos 2.2.2 e 2.2.3 até troca de amortecedor é completa (normalmente dentro de ~ 5 ciclos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misture um volume de 5 µ l de 20 mg/mL de dispersão de negro de carbono (preparado em 2.1) com a alíquota de 50 µ l de tampão-trocadas Hyd1. Armazene a mistura de enzima-partícula no frigorífico (a 0 ° C) durante a noite para permitir que a enzima adsorver. Pode ser necessário agitar a mistura ocasionalmente para garantir que as partículas permanecem dispersas.</li>
	<li>Lave as partículas Hyd1 modificado com tampão de baixa força iônica (fosfato de potássio, 15 mM, pH 5.8, sem sal adicional) por sucessivos ciclos de sedimentação e re-dispersão microcentrifuga (~ 2.700 × g). Repita este processo 3 - 5 vezes para remover a enzima não-adsorvido. Nota: Antes da primeira lavagem o sobrenadante deve ser praticamente incolor, indicando boa adsorção da enzima.</li>
	<li>Concentre as partículas até um volume final de ~ 5 µ l, para dar um carregamento final ~ 20 mg/ml de partículas enzima modificada. Nota: As partículas Hyd1 modificados podem ser armazenadas a 4 ° C por até duas semanas se permanecer hidratados; Isto é melhor conseguido armazenando partículas diluídas com ~ 50 µ l de água ultra alta pureza.</li>
</ol>3. preparação para medições de PFIRE em e. coli Hydrogenase 1
<ol><li>Limpar a ira de Si por baixa potência sonication (< 100 W), primeiro em H2então4 (< 90% w/w) para ~ 15 min e depois em HNO3 (70% w/w) para até 1 hora. Este procedimento de limpeza deve conduzir a uma superfície hidrofílica de IRE. Se mais limpeza é necessária a ira pode ser colocada em solução de piranha (uma proporção de 1:3 de H2O2: H2SO4) para oxidar qualquer material orgânico remanescente. Nota: Métodos de limpeza ácidos duros podem não ser adequados para uso com todos os materiais IRE. Solução de piranha é altamente corrosiva e um oxidante forte, as superfícies devem estar razoavelmente limpas, antes de uso da solução de piranha e cuidados deve ser tomado durante a preparação e uso de solução de piranha, devido à natureza exotérmica do processo - sempre adicionar H2O 2 lentamente a H2SO4 e referem-se aos procedimentos de segurança adequados para preparação, utilização e eliminação.</li>
	<li>Enxágue a ira limpa em água ultra alta pureza e secar sob um fluxo de gás nitrogênio seco. Realize qualquer manuseio de prisma, usando uma pinça limpa para evitar a contaminação.</li>
	<li>Sele a ira para a ATR acessória placa de base usando uma tira fina de selante de silicone de elétrico-classe. Tome cuidado para restringir o selante nas bordas da ira. Permitir que o selante secar totalmente.</li>
	<li>Transferir a placa de base acessória ATR para o espectrómetro de luvas e montá-lo para o acessório ATR. Medida um espectro de referência (fundo) entre 4000-1.000 cm-1 , com resolução de 4 cm-1 , usando o padrão rápido scan mode do espectrómetro e 1024 interferograms em média (medição tempo ~ 3-5 min). Use este espectro como uma entrada para permitir o cálculo de espectros de absorvância mais tarde no experimento. Nota: Devido a pequena absorbância esperada para o sítio ativo Hyd1 é necessário coletar espectros com sinal elevado para rácios de ruído.</li>
	<li>Transferi a placa de base acessória ATR para o glovebox 'molhado', que contém a dispersão de partícula pré-preparadas Hyd1-modificado (secção 2). Gota-elenco uma alíquota de 1 µ l da dispersão de partículas para o grande rosto da ira e espalhá-los uniformemente em toda a superfície. Nota: Não permitir que as partículas se tornar completamente seco sobre a ira.</li>
	<li>Corte um pedaço de papel de carbono, como que usado como material de camada de difusão de gás nas células de combustível, para um tamanho de ~0.1 mm menor do que as dimensões de superfície da ira, (ou seja, ca. 8.2 × 4,9 mm2). A área da superfície do papel carbono deve ser grande o suficiente para cobrir as gota-elenco modificado Hyd1 partículas, mas não tão grande quanto se sobrepõem o vedador do silicone usado para fixar a ira. Mergulhe o papel de carbono em água e delicadamente, coloque-o sobre o topo do filme partícula. O papel de carbono irá fornecer uma boa conexão elétrica em todo o filme toda partícula. Nota: É benéfico para preparar vários pedaços de papel carbono com antecedência e armazená-los previamente embebido em água de pureza ultra alta dentro do porta-luvas anaeróbico 'molhado'.</li>
	<li>Montar a célula spectroelectrochemical (descrito em 1.7 e mostrado esquematicamente na Figura 2) sobre a ira, fixá-lo na placa de base com parafusos. Adicione ~ 200 µ l de buffer experimental para manter a enzima hidratada. Um sistema de buffer misto, capaz de buferização sobre uma ampla faixa de pH, é útil para estudos sobre NiFe hidrogenases: acetato de sódio56 , 2-[N'-Morpholinos] etano-sulfônico (MES), N'-[2-hidroxietil] piperazina -N' -[2-etano-sulfônico] (HEPES), N'-[hidroximetil] ácido metil-3-amino-propano-sulfônico (torneiras) e 2-[N'-cyclohexylamino] etano-sulfônico (CHES), com cada componente em uma concentração final de 15 mM e contendo 0,1 M NaCl como suporte eletrólito, com pH ajustado a pH 6 utilizando concentrada de NaOH e HCl. Nota: A conexão do eletrodo de trabalho deve projetar-se ligeiramente abaixo do plano do topo da célula de spectroelectrochemical (~0.1 mm) para garantir boa conexão eletrônica para o papel de carbono (Figura 2).</li>
	<li>Conectar-se a solução de entrada e saída da célula de spectroelectrochemical para um sistema de fluxo que contém um frasco do buffer experimental e tubo de bomba peristáltica. Transferi a célula montada para o porta-luvas 'seco' contendo o espectrômetro.</li>
	<li>Monte o conjunto de células de spectroelectrochemical sobre o acessório ATR. Conectar-se a trabalhar, contador e eletrodos de referência para o potentiostat. Conecte o tubo da bomba peristáltica para a bomba.</li>
	<li>Grave um espectro de absorbância com 1024 em média interferograms na resolução de 4 cm-1 em uma faixa espectral de 4.000-1.000 cm-1, usando o espectro coletado em 3.4 como referência/fundo. Neste ponto o espectro deve conter significativa (> 100 mO.D...) amida II bandas no ~ 1.540 cm-1 e bandas de sítio ativo de Hyd1 devem ser evidentes na região espectral 1.850-2.150 cm-1, em grande parte nos Estados oxidados, inativos (Figura 3 ).</li>
</ol>4. activação de Escherichia coli Hydrogenase 1 e teste o celular Spectroelectrochemical
<ol><li>Aplica um potencial de redução (−0.8 V vs SCE) para o filme de partícula Hyd1-modificado. Sature o buffer experimental com buffer de fluxo e2 H lentamente através da célula de spectroelectrochemical. Deixe a amostra durante a noite para ativar completamente o Hyd1. Nota: É importante usar anaeróbica H2, N2 etc.e então todos os gases anaeróbicos deve ser passado através de um filtro de2 O.</li>
	<li>Grave um espectro de absorbância da amostra após a ativação. O νCO e vCN bandas do sítio activo devem agora mostrar uma distribuição de Estados reduzidos, 'ativos'. Este é mais facilmente observado através do uso de um espectro de diferença, em relação ao espectro gravado em 3.10 (Figura 4).</li>
	<li>Teste a conexão elétrica da célula spectroelectrochemical. Para fazer isso, sature o buffer experimental com gás de2 N. Aplicar uma sequência de oxidação (0 V vs SCE) e redução (−0.8 V vs SCE) potenciais (de duração de 30 min de ca ) para o filme de partícula Hyd1 modificado e gravar um espectro de absorbância em cada um. O Hyd1 deve tornar-se rapidamente oxidado e reduzido, e se o filme de partícula está bem ligado 100% da amostra deve responder ao potencial aplicado.</li>
	<li>Defina uma taxa de fluxo apropriado do buffer experimental. Para fazer isso, aplique um potencial de redução (−0.8 V vs SCE) à amostra e saturar o buffer experimental com H2. Gravar uma série de voltammograms cíclicas entre-0.707 - 0.039 V vs SCE a uma taxa de varredura de 10 mV/s. gradualmente aumente a taxa de fluxo de H2-saturada buffer entre voltammograms até o protector catalítico que assemelha-se em uma rotação planar disco de eletrodo55 e a corrente máxima é independente da taxa de fluxo (Figura 5). Nota: O limite de solubilidade de H2 em água é ~0.8 mM a 293 K e 1 bar.</li>
	<li>Como a amostra está agora pronta para medições de PFIRE, colete espectros em uma variedade de potenciais, sob uma variedade de condições de solução (pH, temperatura, concentração de2 H etc.). Grave todos os dados eletroquímicos utilizando o software potentiostat, como é importante ser capaz de correlacionar os dados espectroscópicos e eletroquímicos, especialmente quando estudar processos electrocatalytic como oxidação de2 H por Hyd1.</li>
</ol>5. manipulação de dados espectroscópicos
<ol><li>Confirme que o sítio ativo não foi permanentemente alterado no decurso das medições por gravação espectros em 0 V e −0.8 V vs SCE no final do experimento. Estes devem ser idênticos para os espectros no ponto 4.3, e sem perda de sítio ativo deve ser observada durante a medição (Figura 6).</li>
	<li>Espectros de absorvância absoluto de exportação a partir do software de espectrômetro em um formato adequado (CSV, ASCII, 'matlab', Jcamp etc) para processamento usando o software como origem ou Matlab.</li>
	<li>
Linha de base corrigir os dados, usando o processo ilustrado na Figura 7.
	<ol>
<li>Tomar a segunda derivada de cada espectro de absorbância no intervalo 1.800-2.150 cm-1, a fim de identificar pequenas (< 1 mO.D...) faixas de sítio ativo no contexto de água altamente curvado.</li>
		<li>Coloque pontos de marcador de linha de base no espectro de absorção do original e definir os pontos de 'encaixe' para o espectro experimental.</li>
		<li>Cabe uma linha de base através de pontos usando uma função spline cúbica interpolados ou uma função polinomial. Subtrai a essa função de linha de base de dados experimentais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente.

PFIRE é uma técnica de espectroscopia de IR amplamente aplicável para endereçamento de proteínas redox eletrodo-imobilizado. Em particular, electrocatalytic reações de enzimas redox podem ser analisadas sob condições de rápida rotatividade. O método PFIRE baseia-se o controle de eletroquímico direto fornecido pela técnica de PFE, que não dá nenhuma informação estrutural direta e casais a espectroscopia de IR em um eletrodo de carbono. A abordagem PFIRE assim adiciona uma visão química com as informações disponíveis da eletroquímica sozinha e é altamente adequada para o estudo de enzimas e proteínas redox envolvidas na ligação de pequenas moléculas e ativação. Além disso, PFIRE podem fornecer informações sobre potencial dependente de mudanças estruturais em proteínas na ausência de volume de negócios catalítico. Tais eventos de transferência de elétrons não-volume de negócios são frequentemente difíceis de detectar usando aplicativos 'padrão' de PFE, embora a extensão do PFE a transformada de Fourier AC voltametria tem sido usada com grande sucesso. 45 , 46
O método PFIRE é, em princípio, adequado para o estudo de qualquer proteína redox que pode ser estudada usando PFE. Portanto, como com PFE, adsorção de proteínas é um passo crítico para uma experiência bem sucedida de PFIRE. Neste protocolo, descrevemos uma aplicação da técnica PFIRE usando Hyd1 de Escherichia coli como um estudo de caso. 36 , 43 no entanto, também aplicámos a técnica PFIRE para a hidrogenase citoplasmática reguladora de r. eutropha,44 e o mononucleótido de flavina adsorvido em carbono preto. 40 em todos estes casos, a adsorção física simples ao carvão sem modificações alta área de superfície (conforme descrito neste protocolo) fornece uma cobertura de superfície da proteína que é alta o suficiente para espectros de IR gravar de boa qualidade com uma alta relação sinal-ruído. Em casos onde não é possível obter níveis tão altos de adsorção pode ser necessário modificar a superfície das partículas de carbono, por exemplo, para permitir a fixação covalente de proteína para a superfície do eletrodo. 60 , 61 , 62 a utilização de uma caixa de luvas para medições de PFIRE só é estritamente necessária quando estudar amostras que devem ser tratadas por via anaeróbia. No entanto, na prática o extremamente constante e baixo (ponto de orvalho < 80 ° C) níveis de vapor de água fornecida pela atmosfera glovebox dar altos níveis de sinal-ruído que permitem a extração das absorvâncias muito pequenas. 44 em muitos casos um ambiente anaeróbio, como o fornecido pelo porta-luvas, é também desejável para a medição de eletroquímica (integral para a técnica PFIRE) para evitar atual devido a redução de2 O para o eletrodo de trabalho.
Absorvâncias de IR devido ao volume de água, buffers de experimentais e as partículas de carbono no qual a amostra é adsorvida contribuem significativamente para os espectros experimentais e poderia sobrepor-se bandas de interesse, nomeadamente a amida, regiões II e III do espectro. 63 a região de Amida também contém informações de espécies orgânicas como flavinas ou nicotinamida cofactores, bem como os substratos e produtos de muitas reações de oxidação e redução. No caso de NiFe hidrogenases, bandasCN CO e ν νdo sítio ativo cair em uma região relativamente clara do espectro e então a técnica PFIRE é muito bem adaptada para o estudo destas enzimas. Em outros casos, no entanto, espectros de diferença juntamente com abordagens isotópicas de rotulagem podem ser necessário para isolar as mudanças devido a proteína imobilizada. Abordagens similares têm sido utilizadas para identificar, por exemplo, alterações de protonação, rearranjos estruturais e estudar complexos de Michaelis-Menten usando espectroscopia de IR. 64 , 65 , 66 PFIRE não é, portanto, limitado ao estudo de hidrogenases, mas pode ser aplicado a qualquer proteína redox que contém (ou cujos substratos, produtos ou inibidores contêm) grupos com diagnósticos vibrações IR-ativo; dehydrogeanses de monóxido de carbono,67 nitrogenases,68,14 flavoproteínas,40 e formiato de desidrogenases, por exemplo.
A técnica relacionada, SEIRA, está muito bem adaptada para o estudo de proteínas de membrana-associado em um ambiente biomimético. 32 SEIRA é uma adaptação da espectroscopia de IR que também usa uma configuração de ATR-IR e faz uso de um efeito de superfície do realce que amplifica a absorvância de IR de moléculas situadas perto de (alguns nm) a superfície do prisma ATR (IRE). SEIRA é, portanto, requintadamente sensível a alterações espectrais que ocorrem dentro da arquitetura de proteínas e membrana adsorvida e é relativamente livre de concorrentes sinais de solvente e substratos/inibidores presentes na solução. Isso é um pouco em contraste com a técnica PFIRE descrita aqui que se baseia em uma profundidade de penetração significativamente maior acima da superfície da ira (~ 1 µm), significando que PFIRE é mais sensível a substratos, produtos ou inibidores presentes na solução. Este aumento da sensibilidade à «a granel» solvente pode ser vantajoso; Se o substrato ou o produto pode ser observado diretamente por IR, espectros PFIRE relatam sobre ambos cinética do estado estacionário da longeva espécie ativa e formação de produto associado durante a electrocatalysis. 69 a capacidade de observar as concentrações de estado estacionário de substrato e o produto será particularmente valiosa para enzimas como a desidrogenase de monóxido de carbono (que catalisa a oxidação reversível de CO de CO2, um forte absorvente de IR) ou desidrogenase de formiato (que catalisa a oxidação reversível de formiato de CO2).
Atualmente, PFIRE é limitado a estudos cinéticos de estado estacionário de enzima electrocatalysis devido os eletrodos de carbono macroscópica costumávamos 'concentrado' a enzima para a superfície de uma ira para coleta de dados em e geometria ATR-IR. A este respeito estudos PFIRE de NiFe hidrogenases são complementares ao trabalho de Dyer e cooperadores,49,50 , quem usar a espectroscopia de absorção de transiente acionada por luz de IR estudar a cinética de sub volume de negócios. Trabalho está em andamento miniaturizar a célula spectroelectrochemical,40 , e com o uso de microeletrodos resolução de tempo da ordem de microssegundos deve ser alcançável. Isto permitirá o estudo da cinética sub volume de negócios para as enzimas com frequências de volume de negócios até ca 100-500 s-1e permitirá o estudo de processos redutoras e oxidativos.
Em geral, PFIRE é uma técnica espectroscópica que permite a caracterização química de electrocatalytic reações de enzimas redox sob condições de estado estacionário. A abordagem PFIRE permite múltiplas titulações químicas e eletroquímicas a efectuar sobre a mesma amostra de enzima, como os eletrodos de alta área de superfície usados fornecem uma robusta adsorção de proteínas e a geometria de ATR-IR permite troca de fácil solução. A capacidade de coletar tais informações estruturais em situ durante a função de enzima é uma ferramenta inestimável para a Comunidade bioelectrochemistry.

Um desafio fundamental no estudo da função da proteína envolve o desenvolvimento de métodos em situ que permitem a observação direta de proteínas realizando suas funções fisiológicas, in vivo ou usando isolado amostras da proteína. Isto requer a integração de controle ou desencadear processos em procedimentos experimentais e a utilização de técnicas combinadas que permitem tanto a reatividade ser avaliada e etapas químicas individuais durante a função da proteína a ser medido, simultaneamente. No caso de proteínas redox isso muitas vezes equivale a combinando técnicas de eletroquímicas, que precisamente controlam o potencial aplicado, mas não fornecem nenhuma informação química direta, com técnicas espectroscópicas que são sensíveis a quimicamente específicos mudanças associadas com a função da proteína. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry é um termo geral para uma variedade de métodos eletroquímicos e espectroscópicos em acoplado que abrangem uma variedade de técnicas espectroscópicas e níveis de controle eletroquímica. Muitas proteínas podem trocar elétrons com artificial, solúvel de elétrons doadores e aceitadores e isto tem sido explorado em estudos que utilizam pequenas moléculas para mediar a transferência de elétrons, incluindo o acoplamento com UV-visível,4,5 , 6 , 7 Dicroísmo circular magnético8 e infravermelho5,9,10,11,12,13,14 (IR) espectroscopia. Em um número limitado de casos revelou-se possível explorar a troca de elétrons sem intermediação, controlado por difusão entre proteínas e eletrodos. 15 , 16
Para reações catalíticas realizado por enzimas redox, abordagens de eletroquímica solução presente uma clara desvantagem. Difusão-controlado elétron transferência via redox mediadores em solução é provável tornar-se limitar a taxa. Cinéticas e mecanicistas informações sobre a enzima podem ser perdido, ou pelo menos tornar-se difícil para deconvolute de artefatos de difusão resultante do método experimental. Controle de eletroquímico direto, sem intermediação, portanto, é uma importante ferramenta para o estudo de enzimas e proteínas redox. A técnica de eletroquímica de filme de proteína (PFE) emprega proteínas imobilizadas de eletrodo redox, de tal forma que os electrões são transferidos diretamente para ou a partir de cofactores redox dentro a proteína como o eletrodo é polarizado em uma série de potenciais. 17 , 18 , 19 PFE é de particular valor para o estudo de reações de oxidação ou redução catalisada por enzimas redox, como transferência de elétrons interfacial pode ser alcançada em uma taxa muito elevada. Por exemplo, a taxa de rotatividade de electrocatalytic da hidrogenase ([NiFe]) de níquel-ferro de Allochromatium vinosum foi medida pela PFE como ca 1.000-10.000 s− 1 para oxidação de2 H. 20 o potencial de eletrodo age como um gatilho para transformar a catálise 'on' ou 'off' e os relatórios de electrocatalytic atual na atividade da enzima. PFE é, portanto, um valioso método para analisar a reatividade de enzimas complexas que dependem intimamente potencial, tais como reações de sítio ativo di-Ferro de [FeFe]-hidrogenases com CO e O2,21 ou induzida em potencial reações de inactivação de hidrogenases, desidrogenase de monóxido de carbono de22 ,23 e outras enzimas redox do complexo. 24
A principal barreira ao combinar técnicas espectroscópicas, com o controle de eletroquímico direto oferecido pela PFE decorre da baixa cobertura de superfície de enzimas redox, na ordem de 1-2 pmol cm-2 para a hidrogenase [NiFe] do a. vinosum, 20 em relação em situ estudos de ciência de superfície de adsorbates pequena molécula em eletrodos de metal em massa. Isso apresenta um desafio para a sensibilidade da medição espectroscópica. Vários métodos de spectroelectrochemical têm sido relatados para estudar imobilizada proteínas redox em uma variedade de eletrodos diferentes: espectroscopia UV-visível em eletrodos transparentes de óxido metálico; 25 , 26 , espectroscopia de fluorescência 27 em eletrodos de ouro; 28 , espectroscopia de absorção de infravermelho superfície reforçada (SEIRA) 29 em eletrodos de ouro; 30 , 31 , 32 , 33 e superfície reforçada técnicas de Espectroscopia Raman, principalmente em eletrodos de prata. 34 , 35
Aqui nós descrevemos um método para acoplamento PFE com espectroscopia de IR, em uma técnica conhecida como eletroquímica infravermelho do filme proteína (PFIRE). 36 o método the PFIRE estuda enzimas redox imobilizadas em um eletrodo de trabalho de carbono de alta área de superfície em conjunto com uma geometria de IR (ATR-IR) de reflectância total atenuada, explorando a facilidade de adsorção de uma gama de proteínas em superfícies de carbono. Espectroscopia de IR é útil em estudos de proteínas e enzimas redox como muitas moléculas pequenas, ligantes e cofactores têm absorvâncias de diagnósticos que podem ser usadas para avaliar o estado de reatividade, vinculação, inibição e redox. Exemplos de ligação de n de centros ferro-enxofre,37 estudo de flavoproteínas,38,39,40 pequena molécula vinculando a hemo centros etc. 41 o ATR-IR geometria permite a construção de uma célula eletroquímica de três-elétrodo otimizado (spectro)42 e, portanto, fornece controle excelente da eletroquímica. Resistência de solução e potencial deriva são minimizadas pela colocação de um eletrodo de referência perto do eletrodo de trabalho. Eletrodos de contador de alta área de superfície são usados que são compatíveis com as correntes de alta electrocatalytic produzidas pela rotatividade de enzima rápido para o eletrodo de trabalho. Fluxo de solução através da célula de spectroelectrochemical permite fácil controle sobre a concentração de substratos, inibidores e pH. 36 , 43 , 44 PFIRE o método, portanto, permite que a espectros de IR ser gravado em situ durante electrocatalysis enzima sustentado. 36 , 44 PFIRE também é capaz de fornecer informações químicas na ausência de catalisador atual,43 em contraste com PFE onde pode ser difícil extrair informações de processos não-catalítica de enzimas redox. 45 , 46
Nós demonstramos o método PFIRE para estudo de oxidação de2 electrocatalytic H por hidrogenases [NiFe], que contêm intrínseca CO e CN ligantes coordenados a fé a um sítio activo bimetálico. 36 , 43 , 44 [NiFe] hidrogenases, portanto, são particularmente adequados para estudar por PFIRE. O método PFIRE fornece informações sobre as espécies que estão presentes durante o volume de negócios de estado estacionário e, portanto, fornece uma visão mecanicista crucial, além da riqueza da literatura em espectroscopia de IR de hidrogenases sem controle experimental sobre o volume de negócios. 47 , 48 Dyer e cooperadores têm empregado tempo-resolvido métodos de IR estudar de NiFe hidrogenases,49,50,51 usando um disparador de luz também aplicar um pequeno passo de potencial negativo (através do uso de mediadores de solução e uma fonte de elétrons 'engaiolado') ou photolyse um hidreto acoplado. Embora o método PFIRE não pode, neste momento, fornecer resolução de tempo para combinar com as medições,40 , que permitem o estudo dos processos catalíticos redutoras e oxidativos, acessado em uma gama de potenciais bem definidos e livre de transporte em massa limitações.
O método PFIRE é distinto de estudos SEIRA de proteínas redox, que também usam uma geometria ATR-IR e empregam um eletrodo de metal nanoescala-áspera para melhorar a absorção de IR de moléculas adsorvidas na superfície do eletrodo. 30 SEIRA é uma técnica extremamente valiosa para o estudo de proteínas de membrana, em especial adsorvidas em ou dentro da membrana mimética arquiteturas,32 , mas a necessidade de um eletrodo de metal pode limitar o escopo de substrato e inibidor devido a reatividade o suporte de eletrodo para moléculas pequenas tais como CO, CN–, CO2 etc. Redução de próton e dessorção monocamada auto montado podem ser problemáticos em superfícies de metal em potenciais muito negativos,1,52 embora enzima electrocatalysis na desprotegido eletrodos de metal tem sido relatado. 53 , 54 uma desvantagem de PFIRE em relação a SEIRA é a relativa dificuldade de incorporação de proteínas de membrana em arquiteturas de membrana nativo ou mimética. No entanto, a relativa inércia química dos eléctrodos de carbono para reacções de ativação pequena molécula concorrentes faz PFIRE uma excelente técnica para o estudo da enzima electrocatalysis, particularmente no domínio de baixo potencial redox biológica relevante processos, tais como redução de prótons por hidrogenases. 1 , 43
O objetivo deste artigo é apresentar o método PFIRE como uma técnica para o estudo de proteínas redox eletrodo-imobilizado, usando NiFe hidrogenase 1 (Hyd1) de Escherichia coli como um exemplo. Considerações da preparação da amostra, a exigência de substrato bom fluxo e manipulação de dados são discutidas. PFIRE é uma técnica amplamente aplicável, well-suited ao estudar qualquer proteína redox (com características absorvâncias IR) que pode ser adsorvida em eletrodos de carbono, ou diretamente ou usando modificação da superfície, de tal forma que ele pode trocar elétrons com o eletrodo.

<table><tbody><tr><td>Espectrómetro</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>com um detector MCT externo</td></tr><tr><td>Acessório ATR</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Personalizado para utilização com um porta-luvas Si IRE de 5 reflexos</td></tr><tr><td>Glove</td><td>Box Technology Ltd.</td><td>N/A</td><td>Caixa 'úmida' e 'seca' projetada sob medida para manuseio e medição anaeróbica de amostras</td></tr><tr><td>Janela KBr</td><td>Crystran</td><td>Custom</td><td>Para permitir o acoplamento do porta-luvas com o feixe externo do espectrômetro FTIR</td></tr><tr><td>Óptica adicional Agilent</td><td></td><td>N/A</td><td>Componentes de um acessório PM-IRRAS</td></tr><tr><td>Silicon IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Custom</td><td>Trapezoidal: 8,4 mm x 5 mm (face grande), 1 mm de espessura, cerca de 39 graus de ângulo de face</td></tr><tr><td>Potenciostato</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Software para controlar o potenciostato</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Fio Pt</td>, <td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99,95% Fio de platina pura, Haste de carbono de 0,014 polegadas de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>WH Smith</td><td>30729209</td><td>0,7 mm HB lápis de chumbo</td></tr><tr><td>Preto de fumo</td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW corte</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S / 9240 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N / 2300 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>selante de silicone</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Papel carbono</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 gás</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gás</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software de análise de dados/gráficos</td></tr><tr><td>Resolutions Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>Software para controle de espectrômetro FTIR</td></tr></tbody></table>

proteína de filme infravermelho eletroquímica demonstrada por estudo de oxidação de2 h pela hidrogenase [nife]

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Noções básicas sobre a química dos métodos de demandas de proteínas redox que fornecem controle preciso sobre redox centros dentro da proteína. A técnica de eletroquímica de filme de proteína, em que uma proteína é imobilizada em uma superfície de eletrodo, tal que o eletrodo substitui doadores de elétron fisiológicos ou aceitadores, forneceu insights funcional sobre as reações redox de uma gama de diferentes proteínas. Compreensão plena química requer controle eletroquímico para ser combinado com outras técnicas que podem adicionar uma visão mecanicista e estrutural adicional. Aqui vamos demonstrar uma técnica, eletroquímica infravermelho da película de proteína, que combina eletroquímica de filme de proteína com amostragem de espectroscopia infravermelha de proteínas redox. A técnica utiliza uma geometria de reflectância total atenuada do múltiplo-reflexão para sondar uma proteína redox imobilizada em um eletrodo de carbono preto alta área de superfície. Incorporação deste eletrodo em uma célula de fluxo permite que o pH da solução ou concentrações de soluto a ser alterado durante as medições. Isto é particularmente forte no endereçamento de enzimas redox, onde ritmo acelerado catalítico pode ser sustentado e controlado no eléctrodo que permite a observação espectroscópica de long-lived espécies intermediárias no mecanismo catalítico. Demonstramos a técnica com experiências em Escherichia coli hidrogenase 1 em condições de não-volume de negócios e volume de negócios (oxidação de2 H).

Aqui, descrevemos uma técnica, eletroquímica infravermelho da filme de proteína, que permite que as proteínas redox imobilizado ser estudado espectroscopicamente sob o controle direto de eletroquímica de um eletrodo de carbono. Espectros de infravermelhos de uma amostra única proteína podem ser gravados em uma variedade de potenciais aplicadas e sob uma variedade de condições de solução.

Proteína de filme infravermelho eletroquímica demonstrada por estudo de oxidação de2 H pela hidrogenase [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

O objetivo geral deste protocolo é investigar a química do sítio ativo de uma enzima redox hidrogenase níquel-ferro sob condições de não-turnover e de turnover eletrocatalítico em estado estacionário, utilizando a eletroquímica infravermelha com filme proteico ou PFIRE. A principal vantagem da técnica PFIRE é que ela permite simultaneamente controle eletroquímico preciso e análise espectroscópica no infravermelho de proteínas redox imobilizadas em um eletrodo de carbono. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biofísica e bioeletroquímica sobre quais estados da proteína redox estão presentes durante o turnover catalítico em estado estacionário.Para iniciar o procedimento, em uma câmara anaeróbica úmida, suspenda 20 miligramas de partículas de negro de carbono de alta área superficial em um mililitro de água ultrapura. Sonique a suspensão em potência baixa por pelo menos 15 minutos ou até que as partículas estejam uniformemente dispersas e nenhum sedimento se forme dentro de uma hora em repouso. Em seguida, carregue 15 microlitros de uma solução de aproximadamente sete miligramas por mililitro da hidrogenase um de E.Coli em uma unidade de filtro centrífugo de 50 quilodaltons.Dilua a solução com 450 microlitros de um tampão de troca com baixa força iônica e pH próximo ao ponto isoelétrico da hidrogenase. Concentre a mistura até 50 microlitros por centrifugação a 27.000 vezes g. Reconcentre a mistura mais quatro vezes para completar a troca de tampão.Em seguida, combine cinco microlitros da dispersão de negro de carbono a 20 miligramas por mililitro com a hidrogenase submetida à troca de tampão. Armazene a mistura a zero graus Celsius durante a noite para permitir que a hidrogenase seja absorvida pelas partículas de negro de carbono. Verifique periodicamente a mistura para manter a dispersão das partículas.Centrifugue as partículas modificadas a 27.000 vezes g e verifique se o sobrenadante é quase incolor, indicando boa absorção da hidrogenase nas partículas. Alcançar um alto nível de absorção é essencial para o sucesso do experimento. Otimizamos o tampão de absorção utilizando o tampão de baixa força iônica no pH próximo ao ponto isoelétrico da proteína como ponto de partida.Lave as partículas com três a cinco ciclos de centrifugação e ressuspenda-as em tampão de troca fresco. Concentre a mistura de partículas até aproximadamente cinco microlitros para obter uma carga de partículas de 20 miligramas por mililitro. Para iniciar os preparativos para realizar as medições de PFIRE, limpe um elemento de reflexão interna de silicone por sonicação de baixa potência em ácido sulfúrico durante 15 minutos.Em seguida, trate com ácido nítrico por uma hora. Depois, lave o elemento com água ultrapura e seque-o sob um fluxo de gás nitrogênio seco. Utilize selante de silicone de grau elétrico para fixar o elemento de reflexão interna (IRE) na placa-base de um acessório ATR de cinco reflexões, tomando cuidado para aplicar o selante apenas nas bordas do IRE.Deixe o selante secar completamente. Em seguida, leve a placa-base para uma câmara anaeróbica seca com uma janela transparente à IR próxima a um espectrofotômetro FTIR. Monte a placa-base no acessório ATR.Adquira um espectro de fundo no modo de varredura rápida. Em seguida, desconecte a base do acessório ATR e transfira-a para a caixa de luvas anaeróbica úmida. Aplique por gotejamento um microlitro de partículas de negro de fumo modificadas com enzima uniformemente sobre a superfície do IRE, sem permitir que as partículas sequem completamente.É importante que a mistura de partículas modificadas com enzima tenha sido concentrada até uma carga o mais próxima possível de 20 miligramas por mililitro. Caso contrário, pode ser difícil obter uma película de partículas bem conectada ao depositar as partículas por gotejamento nesta etapa. Coloque suavemente um pedaço de papel de carbono embebido em água ultrapura sobre a superfície do IRE, garantindo que a película de partículas esteja coberta sem permitir que o papel entre em contato com o selante de silicone.Monte uma célula espectroeletroquímica personalizada sobre o IRE. Adicione 200 microlitros de tampão do experimento pela entrada de solução para manter a enzima hidratada durante a preparação do sistema. Conecte a entrada e saída de solução a um frasco de tampão do experimento por meio de tubos de bomba peristáltica.Em seguida, transfira a célula montada para a caixa de luvas seca. Fixe a montagem da célula no acessório ATR e conecte a tubulação à bomba peristáltica. Adquira um espectro de absorção utilizando o espectro previamente obtido como fundo.Verifique se as bandas MI2 estão fortemente visíveis em 1.540 centímetros recíprocos e se os picos do sítio ativo da hidrogenase são detectáveis na região de 1.850 a 2.150. Para preparar o experimento, aplique um potencial redutor de -0,8 volts em relação a um eletrodo de referência de calomelano saturado ao filme de partículas. Sature o tampão do experimento com gás hidrogênio anaeróbio.Em seguida, comece a fluir o tampão através da célula espectroeletroquímica a cerca de 12 mililitros por minuto. Deixe a amostra sob fluxo do tampão experimental saturado com hidrogênio durante a noite para ativar a hidrogenase. Adquira um espectro de absorção da amostra ativada e verifique se as bandas de CO e CN do sítio ativo mostram múltiplos estados reduzidos.Em seguida, sature o tampão do experimento com gás nitrogênio anaeróbico e faça o tampão fluir através da cubeta. Aplique um potencial oxidante de zero volts em relação a um eletrodo de calomelano saturado por 30 minutos e adquira um espectro de absorção. Em seguida, aplique um potencial redutor por 30 minutos e adquira outro espectro.Verifique se a enzima foi completamente oxidada e depois reduzida. Caso contrário, verifique as conexões elétricas da célula. Utilizando tampão saturado com hidrogênio anaeróbio, adquira uma série de voltamogramas cíclicos em taxas de fluxo crescentes para determinar a taxa de fluxo ideal para o experimento.Utilizando esta vazão, adquira espectros em uma variedade de potenciais e condições de solução. Medidas PFIRE da hidrogenase um de E.coli foram obtidas em diversos potenciais em atmosfera inerte e na presença de gás hidrogênio. Os espectros adquiridos sob atmosfera de hidrogênio representaram as distribuições em estado estacionário dos estados do sítio ativo presentes durante a oxidação catalítica de hidrogênio.A oxidação anaeróbica e a ativação da hidrogenase mediante a formação do estado níquel-B a partir do níquel-Si foram então investigadas mediante a aquisição de espectros em diferentes pontos temporais durante a aplicação de potencial e a preparação de diferentes espectros relativos ao primeiro espectro. A conversão gradual observada do níquel-Si para o níquel-B foi consistente com a diminuição monotônica da corrente. Os espectros também foram adquiridos em uma faixa de pH da solução para investigar as etapas de transferência de prótons no ciclo catalítico da hidrogenase.Em pH baixo, o estado níquel-C era mais prevalente, enquanto o estado níquel-L era mais prevalente em pH alto. A dependência em relação ao pH das concentrações relativas de níquel-C e níquel-L foi determinada a partir dos valores máximos de absorbância nos respectivos picos em cada pH avaliado no experimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de bioeletroquímica explorarem a cinética em estado estacionário da ativação de hidrogênio por hidrogenases.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de um experimento típico de PFIRE. A técnica é adequada para qualquer proteína redox que possa ser estudada por eletroquímica de filme proteico e acrescenta uma compreensão química direta à medição eletroquímica.

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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