Proteína de filme infravermelho eletroquímica demonstrada por estudo de oxidação de2 H pela hidrogenase [NiFe]

O objetivo geral deste protocolo é investigar a química do lado ativo de uma enzima redox de níquel-ferro hidrogenase sob condições de renovação eletrocatalítica sem renovação e em estado estacionário usando eletroquímica infravermelha de filme de proteína ou PFIRE. A principal vantagem da técnica PFIRE é que ela permite simultaneamente o controle eletroquímico preciso e a amostragem espectroscópica infravermelha de proteínas redox imobilizadas em um eletrodo de carbono. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biofísica e bioeletroquímica sobre quais estados da proteína redox estão presentes durante a renovação catalítica em estado estacionário.

Para iniciar o procedimento, em um porta-luvas anaeróbico úmido, suspenda 20 miligramas de partículas de negro de fumo de alta área superficial em um mililitro de água ultrapura. Sonicar a suspensão a uma potência mais baixa durante, pelo menos, 15 minutos ou até que as partículas estejam uniformemente dispersas e não se formem sedimentos no espaço de uma hora em repouso. Em seguida, carregue 15 microlitros de uma solução de aproximadamente sete miligramas por mililitro de E.Coli hidrogenase em uma unidade de filtro centrífugo de 50 quilodaltons.

Diluir a solução com 450 microlitros de um tampão de troca de baixa força iônica com um pH próximo ao ponto isoelétrico da hidrogenase. Concentrar a mistura a 50 microlitros por centrifugação a 27 000 vezes g. Reconcentre a mistura mais quatro vezes para completar a troca de tampão.

Em seguida, combine cinco microlitros da dispersão de negro de fumo de 20 miligramas por mililitro com a hidrogenase trocada pelo tampão. Armazene a mistura a zero graus Celsius durante a noite para permitir que a hidrogenase seja absorvida pelas partículas de negro de fumo. Verifique periodicamente a mistura para manter a dispersão das partículas.

Centrifugar as partículas modificadas a 27 000 vezes g e verificar se o sobrenadante é quase incolor, indicando uma boa absorção da hidrogenase pelas partículas. Alcançar um alto nível de absorção é fundamental para o sucesso do experimento. Otimizamos o tampão de absorção usando o tampão de baixa força iônica no pH próximo ao ponto isoelétrico da proteína como ponto de partida.

Lave as partículas com três a cinco ciclos de centrifugação e ressuspensão em tampão de troca fresco. Concentre a mistura de partículas em aproximadamente cinco microlitros para atingir uma carga de partículas de 20 miligramas por mililitro. Para começar a se preparar para fazer medições PFIRE, limpe um elemento de reflexão interna de silicone por sonicação de baixa potência em ácido sulfúrico por 15 minutos.

Seguido de ácido nítrico por uma hora. Em seguida, enxágue o elemento em água ultrapura e seque-o sob uma corrente de gás nitrogênio seco. Use selante de silicone de grau elétrico para fixar o IRE na placa de base de um acessório ATR de cinco reflexões, tomando cuidado para manter o selante nas bordas do IRE.

Deixe o selante secar completamente. Em seguida, coloque a placa de base em um porta-luvas anaeróbico seco com uma janela transparente IR ao lado de um espectrofotômetro FTIR. Monte a placa de base no acessório ATR.

Adquira um espectro de fundo no modo de varredura rápida. Em seguida, retire a placa de base acessória ATR e transfira-a para o porta-luvas anaeróbico úmido. Lançar um microlitro das partículas de negro de fumo modificadas com enzimas uniformemente sobre a superfície do IRE, sem permitir que as partículas sequem completamente.

É importante que a mistura de partículas modificadas por enzimas tenha sido concentrada a uma carga tão próxima quanto possível de 20 miligramas por mililitro. Caso contrário, pode ser difícil obter um filme de partículas bem conectado ao fazer dropcasting das partículas nesta etapa. Coloque delicadamente um pedaço de papel carbono embebido em água ultrapura na superfície do IRE, garantindo que o filme de partículas seja coberto sem permitir que o papel entre em contato com o selante de silicone.

Monte uma célula espectroeletroquímica personalizada sobre o IRE. Adicione 200 microlitros de tampão experimental através da entrada da solução para manter a enzima hidratada durante a preparação do sistema. Conecte a entrada e a saída da solução a um frasco de tampão experimental por meio da tubulação da bomba peristáltica.

Em seguida, transfira a célula montada para o porta-luvas seco. Monte o conjunto da célula no acessório ATR e conecte a tubulação à bomba peristáltica. Adquira um espectro absorvente usando o espectro previamente adquirido como fundo.

Verifique se as bandas MI2 são fortemente visíveis em 1.540 centímetros recíprocos e se os picos do sítio ativo da hidrogenase são detectáveis na região de 1.850 a 2.150. Para se preparar para o experimento, aplique um potencial redutor de 0,8 volts negativos versus um eletrodo de referência de calomelano saturado ao filme de partículas. Saturar o tampão experimental com hidrogénio gasoso anaeróbio.

Em seguida, comece a fluir o tampão através da célula espectroeletroquímica a cerca de 12 mililitros por minuto. Deixe a amostra sob o fluxo de tampão experimental saturado de hidrogênio durante a noite para ativar a hidrogenase. Adquira um espectro absorvente da amostra ativada e verifique se as bandas CO e CN do sítio ativo mostram vários estados reduzidos.

Em seguida, saturar o tampão experimental com gás nitrogênio anaeróbico e fluir o tampão através da célula. Aplique um potencial oxidante de zero volts versus um eletrodo de referência de calomelano saturado por 30 minutos e adquira um espectro absorvente. Em seguida, aplique um potencial redutor por 30 minutos e adquira outro espectro.

Verifique se a enzima foi completamente oxidada e depois reduzida. Caso contrário, verifique as conexões elétricas da célula. Usando tampão anaeróbico saturado de hidrogênio, adquira uma série de voltamogramas cíclicos em taxas de fluxo crescentes para determinar a taxa de fluxo ideal para o experimento.

Usando essa taxa de fluxo, adquira espectros em uma variedade de potenciais e condições de solução. Medições PFIRE de E.coli hidrogenase um foram obtidas em vários potenciais em uma atmosfera inerte e na presença de gás hidrogênio. Os espectros adquiridos sob uma atmosfera de hidrogênio representaram as distribuições de estado estacionário dos estados do sítio ativo presentes durante a oxidação catalítica do hidrogênio.

A oxidação anaeróbica e a ativação da hidrogenase via formação do estado níquel-B a partir do níquel-Si foram então investigadas adquirindo espectros em vários pontos de tempo durante a aplicação potencial e preparando diferentes espectros em relação ao primeiro espectro. A conversão gradual observada de níquel-Si em níquel-B foi consistente com a diminuição monotônica da corrente. Os espectros também foram adquiridos em uma faixa de pH da solução para investigar as etapas de transferência de prótons do ciclo catalítico da hidrogenase.

Em pH baixo, o estado de níquel-C foi mais prevalente, enquanto o estado de níquel-L foi mais prevalente em pH alto. A dependência do pH das concentrações relativas de níquel-C e níquel-L foi determinada a partir dos valores máximos de absorventes nos respectivos picos em cada pH avaliado no experimento. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da bioeletroquímica explorarem a cinética de estado estacionário da ativação do hidrogênio por hidrogênese.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de um experimento PFIRE típico. A técnica é adequada para qualquer proteína redox que possa ser estudada por eletroquímica de filme de proteína e adiciona uma visão química direta à medição eletroquímica.