Quantificando a dinâmica infra-lenta do poder espectral e da freqüência cardíaca em ratos dormindo

O objetivo geral deste procedimento é descrever como as atividades neurais e cardíacas são coordenadas durante o sono não REM de camundongos. Através do monitoramento e análise de sinais eletroencefalográficos, eletromiográficos e eletrocardiográficos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do sono.

Por exemplo, como o sono concilia duas necessidades essenciais e evolutivamente preservadas. Que devem ser contínuos e frágeis. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa polissonografia padrão para pontuar o sono não REM de uma maneira inovadora, baseada nas respostas comportamentais variáveis a estímulos externos.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando observamos que os ratos adormecidos mostravam respostas variáveis ao ruído, como acordar e dormir. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque ele combina habilidade cirúrgica, experimentação mínima e análise avançada. A demonstração visual desse método é crítica, pois várias etapas essenciais são novas no campo.

Em particular no que diz respeito ao design comportamental e análise de dados. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de distúrbios do sono em humanos. Porque identifica os momentos de sono que são altamente frágeis.

Para iniciar o procedimento, prepare-se para EEG ecogeolectrodes usando pedaços de fio de ouro de 0,5 centímetros de comprimento, cada um soldado em cima de um parafuso de aço banhado a ouro. Em seguida, limpe-os em etanol 70%. Em seguida, prepare dois eletrodos EMG-ECG com fios de ouro de três a quatro centímetros de comprimento.

Dobre os fios em um ângulo de 90 graus a um centímetro de uma extremidade e prepare uma bobina na outra extremidade. Entre as duas extremidades, dobre o fio para criar uma pequena curvatura que corresponda ao perfil da superfície do osso entre o cerebelo e a lambda. Depois disso, prepare um conector de cabeça fêmea para macho de seis canais, cobrindo o conector dos pinos fêmea e macho na base com fita adesiva.

Em seguida, adicione aos pinos nos cantos um pouco de estanho para facilitar o processo de soldagem. Nesta etapa, coloque um animal anestesiado no aparelho estereotáxico posicionando a boca. Isso corrigirá a cabeça do mouse.

Em seguida, fixe a cabeça posicionando as barras auriculares no crânio com suas extremidades reversas rombas. Em seguida, levante a pele no centro do crânio e corte suavemente a parte levantada da pele ao longo da linha média do topo do pescoço até o nível dos olhos. Em seguida, remova o couro cabeludo.

Certifique-se de que a janela seja grande o suficiente para ver claramente o bregma e as fissuras lambda do crânio. Fixe a pele de ambos os lados com serafinas de buldogue para garantir o acesso ao osso. Em seguida, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo com um bisturi.

Limpe a área com desinfetante à base de iodo e seque o crânio com um cotonete anti-séptico. Em seguida, usando uma lâmina de bisturi afiada, coce o crânio para obter uma superfície óssea limpa e matificada. Usando apenas a ponta do bisturi, risque uma grade como uma malha de sulcos com uma distância de um a dois milímetros entre as ranhuras.

Depois, execute quatro craniotomias no crânio em locais específicos com uma microbroca. Durante a perfuração, sopre o pó ósseo usando uma pipeta pasteur e limpe qualquer sangramento com cotonetes anti-sépticos. Se ocorrer sangramento, certifique-se de que ele seja interrompido completamente antes de retomar o processo.

Use uma esponja hemostática para acelerar a hemostasia. Fixe o parafuso em uma braçadeira hemostática. No hemisfério esquerdo, aparafuse dois parafusos banhados a ouro através das craniotomias.

Segure o clamp verticalmente acima da craniotomia e gire o parafuso sem se desviar da posição vertical. Abra suavemente o grampo hemostático para soltar o parafuso. No hemisfério direito, aparafuse os eletrodos previamente preparados através das craniotomias.

Adicione uma gota de cola na parte central do crânio para garantir a adesão firme do EMG-ECG esquerdo. Levante cuidadosamente a borda da pele dos músculos do pescoço com uma pinça e insira os fios EMG-ECG com as extremidades enroladas nos músculos. Para detectar os sinais de ECG cardíaco durante o sono, certifique-se de que o fio EMG-ECG esteja inserido no músculo a uma profundidade de cerca de 0,8 a um centímetro.

Posicione o EMG-ECG esquerdo próximo ao parafuso de ancoragem esquerdo posterior. Repita o procedimento para inserir o EMG-ECG correto. Posicione o EMG-ECG direito ao lado do parafuso de ancoragem anterior esquerdo.

Certifique-se de que as extremidades do laço sejam colocadas o mais longe possível umas das outras. É importante que os fios EMG-ECG sejam inseridos profundamente no músculo para que a frequência cardíaca seja detectada de forma confiável. Usando uma espátula, aplique a cola epóxi de dois componentes no crânio entre e ao redor dos parafusos.

Deixe secar à luz, mas proteja os olhos do animal da iluminação excessiva. Tente colocar os pinos do conector o mais próximo possível para minimizar a altura do implante usando uma pequena lâmpada de crocodilo. Solde os quatro pinos no canto do conector aos quatro fios.

Minimize o tempo de contato com a ponta de solda, pois ela aquece rapidamente os parafusos. Em seguida, preencha o espaço entre a cola e o conector com cimento dental e cubra as partes soldadas. Crie uma superfície lisa e evite bordas afiadas que possam machucar o animal.

Além disso, evite tocar na pele, pois isso causa coceira. Agora remova as serafinas de buldogue. Desinfete a ferida com desinfetante à base de iodo.

Se necessário, feche a ferida com pontos de sutura na frente e atrás do conector. Depois, monitore o animal todos os dias durante uma semana e procure perda de peso, atividade reduzida ou anormal e sinais de infecção. Cinco a seis dias após a cirurgia, conecte o cabo de gravação ao conector da cabeça do animal, deixando-o em sua gaiola doméstica.

Espere mais quatro a cinco dias antes do início da gravação para que o animal se habitue à condição e durma naturalmente. Com um software polissonográfico comercial, registre dados de EEG e EMG-ECG ao longo de 48 horas usando configurações típicas, como ganho de 2000 x, taxa de amostragem de 2000 hertz na aquisição, amostragem reduzida para 200 hertz após a aquisição. Aplique um filtro passa-alta de 0,7 hertz para todos os traçados de EEG e um filtro passa-alta de 10 hertz para todos os traçados EMG-ECG.

Nesta demonstração, o rato está dormindo há mais de 40 segundos. Aqui estão os sinais característicos de baixa frequência e alta amplitude no EEG e o baixo tônus muscular nos traços EMG. É importante que o mouse durma de forma estável por pelo menos 40 segundos antes que o ruído seja reproduzido para garantir uma longa linha de base para a análise do sono, antes de acordar ou dormir.

Agora um estímulo acústico, aqui um ruído branco, será entregue. Nesse caso, o mouse é ativado em 10 segundos. Observe que o EEG é dessincronizado quando o mouse é ativado.

Em outro caso, o mouse não acorda, mesmo que o ruído tenha sido emitido por mais de 20 segundos. Observe que o EEG não dessincroniza. Aqui são mostrados os traços brutos do EEG em preto e os sinais EMG-ECG correspondentes em cinza, por 40 segundos antes do início do ruído e durante os 20 segundos de ruído.

Este é um evento de sono. E este é um exemplo do evento de despertar. Os dados analisados correspondentes para a dinâmica de potência sigma na janela de 40 segundos antes do início do ruído são mostrados aqui para dormir e acordar.

O principal resultado dessa análise é que a potência sigma está em seu vale antes do início do ruído para um evento de sono e em seu pico para um evento de despertar. Em contraste com os eventos de acordar e dormir apresentados anteriormente, descartamos os eventos com uma transição precoce para o sono REM. E também descartamos os eventos com um despertar precoce antes do início do ruído.

Ao tentar este procedimento, é importante garantir que o sinal EMG detecte a frequência cardíaca durante o sono não REM. Além disso, lembre-se de que o procedimento de análise precisa ser entendido e implementado em um script de software para extrair a oscilação infralenta. Após este procedimento, outros métodos, como registros eletrofisiológicos locais ou abordagens de imagem, podem ser realizados para seguir padrões de atividade em áreas cerebrais definidas.

Após o redesenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo do sono humano explorarem como as atividades neurais e cardíacas são organizadas nos diferentes estágios do sono em pessoas com sono saudável e em pacientes com distúrbios do sono. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como pontuar e analisar o sono não REM retrospectivamente com base na reatividade comportamental do camundongo adormecido a um estímulo acústico.