Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

O objetivo geral deste experimento é utilizar a tomografia de coerência óptica ou OCT para obter rapidamente uma avaliação precisa da espessura da retina. A OCT pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da oftalmologia, como neuropatia óptica. A principal vantagem desta técnica é ser um método não invasivo para detectar alterações estruturais nas células ganglionares da retina de camundongos.

Essa técnica é realmente interessante porque é um método não invasivo, seguro e confiável para testar o efeito do tratamento na neuropatia óptica. Para começar, ajuste primeiro as configurações do braço de referência apropriadas para a lente. Em seguida, ligue a fonte de alimentação e o computador.

Quando o computador estiver pronto, inicie o programa de imagem. Crie um novo estudo clínico e adicione os protocolos desejados. Vá até a seção de exame do paciente e defina as configurações padrão do exame.

Clique em "adicionar paciente" na seção de exame do paciente para incluir um novo paciente e insira as informações relevantes do paciente. Em seguida, clique em "adicionar exame", "iniciar exame" e "adicionar exames predefinidos" da lista para selecionar o protocolo desejado, começando com o olho que será medido primeiro. Pelo menos 15 minutos antes da aquisição dos dados, instile gotas à temperatura ambiente de fenilefrina 10% em cada olho de todos os camundongos que serão testados.

Em seguida, remova o reagente em excesso e instile gotas de tropicamida 0,5% à temperatura ambiente. Aproximadamente cinco minutos antes da aquisição, induza anestesia geral. Imediatamente após, administre hidrocloreto de oxibuprocaina 0,4% em cada olho, deixando a solução em contato por três segundos para anestesiar e imobilizar os olhos.

Em seguida, remova as gotas e repita a aplicação de fenilefrina 10% e tropicamida 0,5%. Quando os olhos estiverem suficientemente dilatados para a aquisição de imagens, lubrifique-os com gotas oculares à base de glicol viscoso para manter a hidratação da córnea e enrole o camundongo em uma folha de gaze cirúrgica para mantê-lo aquecido. Usando uma esponja ou pavio de algodão, aplique uma fina camada de gel oftálmico suplementado com hipromelose 0,3% sobre cada olho.

Ao fazer isso, separe as pestanas e os bigodes. Posicione o camundongo na cassete com a cabeça reta e voltada para frente e coloque cuidadosamente a barra de mordida em sua boca. Coloque um rolo de algodão sob o lado do animal correspondente ao olho que está sendo examinado.

Em seguida, mantendo a ponta de mira do clipe sobre a lente específica do mouse, gire o parafuso do tradutor z no sentido anti-horário para aproximar a lente do olho. Pré-ajuste a posição do mouse girando e movendo o cassete e ajustando a barra de mordida e os parafusos do tradutor x até que o olho experimental esteja posicionado para olhar diretamente para dentro da lente. Quando o eixo óptico dos olhos e da lente estiverem alinhados, selecione o primeiro exame no scan.

Clique em iniciar a mira e use o parafuso do tradutor z para mover a retina verticalmente no painel esquerdo e horizontalmente no painel direito. Ao girar a cassete, mova o disco óptico para cima ou para baixo para posicioná-lo no centro do painel direito. Use o parafuso da barra de mordida para alinhar a retina dentro do painel direito e gire a cassete para posicionar o disco óptico no centro do painel esquerdo.

Em seguida, utilize o parafuso x-translator para nivelar a retina dentro do painel esquerdo e, levando em consideração a função principal de cada modulador, ajuste ainda mais a posição da retina para uma centralização perfeita sobre o disco óptico. Quando a retina estiver posicionada, clique em iniciar captura para começar a varredura de tomografia de coerência óptica no domínio espectral. Não se esqueça de salvar a varredura e o relatório.

Ajuste a centralização, se necessário. Quando a varredura estiver concluída, recolha a lente e posicione o segundo olho conforme demonstrado anteriormente. Após a varredura do segundo olho, remova o camundongo da cassete, aplique gel oftálmico com hipromelose a 0,3% em cada olho e coloque o camundongo em uma placa aquecida com monitoramento até a recuperação completa.

Para focar nas células ganglionares da retina, utilize a macro da ferramenta MRI retina criada para o ImageJ. Abra a ferramenta MRI retina, modifique a ferramenta de seleção de polígono e carregue a imagem de interesse. Clique em M para iniciar a medição, depois clique em E para ajustar a posição horizontal. Selecione o primeiro cassete na nova janela do gerenciador de regiões de interesse que foi aberta.

Clique no polígono azul e clique nas bordas da camada medida na imagem para ajustar a posição da primeira cassete. Selecione a segunda cassete na janela do gerenciador de regiões de interesse e ajuste a segunda cassete. Em seguida, clique em R para refazer a medição da retina e visualizar os resultados na janela de medições.

Embora a qualidade de uma varredura de OCT no domínio espectral não seja tão boa quanto a de uma imagem de uma seção transversal da retina, a OCT permite visualizar mais camadas. As camadas da retina são facilmente medidas em uma varredura de OCT e incluem a camada de fibras nervosas da retina, camada de células ganglionares, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada nuclear externa, camadas de segmento interno e externo, epitélio pigmentar da retina e coroide, permitindo um estudo complexo de toda a retina. A medição da espessura da retina por OCT é apenas demonstrada, indicando que camundongos fêmeas geneticamente mutantes OPA1 com deficiência visual exibem um espessamento progressivo do complexo de células ganglionares e das camadas de fibras nervosas da retina peripapilar.

Uma comparação da espessura da camada de fibras nervosas da retina na camada de células ganglionares, utilizando paquímetros padrão e caseiros, demonstra que os paquímetros padrão medem uma espessura significativamente menor do que os paquímetros caseiros, pois os paquímetros padrão são muito mais espessos e mais difíceis de posicionar sobre uma borda de camada fina. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 15 minutos, se executada corretamente. Após seu desenvolvimento, a OCT abriu caminho para que pesquisadores na área de oftalmologia analisassem alterações estruturais na retina de camundongos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar e analisar a imagem de OCT para células ganglionares da retina em camundongos.