Name: PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda o ensaio PIP-on-a-chip para avaliar interações proteína-membrana sem rótulos usando plataforma microfluídica. Este método oferece alternativa biologicamente relevante para técnicas tradicionais com detergentes.

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DS e CEC foram apoiados, em parte, pela concessão AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC foram apoiados pela concessão N00014-14-1-0792 (ONR).

Os autores não têm nada a revelar.

Cada variante PIP, embora com baixas concentrações, está presente na superfície citosólica de organelas específicas, onde contribuem para o estabelecimento de uma composição física única e especificidade funcional da membrana organelar 1 . Um dos usos mais importantes dos PIPs é como uma plataforma de encaixe específica para a multiplicidade de proteínas que requerem localização e / ou ativação subcelular específica 6 , 7 . Devido ao seu ...

Inúmeras interacções e processos bioquímicos ocorrem em superfícies de membranas fluidas de duas dimensões. Os organelos fechados em membrana em células eucarióticas são únicos, não apenas nos processos bioquímicos e seu proteoma associado, mas também na sua composição lipídica. Uma classe excepcional de fosfolípidos é fosfoinositides (PIPs). Embora constituam apenas 1% do lipidoma celular, eles desempenham um papel crucial na transdução de sinal, autofagia e tráfico de membrana, entre outros 1 , 2 , 3 , 4 . A fosforilação dinâmica do grupo de cabeça de inositol pelas quinases PIP celulares dá origem a sete grupos principais PIP que são mono-, bis- ou trisfosforilados 5 . Além disso, os PIPs definem a identidade subcelular das membranas e servem como locais de encaixe de membrana especializados para proteínas / enzimas contendo um ou mais fosfoinosDomínios de vinculação, por exemplo, Pleopstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) e epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Um dos domínios de ligação ao PIP mais bem estudados é o da fosfolipase C (PLC) domínio PH -δ1 que interage especificamente com fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) dentro de uma gama micromolar nanomolar de baixa afinidade elevada 8 , 9, 10, 11. Uma variedade de métodos in vitro qualitativos e quantitativos foram desenvolvidos e utilizados para estudar o mecanismo, termodinâmica e especificidade dessas interações. Entre os ensaios de ligação a PIP mais utilizados são a ressonância de plasmão de superfície (SPR), a calorimetria isotérmica (ITC), a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), o ensaio de flotação / sedimentação de lipossomas e transferências de lipidos (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Embora estes sejam amplamente utilizados, todos eles têm muitas desvantagens. Por exemplo, SPR, ITC e RMN requerem grandes quantidades de amostras, instrumentação cara e / ou pessoal treinado 12 , 13 . Alguns formatos de ensaio, tais como tampões lipídicos baseados em anticorpos, utilizam formas solúveis em água de PIPs e os apresentam de maneira não fisiológica 12 , 14 , 15 , 16 . Além disso, as transferências de lípidos não podem ser quantificadas de forma confiável e muitas vezes resultaram em observações falsas positivas / negativas 12 , 17 , 18 . Para superar esses desafios e melhorar o conjunto de ferramentas atual, um novo método livre de etiqueta foi estabelecido com base em uma bicamada lipídica suportada (SLB) no contexto de am<html> Plataforma icrofluidica, que foi aplicada com sucesso no estudo das interações proteína-PIP ( Figura 1 ) 19 . A estratégia empregada para detectar interações proteína-PIP é baseada na detecção de modulação de pH. Isto envolve um corante sensível ao pH que tem orto- Sifforodamina B ( o SRB) diretamente conjugado com o grupo de cabeça lipídica de fosfatidiletanolamina 20 . A sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) é altamente fluorescente a um pH baixo e extinguiu-se a pH elevado com um pKa dentro de cerca de 6,7 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo (Figura 5B). O domínio PLC-δ1 PH tem sido amplamente utilizado para validar as metodologias de ligação à proteína-PIP devido à sua alta especificidade em relação a PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,&quot;23 , 24 , 25. Assim, argumentamos que o domínio PH do PLC-δ1 pode ser usado para testar sua ligação ao PI (4,5) P 2 através do ensaio PIP-on-a-chip. A construção do domínio PH utilizado no presente estudo tem uma carga global positiva (pI 8,4), e, assim, atrai OH -. iões (Figura 5C) após ligação a PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo, o domínio PH traz as OH - iões para o superfície da membrana, que por sua vez modula o potencial interfacial e muda o estado de protonação do SRB-PAPA (Figura 5C) 26. Como uma função da concentração de domínio PH, a fluorescência é extinta (figura 6A). Finalmente, os dados normalizados é ajustar a uma isotérmica de ligação para determinar a afinidade do domínio PH-PI (4,5) P 2 interacção (Figura 6B, 6C). &lt;/ P&gt; Neste estudo, um protocolo detalhado é fornecido para realizar a ligação de proteínas aos SLBs contendo PIP dentro de uma plataforma microfluídica. Este protocolo leva o leitor a montar o dispositivo microfluídico e a preparação da vesícula para a formação de SLB e ligação de proteínas. Além disso, instruções para a análise de dados para extrair a informação de afinidade para o domínio PI-PLC-δ1 PH (4,5) P 2 interacção são fornecidos.

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverwashs: Retângulos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Solução de Limpeza de Vidro Borosilicato</td></tr><tr><td>7X</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>PYREX Prato de Cristalização Corning</td><td></td><td>3140-190</td><td>Prato de vidro borossilicato com fundo plano; Diâmetro x Altura (190 x 100 mm); Distribuidor: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Forno</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsiloxano (PDMS); Distribuidor: Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Dessecador</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td>Punção de biópsia com classificação de vácuo</td></tr><tr><td></td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; 1,0 mm de diâmetro; Punção de Biópsia Miltex com Êmbolo (Cat. No. 15110-10) pode ser usado como uma alternativa</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Sistema de limpeza</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>Bomba de vácuo de óleo de acionamento direto de 2 estágios, Serviço O2 (Krytox Charged)</td></tr><tr><td>Digital Hot Plate</td><td>Benchmark</td><td>H3760-H</td><td>Adquirido através da Denville Scientific (Cat. N.º 1005640)</td></tr><tr><td>Microcorrediças foscas</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Fosco, selecionado e pré-limpo; Feito de vidro suíço; Espessura: 1 mm; Dimensões: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Software de desenho para o design de</td></tr><tr><td>photomask</td><td>Photomask CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>O design com fundo preto e características claras foi impresso em resolução de 20k dpi em uma máscara transparente (5 x 7 pol) pela CAD/Art Services</td></tr><tr><td>Wafers de Silicone</td><td>University Wafer</td><td>1575</td><td>Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 polegadas) de diâmetro; 525 um de espessura</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Fotorresistente de tom negativo; Propriedade da instalação de nanofabricação do estado da Pensilvânia</td></tr><tr><td>SU-8 Desenvolvedor</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N / A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Propriedade</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td>POPE; Necessário para a síntese de oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamina Rodamina B Cloreto de Sulfonila (isômeros mistos)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>Necessário para a síntese de sonda lipídica fluorescente sensível ao pH oSRB-POPE</td></tr><tr><td>(oSRB-POPE)</td>Síntese <td>interna</td><td>N/A</td> interna <td>(Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Frasco de cintilação de vidro</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>Capacidade de volume de 20 mL</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>Membranas</td><td>ultrassônicas</td>de <td></td></tr><tr><td>nucleporo de banho-maria</td> VWR N/A <td>Membrana</td> de policarbonato <td>Whatman 110605</td><td>; Diâmetro: 25 mm; Tamanho dos poros: 0,1 um; Distribuidor: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora LIPEX de grau HPLC</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Extrusora Thermobarrel</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Espalhamento de Luz Dinâmico; Propriedade da Instalação de Cristalografia de Raios-X da Penn State</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Análise de dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v.6</td><td>Software de ajuste de curvas para análise de dados</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Microscópio de Epifluorescência</td><td>Carl Zeiss Microscopia N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm Câmera</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>Câmera N/A</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Fonte de Luz</td></tr><tr><td>Alexa 568 Conjunto de Filtros</td><td>Carl Zeiss Microscopia N</td><td>/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td> N<td>/A</td><td>Software de Processamento de Imagem</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td> Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Outros</td>Pontas VWR 10034-132 Ponteiras de pipeta de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>200 uL; Ponta fina e lisa para aplicar a solução proteica no canal microfluídico</td></tr><tr><td>Pontas</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 uL ponteiras de pipeta; Ponta fina e lisa para aplicar a solução de vesícula no canal microfluídico</td></tr><tr><td>Medidor de pH Orion Star A321</td> Medidor <td>de</td><td>pH</td>STARA3210 <td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Micro sonda de pH Orion Micro sonda de pH</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>micro Sonda</td></tr><tr><td>de pH N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfónico)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES,</td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td> de ácido livre <td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tubulação</td><td>Allied Wire & Cabo</td><td>TFT-200-24 N</td><td>Diâmetro interno: 0,020-0,026 polegadas (0,051-0,066 cm); Espessura da parede: 0,010 polegadas (0,025 cm); Tubulação flexível de parede fina de politetrafluoretileno; Gás nitrogênio de cor natural</td></tr><tr><td>- Industrial</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fornecedor local</td></tr><tr><td>Gás oxigênio -</td><td>Industrial Praxair</td><td>N/A</td><td>Fornecedor local Nitrogênio</td></tr><tr><td>líquido</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fornecedor local</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de interações proteína-fosfoinositide

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerosas proteínas celulares interagem com superfícies de membrana para afetar processos celulares essenciais. Essas interações podem ser direcionadas para um componente lipídico específico dentro de uma membrana, como no caso de fosfoinositidos (PIPs), para garantir a localização e / ou ativação subcelular específica. PIPs e domínios de ligação celular PIP foram estudados extensivamente para entender melhor seu papel na fisiologia celular. Aplicamos um teste de modulação de pH em bicamadas lipídicas (SLBs) suportadas como uma ferramenta para estudar interações proteína-PIP. Nestes estudos, a fosfatidiletanolamina conjugada orto- Sulforododina B, utilizada para o pH, é utilizada para detectar interações proteína-PIP. Após a ligação de uma proteína a uma superfície de membrana contendo PIP, o potencial interfacial é modulado ( isto é, mudança no pH local), deslocando o estado de protonação da sonda. Um estudo de caso do uso bem sucedido do ensaio de modulação de pH é apresentado usando fosfolipase C delta1 PleckstrNo domínio da Homologia (PLC-δ1 PH) e da fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) como exemplo. A constante de dissociação aparente ( K d, app ) para essa interação foi de 0,39 ± 0,05 μM, semelhante a K d, valores de aplicativos obtidos por outros. Como observado anteriormente, o domínio PH de PLC-δ1 é PI (4,5) P 2 específico, mostra fraca ligação no sentido de fosfatidilinositol-4 fosfato, e nenhuma ligação a SLBS fosfatidilcolina pura. O ensaio PIP-on-a-chip é vantajoso em relação aos ensaios tradicionais de ligação a PIP, incluindo, mas não limitado a, baixo volume de amostra e nenhum requerimento de marcação de ligando / receptor, a capacidade de testar interações de membrana de alta e baixa afinidade com pequenas e pequenas Grandes moléculas e uma relação sinal / ruído melhorada. Consequentemente, o uso da abordagem PIP-on-a-chip facilitará a elucidação de mecanismos de uma ampla gama de interações de membrana. Além disso, este método poderia ser potencialmente vocêNa identificação de terapias que modulam a capacidade da proteína para interagir com as membranas.

Utilizou-se o ensaio de modulação pH para estudar o PLC-δ1 PH domínio de PI (4,5) P 2 interacção dentro de um microdispositivo de PIP-on-a-chip (Figura 1). Através de um protocolo detalhado, demonstramos como preparar e montar componentes de dispositivos microfluídicos, fazer pequenas vesículas unilamelares (SUVs) ( Figura 2 ), formar SLBs dentro de um dispositivo ( Figura 3 ) e testar a ...

Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

O objetivo geral do ensaio PIP-on-a-chip é avaliar as interações da membrana proteica de maneira quantitativa sem marcadores. As interações da membrana proteica são o coração de muitos processos da célula e seus patógenos, mas as técnicas para estudar essas interações são poucas. As vantagens desta técnica são baixo volume simples, sem requisitos de marcação de ligantes ou receptores combinados com a capacidade de testar as interações da membrana de maneira fisiologicamente relevante.Muitos alvos terapêuticos de vírus são proteínas de membrana, estudos dessas proteínas-alvo são frequentemente realizados em solução usando detergentes. Nossa técnica fornece uma alternativa mais biologicamente relevante. Embora você veja que este ensaio é capaz de monitorar as interações de proteínas com membranas, na verdade é um ensaio bastante versátil e pode ser usado para monitorar membranas de ferro, membranas de moléculas pequenas e até interações de membranas peptídicas.Para começar, misture o polidimetilsiloxano ou o pré-polímero PDMS e o agente de cura na proporção de 10:1, em um grande barco de pesagem de plástico. Desgaseifique a mistura no vácuo por uma hora com a força de vácuo em 500 tor ou menos. Coloque o mestre de silício que contém várias réplicas do mesmo micropadrão SU8 em um grande barco de pesagem de plástico e despeje o PDMS de desgaseificação e, em seguida, cure-o em um forno seco a 60 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, retire suavemente o PDMS do mestre de silício usando as mãos. Marque os limites de cada micro padrão em retângulos usando um bisturi cirúrgico e uma régua. Em seguida, corte o PDMS em blocos, faça 16 furos em ambas as extremidades de cada microcanal com um punção de biópsia, para fazer furos com 1,0 milímetro de diâmetro.A pipeta calculou volumes de fosfatidilcolina, fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato e sonda fluorescente sensível ao pH em um único frasco de ventilação de vidro de 20 mililitros. Secar a mistura numa corrente de azotogénio no interior da hotte química durante 10 minutos ou até que o solvente evapore e se forme uma fina película lipídica no fundo do frasco. Em seguida, dessece a mistura sob vácuo por pelo menos três horas a uma força de vácuo de 10 militor para remover qualquer solvente orgânico residual.Reidrate o filme lipídico seco com cinco mililitros de tampão de corrida, coloque o lipídio reidratado em um banho ultrassônico a uma frequência de operação de 35 kilohertz por 30 minutos em temperatura ambiente. Congele e descongele a suspensão da vesícula com nitrogênio líquido e o banho-maria de 40 graus Celsius para obter vesículas unilaminares. Repita o congelamento e descongelamento 10 vezes, extrude a suspensão da vesícula para uma membrana de policarbonato de borda de 0,1 mícron, usando uma extrusora de lipídios para enriquecer pequenas vesículas unilaminares.Repita a extrusão 10 vezes. Teste as entradas e saídas do bloco PDMS quanto a bloqueios esguichando água desionizada através dos orifícios usando uma garrafa de lavagem com água e, em seguida, seque o bloco PDMS com gás nitrogênio. Em seguida, coloque o bloco PDMS e a lamínula pré-limpa dentro da câmara de amostra do sistema de plasma de oxigênio.Exponha o bloco PDMS e a lamínula com plasma de oxigênio por 45 segundos com as configurações de potência em 75 watts, velocidade do fluxo de oxigênio em 10 centímetros cúbicos por minuto e a força de vácuo de 200 militor. Em seguida, coloque a superfície padrão do bloco PDMS em contato com a lamínula imediatamente após o tratamento com plasma de oxigênio. Pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar nos locais de contato.Coloque o dispositivo em uma placa de aquecimento nivelada a 100 graus Celsius por três minutos para melhorar a colagem. Use um pano úmido sem fiapos com 100% de etanol para remover quaisquer partículas de poeira da parte superior e inferior do dispositivo. Em seguida, prenda o dispositivo em cima de uma lâmina de microscópio de vidro.Transfira 100 microlitros de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato contendo pequenas vesículas unilaminares para um tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitro. Ajuste o pH da solução para aproximadamente 3/2 adicionando 6,4 microlitros de ácido clorídrico 0,2 normal. Pipete 10 microlitros da solução de vesícula unilaminar pequena com pH ajustado em cada canal através da entrada e aplique pressão através da pipeta até que a solução atinja a saída.Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo. Depois de repetir esta etapa para cada canal, incube o dispositivo por 10 minutos em temperatura ambiente, a injeção de vesículas em microcanais deve ser realizada imediatamente após a montagem do dispositivo. Enquanto isso, corte conjuntos de tubos de entrada e saída, usando uma pinça, conecte o conjunto de tubos de saída ao dispositivo e, em seguida, prenda o dispositivo em um microscópio stage.Mergulhe uma extremidade do conjunto de tubos de entrada em 25 mililitros de buffer de corrida contido em um tubo cônico e prenda-o com fita adesiva para garantir que o tubo esteja preso. Usando um macaco de laboratório, coloque o tubo cônico em um terreno mais alto do que o dispositivo para empurrar a solução através dos microcanais por meio do fluxo de gravidade. Para cada tubo de entrada, use uma seringa para extrair um mililitro de tampão de corrida da extremidade livre do tubo.Remova a ponta da pipeta da entrada e insira a extremidade livre do tubo de entrada no dispositivo. Repita este processo para conectar todas as peças da tubulação de entrada ao dispositivo. O fluxo do tampão de corrida através dos canais ajuda a remover o excesso de vesículas não rompidas e equilibrar a bicamada em condições experimentais.Em seguida, abra o software de controle do microscópio. No painel esquerdo, clique na guia microscópio e escolha a objetiva 10x. Clique ao vivo e, em seguida, nos ícones de imagem do Alexa 568 na barra de ferramentas, usando os botões de ajuste fino e grosso, concentre-se nos micro canais.Examine o dispositivo para verificar a qualidade dos SLBs e dos canais. Em seguida, clique no ícone de imagem fechada do obturador FL na barra de ferramentas, clique na guia de aquisição e, em ajustes básicos, selecione o tempo de exposição. Defina o tempo de exposição para 200 milissegundos.No painel esquerdo, clique em aquisição multidimensional. No menu de filtros, selecione o canal vermelho. Em seguida, clique no menu de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para cinco minutos, a duração para 30 minutos e o menu de lapso.Selecione a ferramenta círculo na guia de medida e desenhe um círculo em qualquer canal. Clique com o botão direito do mouse enquanto o círculo estiver selecionado e escolha propriedades. Na guia perfil, marque todos os T para visualizar a intensidade da fluorescência em função do tempo.Certifique-se de que esta curva atinja um platô que indique equilíbrio antes de prosseguir para a próxima etapa, abaixe a solução tampão para um solo igual ao do dispositivo, para interromper o fluxo. Um de cada vez, retire cada tubo de saída e aplique 200 microlitros de cada diluição de proteína no canal de saída usando uma pipeta. Não aplique nenhuma pressão, deixe a gravidade fazer o trabalho.Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo microfluídico. Repita esse processo para cada canal e certifique-se de que bolhas de ar não sejam introduzidas nos canais durante esse processo. Em seguida, abaixe o tubo de entrada para um solo abaixo do dispositivo microfluídico para começar a fluir a proteína através dos microcanais.Cole a extremidade livre do tubo em um recipiente de resíduos. Fluir as diluições do domínio de homologia pleckstrin por 30 minutos. No painel esquerdo do software, na guia timelapse, clique em iniciar para iniciar a imagem novamente.Aqui é mostrada uma visão representativa do fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato contendo SLBs dentro de microcanais. Antes e depois, adicionando o domínio de homologia pleckstrin nas concentrações indicadas. As intensidades de fluorescência da linha escaneada através de microcanais são plotadas em função da distância e pixels para experimentos de ligação de fosfatidilcolina, fosfato de fosfatidilinositol 4 e fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato.Em seguida, normalizar os dados de ligação de experimentos individuais, é plotado em função da concentração do domínio de homologia da fosfolipase C delta 1 pleckstrin e ajustado a um isotermo de ligação para extrair constantes de associação aparentes. A comparação das constantes de associação aparentes mostra que o domínio de homologia da pleckstrina da fosfolipase C Delta 1 interage com o fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato especificamente, como esperado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer pequenas vesículas unilaminares, fazer dispositivos microfluídicos, formar bicamadas lipídicas suportadas dentro desses dispositivos microfluídicos, como suas interações de ligação à membrana proteica, usando este ensaio com nossa abordagem PIP-on-a-chip.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como a recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento podem ser realizados para avaliar o efeito da ligação da membrana proteica na difusão lateral dos lipídios. Esta técnica abre caminho para estudar as interações da membrana proteica com a montagem de lipídios encontrados nas células, em vez de um de cada vez, esta abordagem terá, portanto, um amplo impacto na bioquímica e na biologia celular das interações da membrana proteica.

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.

Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

PI (4,5) P 2 regula várias funções celulares, mas a sua organização em nanoescala na membrana plasmática da célula é mal compreendida. Por rotulagem PI (4,5) P 2 com uma sonda fluorescente de duas cores fundido com o domínio de homologia plecstrina, descrevemos uma nova abordagem para estudar o PI (4,5) P 2 em distribuição espacial da membrana plasmática em escala nanométrica .

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Aqui, apresentamos um protocolo para o enriquecimento de fosfatrofames fosfoproteínas e suas proteínas interativas a partir de células e tecidos e sua identificação e quantificação por proteômica baseada em espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

Uma nova abordagem que permite a resolução de alta análise das interações de células de câncer com ácido hialurônico exógeno (HA) é descrita. Superfícies padronizadas são fabricados através da combinação química carbodiimida e impressão microcontact.

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

A espectroscopia Raman é uma técnica adequada para o contato não, rótulo sem análise de células vivas, tecidos engenharia de construções e tecidos nativos. Fonte específicos impressões digitais espectrais podem ser gerados e analisados ​​utilizando análise multivariada.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Aprenda o ensaio PIP-on-a-chip para avaliar interações proteína-membrana sem rótulos usando plataforma microfluídica. Este método oferece alternativa biologicamente relevante para técnicas tradicionais com detergentes.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

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