PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

O objetivo geral do ensaio PIP-on-a-chip é avaliar as interações da membrana proteica de maneira quantitativa sem marcadores. As interações da membrana proteica são o coração de muitos processos da célula e seus patógenos, mas as técnicas para estudar essas interações são poucas. As vantagens desta técnica são baixo volume simples, sem requisitos de marcação de ligantes ou receptores combinados com a capacidade de testar as interações da membrana de maneira fisiologicamente relevante.

Muitos alvos terapêuticos de vírus são proteínas de membrana, estudos dessas proteínas-alvo são frequentemente realizados em solução usando detergentes. Nossa técnica fornece uma alternativa mais biologicamente relevante. Embora você veja que este ensaio é capaz de monitorar as interações de proteínas com membranas, na verdade é um ensaio bastante versátil e pode ser usado para monitorar membranas de ferro, membranas de moléculas pequenas e até interações de membranas peptídicas.

Para começar, misture o polidimetilsiloxano ou o pré-polímero PDMS e o agente de cura na proporção de 10:1, em um grande barco de pesagem de plástico. Desgaseifique a mistura no vácuo por uma hora com a força de vácuo em 500 tor ou menos. Coloque o mestre de silício que contém várias réplicas do mesmo micropadrão SU8 em um grande barco de pesagem de plástico e despeje o PDMS de desgaseificação e, em seguida, cure-o em um forno seco a 60 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, retire suavemente o PDMS do mestre de silício usando as mãos. Marque os limites de cada micro padrão em retângulos usando um bisturi cirúrgico e uma régua. Em seguida, corte o PDMS em blocos, faça 16 furos em ambas as extremidades de cada microcanal com um punção de biópsia, para fazer furos com 1,0 milímetro de diâmetro.

A pipeta calculou volumes de fosfatidilcolina, fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato e sonda fluorescente sensível ao pH em um único frasco de ventilação de vidro de 20 mililitros. Secar a mistura numa corrente de azotogénio no interior da hotte química durante 10 minutos ou até que o solvente evapore e se forme uma fina película lipídica no fundo do frasco. Em seguida, dessece a mistura sob vácuo por pelo menos três horas a uma força de vácuo de 10 militor para remover qualquer solvente orgânico residual.

Reidrate o filme lipídico seco com cinco mililitros de tampão de corrida, coloque o lipídio reidratado em um banho ultrassônico a uma frequência de operação de 35 kilohertz por 30 minutos em temperatura ambiente. Congele e descongele a suspensão da vesícula com nitrogênio líquido e o banho-maria de 40 graus Celsius para obter vesículas unilaminares. Repita o congelamento e descongelamento 10 vezes, extrude a suspensão da vesícula para uma membrana de policarbonato de borda de 0,1 mícron, usando uma extrusora de lipídios para enriquecer pequenas vesículas unilaminares.

Repita a extrusão 10 vezes. Teste as entradas e saídas do bloco PDMS quanto a bloqueios esguichando água desionizada através dos orifícios usando uma garrafa de lavagem com água e, em seguida, seque o bloco PDMS com gás nitrogênio. Em seguida, coloque o bloco PDMS e a lamínula pré-limpa dentro da câmara de amostra do sistema de plasma de oxigênio.

Exponha o bloco PDMS e a lamínula com plasma de oxigênio por 45 segundos com as configurações de potência em 75 watts, velocidade do fluxo de oxigênio em 10 centímetros cúbicos por minuto e a força de vácuo de 200 militor. Em seguida, coloque a superfície padrão do bloco PDMS em contato com a lamínula imediatamente após o tratamento com plasma de oxigênio. Pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar nos locais de contato.

Coloque o dispositivo em uma placa de aquecimento nivelada a 100 graus Celsius por três minutos para melhorar a colagem. Use um pano úmido sem fiapos com 100% de etanol para remover quaisquer partículas de poeira da parte superior e inferior do dispositivo. Em seguida, prenda o dispositivo em cima de uma lâmina de microscópio de vidro.

Transfira 100 microlitros de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato contendo pequenas vesículas unilaminares para um tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitro. Ajuste o pH da solução para aproximadamente 3/2 adicionando 6,4 microlitros de ácido clorídrico 0,2 normal. Pipete 10 microlitros da solução de vesícula unilaminar pequena com pH ajustado em cada canal através da entrada e aplique pressão através da pipeta até que a solução atinja a saída.

Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo. Depois de repetir esta etapa para cada canal, incube o dispositivo por 10 minutos em temperatura ambiente, a injeção de vesículas em microcanais deve ser realizada imediatamente após a montagem do dispositivo. Enquanto isso, corte conjuntos de tubos de entrada e saída, usando uma pinça, conecte o conjunto de tubos de saída ao dispositivo e, em seguida, prenda o dispositivo em um microscópio stage.

Mergulhe uma extremidade do conjunto de tubos de entrada em 25 mililitros de buffer de corrida contido em um tubo cônico e prenda-o com fita adesiva para garantir que o tubo esteja preso. Usando um macaco de laboratório, coloque o tubo cônico em um terreno mais alto do que o dispositivo para empurrar a solução através dos microcanais por meio do fluxo de gravidade. Para cada tubo de entrada, use uma seringa para extrair um mililitro de tampão de corrida da extremidade livre do tubo.

Remova a ponta da pipeta da entrada e insira a extremidade livre do tubo de entrada no dispositivo. Repita este processo para conectar todas as peças da tubulação de entrada ao dispositivo. O fluxo do tampão de corrida através dos canais ajuda a remover o excesso de vesículas não rompidas e equilibrar a bicamada em condições experimentais.

Em seguida, abra o software de controle do microscópio. No painel esquerdo, clique na guia microscópio e escolha a objetiva 10x. Clique ao vivo e, em seguida, nos ícones de imagem do Alexa 568 na barra de ferramentas, usando os botões de ajuste fino e grosso, concentre-se nos micro canais.

Examine o dispositivo para verificar a qualidade dos SLBs e dos canais. Em seguida, clique no ícone de imagem fechada do obturador FL na barra de ferramentas, clique na guia de aquisição e, em ajustes básicos, selecione o tempo de exposição. Defina o tempo de exposição para 200 milissegundos.

No painel esquerdo, clique em aquisição multidimensional. No menu de filtros, selecione o canal vermelho. Em seguida, clique no menu de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para cinco minutos, a duração para 30 minutos e o menu de lapso.

Selecione a ferramenta círculo na guia de medida e desenhe um círculo em qualquer canal. Clique com o botão direito do mouse enquanto o círculo estiver selecionado e escolha propriedades. Na guia perfil, marque todos os T para visualizar a intensidade da fluorescência em função do tempo.

Certifique-se de que esta curva atinja um platô que indique equilíbrio antes de prosseguir para a próxima etapa, abaixe a solução tampão para um solo igual ao do dispositivo, para interromper o fluxo. Um de cada vez, retire cada tubo de saída e aplique 200 microlitros de cada diluição de proteína no canal de saída usando uma pipeta. Não aplique nenhuma pressão, deixe a gravidade fazer o trabalho.

Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo microfluídico. Repita esse processo para cada canal e certifique-se de que bolhas de ar não sejam introduzidas nos canais durante esse processo. Em seguida, abaixe o tubo de entrada para um solo abaixo do dispositivo microfluídico para começar a fluir a proteína através dos microcanais.

Cole a extremidade livre do tubo em um recipiente de resíduos. Fluir as diluições do domínio de homologia pleckstrin por 30 minutos. No painel esquerdo do software, na guia timelapse, clique em iniciar para iniciar a imagem novamente.

Aqui é mostrada uma visão representativa do fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato contendo SLBs dentro de microcanais. Antes e depois, adicionando o domínio de homologia pleckstrin nas concentrações indicadas. As intensidades de fluorescência da linha escaneada através de microcanais são plotadas em função da distância e pixels para experimentos de ligação de fosfatidilcolina, fosfato de fosfatidilinositol 4 e fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato.

Em seguida, normalizar os dados de ligação de experimentos individuais, é plotado em função da concentração do domínio de homologia da fosfolipase C delta 1 pleckstrin e ajustado a um isotermo de ligação para extrair constantes de associação aparentes. A comparação das constantes de associação aparentes mostra que o domínio de homologia da pleckstrina da fosfolipase C Delta 1 interage com o fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato especificamente, como esperado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer pequenas vesículas unilaminares, fazer dispositivos microfluídicos, formar bicamadas lipídicas suportadas dentro desses dispositivos microfluídicos, como suas interações de ligação à membrana proteica, usando este ensaio com nossa abordagem PIP-on-a-chip.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como a recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento podem ser realizados para avaliar o efeito da ligação da membrana proteica na difusão lateral dos lipídios. Esta técnica abre caminho para estudar as interações da membrana proteica com a montagem de lipídios encontrados nas células, em vez de um de cada vez, esta abordagem terá, portanto, um amplo impacto na bioquímica e na biologia celular das interações da membrana proteica.