Análise do Gap Junction-dependente Transferência de miARN com 3D-FRAP Microscopia

O objetivo geral deste procedimento é investigar a transferência dependente de junções comunicantes de microRNA em cardiomiócitos vivos. Este método pode ajudar a abordar o papel do micro RNA para o sistema de transação de sinal intercelular. A principal vantagem desta técnica é que a troca de junção comunicante de micro RNA pode ser visualizada e quantificada em células vivas com alta resolução espaço-temporal.

Após isolar os cardiomiócitos de acordo com o protocolo de texto, colocar as células em placas de seis poços com densidade de três vezes 10 elevado à quinta célula por centímetro quadrado. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 0,5 tripzina às células e incube as culturas por cinco minutos para separar as células.

Inative a tripzina adicionando meio de cultura celular. Depois de contar as células, centrifugue-as a 300 vezes g por 10 minutos. Em seguida, use o tampão de eletroporação para ressuspender as células em quatro vezes 10 elevado à quinta célula por 100 microlitros.

Em seguida, misture 100 microlitros de suspensão celular com micro RNA fluorescente em um tubo e carregue a mistura em uma cubeta de eletroporação. Em seguida, execute a eletroporação usando o programa G009 no eletroporador. Adicione 500 microlitros de meio de cultura celular pré-aquecido e transfira todo o volume da suspensão celular para um poço de uma lâmina de fundo de vidro de quatro poços.

Cultive as células por um dia a 37 graus Celsius, em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Depois de pré-aquecer a incubadora do microscópio e ligar o sistema de fabricação, insira a lâmina da câmara no suporte de amostra do estágio. Use uma objetiva de óleo de 1,4 na e luz de excitação de laser de 561 nanômetros, em baixa potência de laser, com a faixa de detecção de 570 a 680 nanômetros para encontrar o cluster de cardiomiócitos transvectos.

Em seguida, no gerenciador de configuração, ative os botões z-stack, série temporal, branqueamento e regiões. Em seguida, para definir os parâmetros do frap, no menu do modo de aquisição, defina o tamanho do quadro para 512 por 512, o passo da linha para um e o tempo de varredura para menos de um segundo. No menu de canais, ajuste as configurações de potência, deslocamento e ganho do laser para obter fluorescência máxima da excitação mínima do laser, para evitar a saturação de intensidade.

Em seguida, defina o tamanho do orifício para dois micrômetros. Em seguida, no menu de regiões, selecione a ferramenta de desenho roy e use o cursor para marcar a célula de destino, a célula de referência e a área de fundo. Se necessário, selecione várias células-alvo para branqueamento de fotos.

No menu de branqueamento, ajuste as configurações de branqueamento de fotos. Em seguida, no menu z-stack, defina os limites para aquisição de z-stack, dependendo da espessura das células. Ajuste o número de camadas z para 12 tp 15 e, em seguida, inicie o experimento frap e registre a recuperação de fluorescência.

Para analisar os dados, crie a projeção máxima das pilhas z adquiridas usando um software específico do microscópio, clique em processamento, projeção de intensidade máxima, selecione o arquivo, aplique. Por fim, copie os dados de intensidade de fluorescência em todos os pontos de tempo do alvo, do plano de fundo e da célula de referência em uma planilha e execute a análise de dados de acordo com o protocolo de texto. Aqui são mostrados cardiomiócitos isolados com o padrão típico de alfa actinina estriada e grandes placas de conexina43, ao longo das bordas celular a celular.

Alguns não cardiomiócitos estavam presentes na cultura. Como visto aqui, por citometria de fluxo, uma eficiência de transvecção de 45% foi alcançada. Além disso, um ensaio de mortos-vivos revelou que a maioria das células demonstrou alta viabilidade, o que é importante ao analisar a comunicação da junção comunicativa.

Para a análise de frap, as células-alvo são selecionadas dentro de um aglomerado de células e são fotobranqueadas com 100% de potência do laser, levando à redução da fluorescência do micro RNA nas células selecionadas. A análise quantitativa e a normalização dos dados adquiridos mostraram uma recuperação média de 20% Neste experimento, o knockdown mediado por siRNA da conexina43, levou à redução da expressão proteica e à inibição da comunicação da junção comunicativa. A recuperação de fluorescência foi reduzida em mais de 50%, indicando que a eficiência da transferência de RNA miro é fortemente dependente do acoplamento de junção comunicante entre as células.

Esta figura mostra uma renderização de superfície 3D de um experimento frap. Em comparação com as projeções máximas, a aquisição de z-stacks pode ser usada para criar reconstruções 3D para investigar a localização e mobilidade do micro RNA dentro das células. Uma vez dominadas, as medições de frap podem ser feitas em duas a três horas se forem realizadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante escolher as células-alvo que tenham o mesmo número de células vizinhas. Além disso, meus parâmetros de branqueamento e condições de aquisição de imagem devem ser selecionados para evitar efeitos fototóxicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a microscopia frap, a fim de quantificar e visualizar o movimento do micro RNA dentro dos aglomerados celulares.