Name: Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de patch clamp em fatias cerebrais para analisar plasticidade sináptica induzida por aprendizagem em ratos treinados. Este método permite investigar mudanças nas propriedades celulares e sinápticas após treinamento motor e contextual.

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Gostaríamos de agradecer o Dr. pata-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin e Sra. H. Tsurutani por sua assistência técnica. Este projecto foi apoiado pelo Grants-in-Aid para jovens cientistas (H.K. e Y.S.), B de pesquisa científica (DM), C de investigação científica (DM) e a investigação científica em áreas inovadoras (DM), do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência, e Tecnologia do Japão.

todos os procedimentos cirúrgicos e alojamento dos animais estavam em conformidade com as orientações para o Animal experimentação de Yamaguchi University School of Medicine e foram aprovados pelo Comitê de uso de Yamaguchi e institucional Cuidado Animal Universidade.
 1. animais <ol><li>usar ratos Sprague-Dawley machos de 4 a 5 semanas de idade (pós-natal 28 a 31 dias de idade).</li>
	<li>De casa os ratos em gaiolas individuais de plástico (40 cm x 25 cm x 25 cm), mantidos a uma temperatura constante (23 ° C ± 1 ° C) sob um ciclo claro/escuro de 12-h. Dar ratos ad libitum acesso à água e alimentos.</li>
</ol> 2. Teste de vara de rotor <ol><li>para investigar a habilidade motora, aprendizagem, cada rato de assunto para o teste de haste do rotor (diâmetro da haste 7 cm; largura de faixa 8,9 cm; altura de queda 26,7 cm) por 1 ou 2 dias consecutivos ( figura 1A na Kida et al., 2016 7). Execute a tarefa em um quarto silencioso, com temperatura controlada (23 ± 1 ° C). Não perturbe ou lidar com ratos antes o teste</li>
	<li>Definir a haste do rotor para modo de aceleração, o que aumenta linearmente de 4 rotações/min a 40 rotações/min (8 π/min a 80 π/min) em 5 min.</li>
	<li>Colocar o rato na haste rotativa do descanso. Confirmar que todos os membros são barra.</li>
	<li>Medir a latência para cair da haste rotativa para avaliar o desempenho motor.</li>
	<li>Permitir que cada rato 10 tentativas (ensaios), com intervalos de 30-s.</li>
	<li>Se o rato cai da haste rotativa, configurá-lo na haste novamente após um intervalo de s de 10-20.</li>
	<li>Sacrificar o rato com uma overdose de pentobarbital (400 mg/kg) 30 min após o julgamento final. Injectar ratos destreinados controle com a mesma dose de anestesia em suas gaiolas casa.</li>
</ol> 3. Teste de evasão inibitório <ol><li>para investigar a aprendizagem contextual, assunto ratos a um teste de evasão inibitório (IA) ( Figura 1 na Mitsushima et al., 2011, 2013 10 , 11) Evite quaisquer experiências episódicas no dia do experimento tais como contato com os outros, mudanças de gaiola ou limpeza. Executar a tarefa em um quarto silencioso, com temperatura controlada (23 ± 1 ° C). 
	Nota: O aparelho de treinamento IA é uma caixa de acrílico com duas câmaras (comprimento 33 cm; largura 58 cm; altura 33 cm). Tem um lado iluminado e seguro e um lado escuro de choque que são separados por um alçapão ( Figura 1).</li>
	<li>Colocar o rato no lado seguro (lit) da caixa iluminada. Manipular o rato suavemente sem stress.</li>
	<li>Esperar de um curto período de tempo (10 a 20 s) para se aclimatar o rato para o ambiente.</li>
	<li>Abrir a porta de correr para permitir que o rato inserir a caixa escura à vontade.</li>
	<li>Medir a latência (s) antes do rato entra o novo lado escuro da caixa. A latência do primeiro julgamento representa o rato &#39; s desempenho antes do treino.</li>
	<li>Após a entrada no lado escuro, feche a porta e aplicar um choque de pé elétrica ovos mexidos (2 s, 1.6 mA) através de barras de aço elétricas situado no assoalho da caixa. Permitem que ratos Walk-through explorar os aparelhos de treino para 1 min sem ser chocado. Casa da marcação sem paridade ratos em uma gaiola de choque iluminado por vários dias e de repente, dê o choque sem experiências episódicas. Manipular suavemente sem estresse em qualquer grupo.</li>
	<li>Manter cada rato na caixa escura para 10 s antes de retorná-lo para a gaiola casa.</li>
	<li>Em 30 min após o choque de pé, coloque novamente o rato para o lado iluminado da caixa. Medir a latência para entrar do lado escuro.</li>
	<li>Retornar o rato da gaiola casa.</li>
	<li>Em 60 min após o choque, sacrificar o rato com uma overdose de pentobarbital (400 mg/kg). Manipular o rato delicadamente e injetar a anestesia intraperitonealmente. Em ratos controle destreinado, injetar a anestesia nas jaulas em casa sem a experiência descrita acima.</li>
</ol> 4. Buffer de dissecação <ol><li>dissolver os cristais de 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0,188 g KCl, 0,074 g de CaCl 2, 1,423 g MgCl 2-6 H 2 O e cloreto de colina 12,579 g em água ultrapura (900 mL para 950 mL) . Consulte a tabela 1.</li>
	<li>Dissolver os cristais de ácido ascórbico de 2,340 g, sal de sódio ácido pirúvico 0,342 g, 2,100 g NaHCO 3 e glicose 4,500 g.</li>
	<li>Adicionar água até 1000 mL. A escala de osmolalidade será entre 290 mOsm/L e 300 mOsm/L. Adjust osmolalidade adicionando água ultrapura, se é sobre a faixa de.</li>
	<li>Bolha a solução com 5% CO 2 / 95% O 2 gás mistura a temperaturas geladas por 5 min antes do uso.</li>
</ol> 5. Líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) <ol><li>dissolver cristais de 0,186 g KCl, 6,700 g NaCl e 0,156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O em água ultrapura (900 mL para 950 mL). Consulte a tabela 2.</li>
	<li>Bolha com a mistura de gás de 5 min.</li>
	<li>Dissolver os cristais de 1,800 g glicose e g 2,184 NaHCO 3 e em seguida, adicione 4 mL de MgCl 2 e 4 mL de CaCl 2 de 1m de estoque soluções.</li>
	<li>Adicionar água até 1000 mL. A escala de osmolalidade será entre 290 mOsm/L e 295 mOsm/L. Adjust osmolalidade adicionando água ultrapura, se é sobre a faixa de.</li>
	<li>Bolha com a prévia de mistura de gás usar.</li>
</ol> 6. Soluções intracelulares <ol><li>para gravações de corrente-braçadeira (tabela 3), dissolver 0,0746 g de KCl, solução em 180 mL de água ultrapura reserva 6,089 g K-gluconato, 0,476 g HEPES, g 0,0456 EGTA e 500 µ l de MgCl 2 de 1m (ajustar o pH para 7.2 com KOH).
	<ol><li>Adicionar o 0,4408 g at 2 - ATP, g 0,0418 at 3 - GTP e 0,510 g at-fosfocreatina. Adicionar água a 200 mL e ajustar o pH a 7,35 com KOH.</li>
		<li>Ajustar a osmolalidade de aproximadamente 290 mOsm/L, adicionando água ultrapura.</li>
		<li>Loja como alíquotas de 1 mL no congelador (-30 ° C).</li>
	</ol></li> <li>Para gravações de tensão-braçadeira (tabela 4), dissolver 5,244 g CsMeSO 3, g 0,672 CsCl, 0,476 g HEPES, g 0,0456 EGTA e 500 µ l de MgCl 2 de 1m de estoque soluções em 180 mL de água ultrapura. Ajuste o pH para 7.2 com CsOH. Para as gravações de mEPSP e mIPSP, use concentração modificada de 5,814 CsMeSO 3 e g 0,252 CsCl para ajustar o potencial de reversão do receptor GABA A resposta 11.
	<ol><li>Adicionar o 0,4408 g at 2 - ATP, g 0,0418 at 3 - GTP e 0,510 g at-fosfocreatina. Adicionar água a 200 mL e ajustar o pH a 7,35 com CsOH.</li>
		<li>Ajustar a osmolalidade de aproximadamente 290 mOsm/L, adicionando água ultrapura.</li>
		<li>Loja como alíquotas de 1 mL no congelador (-30 ° C).</li>
	</ol></li></ol> 7. Preparação de cortar <ol><li>prévio para sacrificar, arrefecimento todas as ferramentas de dissecação com gelo picado ( Figura 2A). Adicione cerca de 500ml de água fria no recipiente de gelo picado para aumentar a área de superfície de contato. Este procedimento foi descrito anteriormente de 10 , 11 , 12. 
	Nota: As ferramentas aqui são: grande tesoura, tesoura de íris, uma espátula, uma micro espátula, fórceps, pinças, um copo de 200 mL de aço inoxidável, uma lâmina para o cérebro, aparar, uma seringa de perfusão cardíaca 120 mL cheia de buffer de dissecação, tratado com a mistura de gases, uma tubo de silicone (20 cm) conectado a uma agulha de calibre 18 achatada, numa fase de dissecação do cérebro de aço inoxidável (espessura = 3 mm, ϕ = 12 cm) e uma fase de montagem para o vibratome (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Sacrificar o rato 30 min depois de completar o paradigma comportamental por anestesiá-lo com uma overdose de pentobarbital (400 mg/kg de peso corporal). Execute a preparação de fatia rapidamente para garantir que as fatias são tão saudáveis como possível 10 , 11 , 12. O cérebro extrProtocolo de ação cumpre todas as normas veterinárias para nossa Universidade.</li>
	<li>Encher uma seringa de 120 mL com tampão de dissecação gelada (tabela 1) borbulhava com 5% CO 2 / mistura de gás 95% O 2. Remover quaisquer bolhas de ar antes da perfusão.</li>
	<li>Depois de expor o coração, introduza a agulha na parte posterior do ventrículo esquerdo.</li>
	Executar transcardial perfusão do cérebro manualmente utilizando a seringa de <li>. Ratos maiores exigem mais buffer de dissecação para perfusão. Submergir o cérebro com buffer de dissecação gelada por 5 min. bolha buffer continuamente durante a submersão.</li>
	<li>Guarnição no lado posterior do cérebro em um paralelo de ângulo para a orientação dendrítica da região cortical alvo usando uma lâmina. Uma vez que o cérebro é ficar no palco de dissecação, com o fundo do corte final, o ângulo inicial determina o ângulo de todas as fatias do cérebro posterior. Esta etapa é criticamente importante ( Figura 2B). Um ângulo incorreto pode cortar os neurônios piramidais alvo. 
	Nota: As ferramentas aqui são: uma lâmina para corte do cérebro, um papel de filtro (ϕ = 10 cm), numa fase de dissecação do cérebro de aço inoxidável (espessura = 3 mm, ϕ = 12 cm), uma espátula, uma cola, um conta-gotas e uma fase de montagem para o vibratome (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Corte fatias de cérebro coronal espessa 350-µm usando um vibratome. Encha a câmara de dissecação com buffer gelada borbulhava com 5% CO 2 / 95% O 2 gás mistura ( Figura 2). O buffer de bolha continuamente durante a fatia de cérebro.</li>
	<li>Guarnição na periferia da área de destino usando a tesoura íris.</li>
	<li>Lavagem as fatias aparadas delicadamente em temperatura ambiente aCSF borbulhava com 5% CO 2 / 95% O 2 (tabela 2).</li>
	<li>Manter o aparado de fatias em uma câmara de interface até que a gravação é executada ( Figura 2D e E). Incubação por 1h na câmara melhora a condição das células, mas os fenótipos mudam se as fatias são incubadas por mais de 10 horas. Feche a tampa da câmara para delimitar os gases e o líquido de pequeno gotas de aCSF.</li>
</ol> 8. Braçadeira do remendo de células inteiras Nota: gravações de células inteiras exigem um amplificador e um filtro passa-baixa que é definido como uma frequência de corte de 5 kHz. Os sinais são digitalizados e armazenados em um PC. Analisam-se os dados armazenados off-line ( Figura 3A).
<ol><li>Criar eletrodos de vidro usando um puxador horizontal. Encha os eléctrodos com uma solução adequada (tabelas 3 e 4) utilizando uma seringa de 1 mL de polietileno normal ligado a um tubo de vidro fino e um filtro de 0,22 µm.</li>
	<li>Antes do contato com a célula, manter pressão positiva e ajustar a pipeta atual para zero.</li>
	<li>Depois de formar um selo gigaohm, aplique pressão negativa a ruptura da membrana celular (célula inteira configuração na Figura 3F).</li>
</ol> 9. Análise de corrente-braçadeira <ol><li>Propriedades da membrana celular <ol><li>preencher o patch gravação pipetas com a solução intracelular para a corrente-braçadeira gravações (tabela 3). A resistência da pipeta é entre 4 MΩ e 7 MΩ na aCSF.</li>
		<li>Depois que rompe a membrana, mantenha a tensão de membrana -60 mV no modo V-CLAMP. Em seguida, alternar de &#34; banho &#34; modo a &#34; celular &#34; modo no teste de membrana, utilizando software para medir as propriedades de célula intrínsecas como capacitância da membrana, resistência e constante de tempo.</li>
	</ol></li> <li>Atual estudo de injeção <ol><li>depois de gravar as propriedades de célula intrínsecas, alterne para o modo de V-braçadeira para pista (eu = 0) /I-CLAMP NORMAL para a injeção de corrente. Observe que o potencial de junção líquida não deve ser corrigido 10.</li>
		<li>Inject atual dentro da célula para 300 ms. alterar a intensidade da corrente em etapas de &#8722; pA 100 a +550 pA com aumentos de 50-pA. Contar o número de picos (potenciais de ação) eliciada as injeções atuais.</li>
		<li>Medir a tensão mínima necessária para induzir um potencial de ação (esta é a tensão de limiar).</li>
		<li>Calcular a amplitude de afterhyperpolarization como a diferença entre a tensão na iniciação de pico e a mais baixa tensão atingida durante afterhyperpolarization 7.</li>
	</ol></li></ol> 10. Análise de tensão-braçadeira <ol><li>o Leandro/NMDA ratio Nota: Leandro/NMDA a relação é uma maneira convencional para avaliar pós-sináptica plasticidade no glutamatérgico sinapses excitatórias 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no entanto, observe que aumento concomitante de ambos os componentes não pode alterar a proporção de 13.
	<ol><li>Perfuse câmara de gravação com solução fisiológica borbulhava com a mistura de gás e manter a temperatura entre 22 ° C e 25 Picrotoxina de 0,1 mM Add ° C. para a solução para bloquear o GABA A - mediada por resposta e adicionar 4 µM 2- chloroadenosine para estabilizar a resposta neural evocada 14.</li>
		<li>Preencher o patch gravação pipetas com a solução intracelular para tensão-braçadeira para gravações (tabela 4). Verifique a resistência da pipeta em aCSF a gravação. A resistência é entre 4 MΩ e 7 MΩ.</li>
		<li>Para gravação em neurônios piramidais de camada II/III na M1, coloque um bipolar tungstênio estimulando eletrodo 200 µm a 300 µm lateral para as células a ser gravado, abaixo da superfície pial na região da representação do membro anterior (2mm lateral para o linha média) 15 , 16 , 17.</li>
		<li>Para gravação em um neurônio piramidal CA1, coloque o estimulante µm de eletrodo 200 a 300 µm lateral (fibra colateral de Schaffer) ou medial (via temporoammonic) para as células que será gravada ( Figura 3B).</li>
		<li>Aumentar a intensidade do estímulo até a resposta sináptica &#62; 10 Pa.</li>
		<li>Calcular a relação de Leandro/NMDA, como a relação entre a corrente de pico medido em &#8722; 60 mV para a corrente medida no + 40 mV a 150 ms após o início do estímulo. Observe que vestígios de 50 a 100 devem ser em média para calcular a taxa.</li>
	</ol></li> <li>Gravações de corrente pós-sináptica miniatura Nota: correntes de pós-sinápticos excitatórias em miniatura (mEPSCs) que correspondem as respostas eliciadas pela liberação pré-sináptica de uma única vesícula de glutamato 18 . Em contraste, correntes de pós-sináptico inibitório de miniatura (mIPSCs) são pensadas para correspondem as respostas eliciadas pela liberação pré-sináptica de uma única vesícula de GABA 18. Aumentos nas amplitudes de mEPSCs e mIPSCs reflete a transmissão pós-sináptica reforço, enquanto aumentos no caso de frequência refletem aumentos no número de sinapses funcionais ou a probabilidade de liberação pré-sináptica 11 .
	<ol><li>Encher a pipeta de gravação do remendo com solução intracelular modificada (tabela 4) para ajustar o potencial de reversão do atual mediada por receptores GABA À -60 mV.</li>
		<li>Tetrodotoxina de adicionar 0,5 µM para o banho para bloquear os potenciais de ação espontâneos.</li>
		<li>Mantenha a tensão no -60 mV a rECORD os eventos mEPSC por 5 min.</li>
		<li>Mudança na exploração potencial para 0 mV para eventos mIPSC record por 5 min. Porque M1 neurônios mostram reversão ligeiramente mais elevado potencial para correntes de Leandro mediada, os mIPSCs de neurônios M1 são registadas pelo + 15 mV com 0,1 mM APV.</li>
		<li>Esperar por alguns minutos para a atual estabilizar.</li>
		<li>Registrar os eventos de mIPSC 5 min.</li>
		<li>Detectar os eventos em miniatura usando o software e usar eventos acima 10 pA para a análise. Conte o número de eventos de mEPSCs ou mIPSCs por 5 min determinar a frequência. Média as amplitudes dos eventos para obter a amplitude média.</li>
		<li>Confirmar se o tratamento de banho com 10 µM CNQX ou com 10 µM prosencefálico reverte bloqueia os eventos mEPSCs e mIPSCs, respectivamente.</li>
	</ol></li> <li>Análise de cobertura-pulso Nota: plasticidade pré-sináptica pode ser analisada usando análise de pulso emparelhado. Um aumento da taxa de pulso emparelhado sugere uma diminuição do glutamato pré-sináptica ou liberação de GABA probabilidade 7 , 10 , 11.
	<ol><li>Para analisar as sinapses excitatórias, adicionar Picrotoxina 0,1 mM e gravar a resposta em -60 mV. Embora nós adicionamos 4 µM 2-chloroadenosine para o banho, precisamos ter em mente que a droga afeta a probabilidade de liberação pré-sináptica 14.</li>
		<li>Para analisar as sinapses inibitórias, adicionar 0,1 mM APV e 4 µM 2-chloroadenosine para o banho e gravar a resposta em 0 mV. Nos neurônios de M1, gravar a resposta em + 15 mV.</li>
		<li>Aplicar pulsos emparelhados com um intervalo de estímulo Inter de ms 100 ou 200 ms.</li>
		<li>Gravar traços sequenciais de 50-100 em cada exploração potencial e os valores médios.</li>
		<li>Calcular a taxa de pulso emparelhados como a relação do pico do segundo para o primeiro pico da corrente pós-sináptica.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Os autores declaram não há conflitos de interesse. Confirmamos que lemos posição do jornal sobre as questões envolvidas na publicação ética, e afirmamos que este relatório seja consistente com essas orientações. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados ou análise, a decisão de publicar ou a preparação do manuscrito.

A principal limitação da técnica de braçadeira do remendo da fatia é a gravação em fatia de preparação, que pode não refletir o que acontece em vivo. Embora na vivo análise de corrente-braçadeira é mais confiável, é tecnicamente difícil obter dados suficientes de animais conscientes. Desde que cada neurônio piramidal tem propriedades diferentes de celulares, um número adequado de células é necessário para analisar corretamente as diferenças nos neurônios após o treino. Além disso, a análise de tensão-braçadeira requer tratamento contínuo com CNQX, APV ou relação para determinar a natureza das respostas pós-sinápticas. Para analisar as respostas em miniatura induzidas por uma única vesícula de glutamato ou GABA, tratamento contínuo com tetrodotoxina é necessária para bloquear os potenciais de ação espontâneos. Embora a técnica de imagem recentemente desenvolvida multi fóton é poderosa para analisar as alterações morfológicas em sinapses excitatórias19, uma técnica de braçadeira do remendo combinada é necessária para analisar a função das sinapses na vivo. Atualmente é bastante difícil analisar mudanças morfológicas em sinapses inibitórias, desde que não formam sinapses inibidoras mais espinhas. Neste momento, a braçadeira do remendo de fatia seria a técnica mais adequada para analisar as propriedades da célula ou as funções das sinapses excitatório/inibitório em animais treinados.
Usando a análise de corrente-grampo (Figura 4), recentemente, informou motor plasticidade induzida por aprendizagem intrínseca nos neurônios de camada II/III. Especificamente, os ratos treinados 1 dia mostraram uma diminuição significativa no repouso potencial de membrana e um aumento no limiar pico. Os ratos treinados 2 dias mostraram um aumento significativo no potencial de membrana que levou a excitabilidade aumentada. Estes resultados sugeriram que lá foram mudanças dinâmicas na plasticidade intrínseca dos neurônios II/III de camada de M1 em ratos treinados. Análise de tensão-braçadeira adicional revelou um aumento na proporção de pulso pareado em ratos treinados de 1 dia, sugerindo que houve uma redução transitória na pré-sináptica GABA lançamento probabilidade7. É portanto possível que desinibição do GABA na camada II/III sinapses pode desencadear a plasticidade induzida por aprendizagem resultante na M1. Para apoiar isso, preparação de fatia da M1 requer tratamento de banho com um bloqueador do receptor GABAA induzir a LTP20.
Análise dos potenciais pós-sinápticos em miniatura é uma maneira poderosa para detectar plasticidade sináptica em animais treinados IA. Sequencial de gravação de mEPSCs e mIPSCs em um único neurônio CA1 permite a análise da força sináptica excitatório/inibitório da cada neurônio individual. Desde um único mE (I) PSC resposta é atribuída a uma única vesícula de glutamato ou GABA, um aumento em mim (I) PSC amplitude sugere reforço pós-sináptica. Usando-mE (I) análise PSC, encontramos diferenças individuais na força da excitatório/inibitório entrada para cada neurônio CA1 (Figura 5). Treinamento de IA claramente promovido diversidade na força sináptica, mas isto não foi observado em outros grupos (tabela 5).
Diversidade sináptica induzida a aprendizagem pode ser analisada matematicamente. Calculando a probabilidade do aparecimento de cada ponto, os dados de cada neurônio podem ser convertidos em autoentropia (um pouco) usando a teoria da informação de Claude E. Shannon21. Um ponto com probabilidade alta de aparência (em torno do nível médio) indica baixa autoentropia, enquanto um ponto com probabilidade muito raro (um ponto de desvio) indica alta autoentropia. Em comparação com ratos destreinados, a autoentropia por neurônio foi claramente aumentada em ratos treinados IA mas não pareada ou Walk-through ratos22. Esta análise sugere que houve um aumento no intra-CA1 informações após a aprendizagem contextual.
A técnica de braçadeira do remendo de fatia também pode ser usada para o marcado medo condicionado estudos na amígdala lateral9 e para estudos de experiência sensorial no barril córtex8. Além disso, esta técnica pode ser usada com várias outras técnicas para mais investigações. Por exemplo, a vírus mediada por proteína verde fluorescente (GFP)-gene etiquetado entrega técnica pode ser combinada com a técnica de braçadeira do remendo para analisar a função das moléculas específicas. Além disso, focal microinjeção de um traçador retrógrado pode ser usada para visualizar os neurônios específicos esse projeto para uma área específica. Em seguida, usando a técnica de corrente-braçadeira, propriedades específicas da célula podem ser analisadas em neurônios visualizado23. Além disso, utilizou-se microscopia de varredura a laser de combinar dois fotões com dois fotões do laser uncaging de glutamato para demonstrar o crescimento da coluna específica e a resposta EPSC mouse cortical da camada de neurônios piramidais II/III19. Assim, a técnica de braçadeira do remendo de fatia está sendo melhorada combinando-a com novos produtos químicos, gene entrega e técnicas de manipulação de foto.

A técnica de braçadeira do remendo, desenvolvida pela Neher e Sakmann, tem sido amplamente utilizada para experimentos eletrofisiológicos1. O remendo de células inteiras braçadeira técnica2 pode ser usado para gravar intracelular corrente ou tensão usando o selo gigaohm da membrana celular. A técnica de corrente-braçadeira nos permite analisar as diferenças nas propriedades da membrana como potencial, resistência e capacitância3a descansar. A técnica de tensão-braçadeira nos permite analisar a plasticidade sináptica induzida pela aprendizagem em sinapses excitatórias e inibitórias.
O córtex motor primário (M1) é uma região central que é essencial para fazer movimentos voluntários qualificados. Anteriores Estudos eletrofisiológicos demonstraram o desenvolvimento da potenciação de longa duração (LTP)-como plasticidade na camada II/III excitatório sinapses após treinamento hábil motor4. Além disso, na vivo estudos adicionais de imagem demonstrou a remodelação de espinhas dendríticas M1 após um hábil atingindo tarefa5,6. No entanto, plasticidade sináptica e intrínseca induzida pelo aprendizado não tem sido demonstrada em neurônios de M1.
Recentemente, informou que uma tarefa de vara de rotor promovido mudanças dinâmicas em glutamatérgico e gabaérgica sinapses e alterou a plasticidade intrínseca no M1 camada II/III neurônios7. Aqui usamos a técnica de braçadeira do remendo de fatia para investigar a plasticidade induzida pela aprendizagem. Esta técnica também pode ser usada para investigar outros tipos de plasticidade dependente da experiência em outras regiões do cérebro. Por exemplo, entrada sensorial para o córtex barril pode fortalecer Leandro mediada por receptores excitatória entrada na camada de neurônios II/III8e marcado medo condicionado fortalece as entradas excitatórias sobre os neurônios da amígdala lateral, que é necessário para medo de memória9. Além disso, a aprendizagem contextual cria diversidade em termos de entrada sináptica excitatória e inibitória em hippocampal CA1 neurônios10,11.

<table><tbody><tr><td>Esteiras Rota-Rod</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>caixa de prevenção inibitória</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de perfusão cardíaca</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Extrator Horizontal</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modelo P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilme 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m</td><td>filtro Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&ndash; Amplificador 1D&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 AD placa</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td><td>de câmera Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Isolador</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador motorizado</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica&nbsp;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&reg; 3</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo capilar de vidro</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl&nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de estímulo</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td>Materiais</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Dissection buffer/ artificial CSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de colina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico Wako</td><td>Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td>Materiais</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solução intracelular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconato</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na2 ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na3 GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO3</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>Materiais</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Drugs in aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenosine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>Resposta 5282</td><td></td></tr></tbody></table>

fatia patch clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é uma poderosa ferramenta para investigar a plasticidade neural induzida por aprendizagem em regiões específicas do cérebro. Para analisar o motor-aprendizagem plasticidade induzida, treinamos ratos usando uma tarefa de vara de rotor acelerado. Ratos realizado a tarefa 10 vezes em intervalos de 30 s para 1 ou 2 dias. Desempenho foi melhorado significativamente sobre os dias de treinamento em comparação com o primeiro julgamento. Então preparamos fatias de cérebro aguda do córtex motor primário (M1) em ratos treinados e destreinados. Análise de corrente-braçadeira mostrou mudanças dinâmicas no potencial de membrana, limiar de spike, afterhyperpolarization e resistência de membrana de repouso em neurônios piramidais de camada II/III. Injeção de corrente induzida por muitos picos mais em ratos treinados 2 dias do que em controles destreinados.
Para analisar a aprendizagem contextual plasticidade induzida, treinamos ratos usando uma tarefa de evasão inibitório (IA). Depois de experimentar pé-choque no lado escuro de uma caixa, os ratos aprenderam a evitá-lo, ficar no lado iluminado. Estamos preparados agudas fatias hippocampal destreinado, IA-treinado, não pareado e ratos de passo a passo. Análise de tensão-braçadeira foi usado para gravar sequencialmente em miniatura excitatórios e inibitórios pós-sinápticos correntes (mEPSCs e mIPSCs) do mesmo neurônio CA1. Encontramos diferentes amplitudes médios de mEPSC e mIPSC em cada neurônio CA1, sugerindo que cada neurônio tinha diferentes dosagens pós-sináptica em suas sinapses excitatórias e inibitórias. Além disso, em comparação com controles destreinados, ratos treinados IA tinham maiores amplitudes de mEPSC e mIPSC, com ampla diversidade. Estes resultados sugeriram que a aprendizagem contextual cria pós-sináptica diversidade nas sinapses excitatórias e inibitórias em cada neurônio CA1.
Leandro ou GABAA receptores parecem mediar as correntes pós-sinápticas, desde tratamento de banho com CNQX ou prosencefálico bloqueou os eventos mEPSC ou mIPSC, respectivamente. Esta técnica pode ser usada para estudar diferentes tipos de aprendizagem em outras regiões, como o córtex sensorial e a amígdala.

Como descrevemos recentemente7, formação de haste do rotor (figura 1A) induzido mudanças dinâmicas na plasticidade intrínseca dos neurônios M1 camada II/III piramidais. Medir a latência até os ratos caem da haste rotativa permite estimar o desempenho de aprendizagem hábil do rato. Latência mais indica melhor desempenho motor. No dia 1 do treinamento, os ratos melhoraram seu desempenho de haste do rotor até o julgamento terminou. No dia 2, os ratos alcançado níveis quase assintótica na sessão em média escores (figura 1B). Comparado com a latência no primeiro julgamento, a análise post-hoc mostrou melhorias significativas no julgamento final sobre os dias de treinamento (Figura 1).
A figura 4A mostra um exemplo de análise de corrente-grampo, no qual as propriedades neuronais alterada após a aprendizagem da habilidade motora. Injeções de pA 400 e 500 correntes pA eram necessários para induzir os potenciais de ação no grupo destreinado e nos ratos treinados dia-1, respectivamente. Em contraste, a injeção de apenas um pA 150 atual foi suficiente para provocar potenciais de ação nos ratos treinados 2 dias. A relação entre a intensidade de corrente e o número de potenciais de ação é mostrada na Figura 4B. Tão pouco quanto 50 AP atual foi suficiente para provocar picos em ratos treinados 2 dias; em contraste, 1 dia ratos treinados responderam com menos potenciais de ação que ratos destreinados para 350 pA e correntes mais elevadas. Além disso, a Figura 4 mostra que ratos treinados 1 dia mostraram baixa descansando potenciais, maior spike limiar e afterhyperpolarization mais profundo, Considerando que ratos treinados 2 dias mostraram maior potencial de repouso (Figura 4) e (de resistência de membrana A Figura 4).
Como descrevemos anteriormente11, treinamento de IA (Figura 1) induzido pós-sináptica plasticidade em sinapses excitatórias e inibitórias dos neurônios hippocampal CA1. Ao medir a latência em caixa de luz, nós poderia estimar o desempenho de aprendizagem contextual do rato. Figura 1E mostra os resultados da tarefa IA. Após o choque elétrico emparelhado, os ratos aprendem a evitar o lado escuro da caixa e ficar no lado iluminado, que geralmente não prefeririam. A tendência de evitar o lado negro, portanto, indica a aquisição de memórias contextuais.
A Figura 5 mostra um exemplo de análise de tensão-braçadeira em miniatura que correntes pós-sinápticas foram drasticamente alteradas após a aprendizagem contextual. Para investigar a plasticidade induzida pela aprendizagem, espontâneo mediada por Leandro mEPSCs e GABAA-mediadas mIPSCs sequencialmente foram gravadas na presença de 0,5 tetrodotoxina µM (Figura 5A e B). Como mostrado em parcelas bidimensionais (Figura 5), cada neurônio CA1 tinha diferentes amplitudes de média para mEPSCs e mIPSCs. Embora as amplitudes foram baixas e mostraram uma gama estreita distribuição em destreinados, pareado, e ratos de passo a passo, eram diversas em ratos treinados IA (tabela 5). ANOVA seguido de análise post-hoc mostrou um aumento significativo da médios amplitudes de mEPSC e mIPSC em ratos treinados IA (Figura 5E), sugerindo a plasticidade pós-sináptica induzida em aprendizagem nos neurônios CA1.
Além disso, cada neurônio CA1 exibiu diferentes frequências de mEPSC e mIPSC (Figura 5). Embora as frequências foram baixas e mostraram uma gama estreita distribuição em destreinados, pareado, e ratos de passo a passo, eram diversas em ratos treinados IA (quadro 6). ANOVA seguido de análise post-hoc mostrou um aumento significativo nas frequências dos eventos mEPSC e mIPSC em ratos treinados IA (Figura 5F). Há duas possíveis interpretações destes resultados. A primeira é que a aprendizagem contextual aumentou o número de sinapses funcionais dos neurônios. O outro é que a aprendizagem contextual aumentou a probabilidade de liberação pré-sináptica de glutamato e GABA.
Para aprofundar a análise de plasticidade pré-sináptica, realizamos também emparelhado-pulso estímulos, como relatado anteriormente,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2.jpg"> 
Figura 1 : Aprendizagem desempenho após o treino. 
A: O desenho experimental mostra a formação de vara de rotor e fatias coronais do cérebro. B: A latência média cair do tambor de vara de rotor acelerada. C: A latência média de cair fora a haste sobre o primeiro e os ensaios finais na formação dias 1 e 27. P&#60; 0,01 vs primeiro julgamento. D: esquema da evasão inibitório (IA) tarefa e coronal cérebro fatia. E: A latência média para entrar a caixa escura antes e depois IA formação11. P&#60; 0,01 vs antes do treino de IA. Os números pelas seções coronais indicam a distância à frente o bregma em mm. O número de animais é mostrado na parte inferior das barras. Barras de erro indicam SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig2.jpg"> 
Figura 2 : Fatia procedimentos. 
A: as fotografias mostram a preparação de fatias cerebral aguda. As ferramentas de dissecação foram refrigeradas no antes do gelo picado para usar. B: dissecção e remoção do cérebro. Observe que o ângulo de corte do lado posterior deve ser orientado em paralelo com a orientação dendrítica. C: cortar o cérebro em uma câmara de vibratome. O cérebro é banhado no buffer de dissecação e borbulhava continuamente com uma mistura de gás 5% CO295% O2 . D: uma câmara de interface é constituído por dois recipientes de comida de plástico e um tubo de silicone. A câmara foi preenchida com CSF artificial e borbulhava continuamente com a mistura de gases. E: fatias do cérebro foram colocadas no papel de filtro molhado na câmara.Barra = 5 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig3.jpg"> 
Figura 3 : Procedimentos de braçadeira Patch. 
A: O sistema de remendo-braçadeira costumava gravar sinais elétricos de um neurônio. A localização do estímulo e gravação eletrodos nos neurônios camada II/III são mostradas no córtex motor de ratos. B: para analisar as sinapses Schaffer de um neurônio piramidal CA1, um estimulante eletrodo foi colocado no radiatum estrato. Para analisar as sinapses temporoammonic, um estimulante eletrodo foi colocado no moleculare estrato. Representante da Leandro evocado e NMDA mediada por receptores excitatórios pós-sinápticos correntes no mesmo neurônio CA1 são mostradas. C: uma fatia de âncora foi usada para estabilizar a fatia na câmara de gravação. D: um mapa de representação no córtex motor, com base em artigos publicados15,16,17. ML = mediana. E: Micrografias de IR-DIC de M1 neurônios II/III antes da camada (superior) e durante a gravação (inferior). Bar = 10 µm. F: mudanças em pipeta atual antes de toque (topo) e na ruptura de membrana (inferior). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig4.jpg"> 
Figura 4 : Resultados representativos de análise de corrente-braçadeira7 . 
A: traços representativos dos potenciais de ação registrada após indução com injeções de corrente. B: as relações entre a entrada atual média (pA) vs. saída do potencial de ação (número de picos) em fatias de cérebro do destreinado (barras abertas), 1-dia treinadas (barras cinza) e 2 dias ratos treinados (bares cheios). C: afterhyperpolarization dos neurônios camada II/III, limiar e potencial de repouso. D: resistência da membrana e resistência série dos neurônios. Usamos a 9-10 ratos em cada grupo. O número de células é mostrado dentro de cada barra. Barras de erro indicam a SEM. *P&#60; 0.05, * *P&#60; 0,01 vs destreinados. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig5.jpg"> 
Figura 5 : Resultados representativos do tensão-braçadeira análise11 . Traços representativos de miniatura excitatórios e inibitórios pós-sinápticos correntes (mEPSCs e mIPSCs) no destreinado (A) e evasão inibitório (IA)-treinados ratos (B). mEPSCs-60 mV e mIPSCs em 0 mV foram medidos sequencialmente no mesmo neurônio piramidal CA1 na presença de tetrodotoxina (0,5 µM). Barra vertical = 20 pA, barra horizontal = 200 mseg. C: bidimensional de parcelas a média mE (I) PSC amplitudes em destreinados, IA-treinado, não pareado e noções básicas ratos. D: parcelas bidimensionais de mim (I) PSC frequências em 4 grupos. Nota que cada neurônio CA1 exibiu diferentes falando de mim (I) frequências e amplitudes PSC. Treinamento de IA não só fortaleceu as amplitudes de média (E), mas também aumentou as frequências de mim (I) eventos PSC (F). Usamos 4-6 ratos em cada grupo. O número de células é mostrado na parte inferior das barras. Sinais de adição vermelhos (C, D) e bares com linhas verticais (E, F) indicam a média ± SEM. * *P&#60; 0,01 vs destreinados ratos. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Buffer de dissecação (Total 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 • 2 H2O</td>
			<td>0,195 g</td>
			<td>1,25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>g 0,188</td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0,074 g</td>
			<td>0,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 • 6 H2O</td>
			<td>1,423 g</td>
			<td>7.0 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloreto de colina</td>
			<td>g 12,579</td>
			<td>90 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido ascórbico</td>
			<td>g 2,340</td>
			<td>11,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>0,342 g</td>
			<td>3.1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2,100 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose</td>
			<td>4,500 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Uma receita para o buffer de dissecação
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">CSF artificial (Total 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>g 0,186</td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>g 6,700</td>
			<td>114,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 •2H2, O</td>
			<td>0,156 g</td>
			<td>1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose</td>
			<td>1,800 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2,184 g</td>
			<td>26 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Uma receita para artificial de líquido cerebrospinal (CSF)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Solução intracelular para braçadeira atual (Total 200 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>g 0,0746</td>
			<td>5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconato</td>
			<td>g 6,089</td>
			<td>130 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0,476 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>g 0,0456</td>
			<td>0,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 Μ l</td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>At2 ATP</td>
			<td>g 0,4408</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>At3 GTP</td>
			<td>g 0,0418</td>
			<td>0,4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosfocreatina at</td>
			<td>g 0,510</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Uma receita para uma solução intracelular para braçadeira atual para gravação
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Solução intracelular para braçadeira de tensão (Total 200 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO3</td>
			<td>5</td></tr></tbody></table>g.244
			<td>(5.814) *</td>
			<td>115 mmol/L</td>
			<td>(127,5) *</td>
		
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>0,672 g</td>
			<td>(0.252) *</td>
			<td>20 mmol/L</td>
			<td>(7,5) *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0,476 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>g 0,0456</td>
			<td></td>
			<td>0,6 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 Μ l</td>
			<td></td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>At2 ATP</td>
			<td>g 0,4408</td>
			<td></td>
			<td>4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>At3 GTP</td>
			<td>g 0,0418</td>
			<td></td>
			<td>0,4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosfocreatina at</td>
			<td>g 0,510</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* baixa concentração de Cl– para gravações em miniatura</td>
		</tr>
	

Tabela 4: Uma receita para uma solução intracelular para braçadeira de tensão para gravação
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parâmetros</td>
			<td></td>
			<td>sem treinamento</td>
			<td>IA treinado</td>
			<td>Não pareado</td>
			<td>Caminhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC amplitude</td>
			<td>Variação</td>
			<td>5.8</td>
			<td>32,1</td>
			<td>4.7</td>
			<td>5.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Desvio-padrão</td>
			<td>2.4</td>
			<td>5.7</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coeficiente de variação</td>
			<td>0.189</td>
			<td>0.326</td>
			<td>0,177</td>
			<td>0,190</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC amplitude</td>
			<td>Variação</td>
			<td>17.1</td>
			<td>56,7</td>
			<td>31,8</td>
			<td>20,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Desvio-padrão</td>
			<td>4.1</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5.6</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coeficiente de variação</td>
			<td>0.279</td>
			<td>0,387</td>
			<td>0,367</td>
			<td>0.286</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: A diversidade de miniatura excitatórios e inibitórios pós-sinápticos atual (mEPSC e mIPSC) amplitudes em evasão inibitório (IA)-treinados ratos
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parâmetros</td>
			<td></td>
			<td>sem treinamento</td>
			<td>IA treinado</td>
			<td>Não pareado</td>
			<td>Caminhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frequência mEPSC</td>
			<td>Variação</td>
			<td>278</td>
			<td>2195</td>
			<td>188</td>
			<td>195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Desvio-padrão</td>
			<td>17</td>
			<td>47</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coeficiente de variação</td>
			<td>0.902</td>
			<td>1.198</td>
			<td>0.893</td>
			<td>0.874</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frequência mIPSC</td>
			<td>Variação</td>
			<td>3282</td>
			<td>27212</td>
			<td>1385</td>
			<td>5135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Desvio-padrão</td>
			<td>57</td>
			<td>165</td>
			<td>37</td>
			<td>72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coeficiente de variação</td>
			<td>1.195</td>
			<td>1.006</td>
			<td>0.955</td>
			<td>0.836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: A diversidade de miniatura excitatórias e inibitórias pós-sinápticos atual (mEPSC e mIPSC) frequências em evasão inibitório (IA)-treinados ratos

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Olá, meu nome é Dai Mitsushima. Aqui vamos mostrar como preparar fatias cerebrais em animais treinados, comparando dados de patch clamp em animais não treinados. Podemos analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado.Olá, meu nome é Hiroyuki Kida. Neste experimento, investigamos o mecanismo neurológico da locomoção motora utilizando o teste da barra rotatória. O teste da barra rotatória é amplamente utilizado para avaliar a cognição motora de roedores.A vantagem deste método é que podemos alterar o nível de descoberta durante o teste aumentando a velocidade do rotador. Teste da barra rotatória. Antes da tarefa motora, o aparelho de barra rotatória deve ser ajustado para o modo de aceleração de 4 a 40 rpm ao longo de 300 segundos.Os ratos realizaram dez tentativas para cada teste. O intervalo de tempo entre as tentativas foi de 30 segundos. Durante a primeira sessão de treinamento, os ratos geralmente caem do bastão, mesmo em baixas velocidades, e às vezes caminham na direção errada.No entanto, após repetir o treinamento, a rata consegue andar em uma velocidade mais alta. Ao medir a latência na haste, podemos estimar o desempenho de aprendizagem da rata na habilidade. Aqui podemos ver os resultados do teste da haste rotatória.Como mostrado nesta figura, dois dias de treinamento são suficientes para adquirir a habilidade motora. Em comparação com a latência no primeiro ensaio, a análise post hoc mostrou uma melhora significativa no último ensaio dos dias de treinamento. Ao medir a latência na barra, podemos estimar o desempenho de aprendizagem da habilidade pelo rato.Em seguida, mostraremos a você um teste de inibição da evitação. Este teste é útil para analisar o desempenho do aprendizado contextual. O aparelho de inibição da evitação consiste em lados claro e escuro separados por uma porta de armadilha.Durante a sessão de treinamento, os ratos são colocados na área iluminada e têm um curto período de tempo para se aclimatarem ao ambiente. Assim que a porta se abre, os ratos podem entrar livremente na área escura. Ao entrarem na área escura, a porta é fechada e os ratos recebem um choque elétrico leve durante dois segundos.Após serem devolvidos às suas gaiolas por 30 minutos ao final do ensaio, os ratos são colocados novamente na área iluminada do aparelho. Trinta minutos após o choque, os ratos treinados mostraram consistentemente uma latência maior antes de entrar na área escura. Aqui podemos ver os resultados do teste de evitação inibitória.Após o choque elétrico, os ratos aprenderam a evitar a área escurecida e permanecer no lado iluminado, o qual normalmente não prefeririam. Essa tendência de evitar o lado escurecido indica a aquisição de memórias contextuais. Fatias cerebrais pós-treinamento.Antes da incisão, resfriamos todas as tesouras, pinças hemostáticas e béqueres com gelo picado. Aqui você pode ver nossa preparação para a dissecação. A dissecação cerebral deve ser realizada o mais rapidamente possível.Após essa anestesia profunda, o rato é colocado em uma bandeja rasa com gelo picado e é feita uma incisão para abrir a cavidade abdominal. Após a incisão do diafragma, é feita uma incisão lateral adicional. Para abrir a cavidade torácica, a cartilagem costal deve ser fechada com pinça hemostática.Após expor o coração, uma agulha de aço inoxidável de 18 calibres é inserida na parte posterior do ventrículo esquerdo. A ponta da agulha deve ser visível através da parede da aorta. Após cortar a aurícula direita, inicia-se a perfusão.Certifique-se de que tanto a agulha quanto a seringa estejam primeiramente preenchidas com tampão de dissecção gelado e gaseificado. Quaisquer bolhas de ar também devem ser removidas antes da perfusão. Primeiramente, corte na região posterior do crânio.Em seguida, faça um corte lateral, seguido por um corte central para expor o cérebro. Após a dissecação, o cérebro deve ser colocado em tampão gelado e borbulhante por cinco minutos. Antes de prosseguir com a dissecação, o papel-filtro deve ser umedecido com tampão gelado.Em seguida, o cérebro é colocado sobre uma plataforma de aço inoxidável gelada. O ângulo da plataforma de corte é crucial para garantir um ângulo adequado de corte da fatia cerebral. Um ângulo incorreto poderia potencialmente seccionar os neurônios piramidais alvo.Após o corte, uma gota de cola instantânea deve ser colocada sobre a platina do vibrátomo. Para garantir uma adesão firme, o excesso de tampão de dissecação deve ser removido usando um pedaço de papel de filtro. Utilizando o vibrátomo, podem ser obtidos cortes finos de cérebro mantidos em um tampão gelado e borbulhante.Nossa área-alvo é o córtex motor primário. A área cerebral-alvo pode ser removida usando tesoura de íris. A câmara de interface pode ser feita usando um recipiente plástico para alimentos.A tampa da câmara de interface é necessária para conter o gás. As fatias são observadas usando um microscópio infravermelho-DIC. Aqui podemos ver um exemplo de neurônios da camada 2/3 na córtex motora primária.As pipetas para gravação em patch são preenchidas com a solução intracelular apropriada. A solução para a análise em clamp de corrente é diferente daquela usada na análise em clamp de voltagem. Resultados representativos.A técnica de fixação de corrente é útil para analisar propriedades intrínsecas da célula. Após o treinamento no bastão rotativo, foi possível obter os dados de fixação de corrente de neurônios da camada 2/3 do córtex motor primário. O painel A indica traços típicos induzidos por injeções de corrente.O painel B indica a relação entre a corrente injetada e o número de potenciais de ação. Ratos treinados por um dia induziram menos potenciais de ação, enquanto ratos treinados por dois dias induziram muito mais potenciais de ação do que ratos não treinados. Como pode ser observado nos painéis inferiores, ratos treinados por um dia exibiram potencial de repouso mais baixo, limiar de disparo mais alto e afterhiperpolarização mais profunda.Ratos treinados por dois dias exibiram potencial de repouso e resistência da membrana mais elevados. A técnica de fixação de voltagem é útil para analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado. Aqui, podemos observar dados de neurônios CA1 após treinamento contextual.Obtivemos correntes pós-sinápticas miniaturas de neurônios CA1 induzidas por vesículas únicas de glutamato ou GABA. Os painéis A e B mostram traçados representativos de correntes pós-sinápticas miniaturas. Na presença de tetrodotoxina, EPSCs miniaturas a menos 16 milivolts e IPSCs miniaturas a zero milivolts foram medidos sequencialmente nos mesmos neurônios.O painel C mostra gráficos bidimensionais das amplitudes dos EPSCs e IPSCs miniaturas nas amplitudes dos EPSCs e IPSCs miniaturas em ratos não treinados, treinados, não pareados e walk-through. O painel D mostra os gráficos para as frequências miniaturas. Como pode ser observado nos painéis inferiores, os treinamentos contextuais fortaleceram significativamente tanto as sinapses excitatórias quanto as inibitórias, promovendo a diversidade das entradas sinápticas para os neurônios.Em resumo, a técnica de fixação de corrente é útil para analisar alterações induzidas pelo aprendizado nas propriedades celulares. Além disso, a técnica de fixação de tensão é uma ferramenta poderosa para analisar a plasticidade induzida pelo aprendizado em sinapses excitatórias e inibitórias. Os resultados detalhados dessas análises podem ser encontrados nas publicações a seguir.

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento para mapear conexões sinápticas protegendo uma fatia de cérebro, posicionando pipetas para obter configurações de células inteiras e estimulando neurônios pré-sinápticos a registrar respostas pós-sinápticas, elucidando assim a conectividade neuronal.

Registro de grampo de patch emparelhado das conexões neuronais em fatias cerebrais agudas

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Este artigo em vídeo descreve procedimentos experimentais para estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada nos neurônios piramidais CA1 usando fatias agudas do hipocampo de roedores.

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Aqui, é demonstrado como um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado pode ser usado para examinar os efeitos do traumatismo cranioencefálico leve repetido (r-mTBI) na plasticidade sináptica no hipocampo. O modelo replica características importantes do r-mTBI em pacientes e é usado em conjunto com a eletrofisiologia in vitro .

Avaliação das Alterações na Plasticidade Sináptica Utilizando um Modelo de Traumatismo Cranioencefálico Leve

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Aprenda a técnica de patch clamp em fatias cerebrais para analisar plasticidade sináptica induzida por aprendizagem em ratos treinados. Este método permite investigar mudanças nas propriedades celulares e sinápticas após treinamento motor e contextual.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

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