Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem
11 de novembro de 2017
A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.
Olá, meu nome é Dai Mitsushima. Aqui vamos mostrar como preparar fatias cerebrais em animais treinados, comparando dados de patch clamp em animais não treinados. Podemos analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado.
Olá, meu nome é Hiroyuki Kida. Neste experimento, investigamos o mecanismo neurológico da locomoção motora utilizando o teste da barra rotatória. O teste da barra rotatória é amplamente utilizado para avaliar a cognição motora de roedores.
A vantagem deste método é que podemos alterar o nível de descoberta durante o teste aumentando a velocidade do rotador. Teste da barra rotatória. Antes da tarefa motora, o aparelho de barra rotatória deve ser ajustado para o modo de aceleração de 4 a 40 rpm ao longo de 300 segundos.
Os ratos realizaram dez tentativas para cada teste. O intervalo de tempo entre as tentativas foi de 30 segundos. Durante a primeira sessão de treinamento, os ratos geralmente caem do bastão, mesmo em baixas velocidades, e às vezes caminham na direção errada.
No entanto, após repetir o treinamento, a rata consegue andar em uma velocidade mais alta. Ao medir a latência na haste, podemos estimar o desempenho de aprendizagem da rata na habilidade. Aqui podemos ver os resultados do teste da haste rotatória.
Como mostrado nesta figura, dois dias de treinamento são suficientes para adquirir a habilidade motora. Em comparação com a latência no primeiro ensaio, a análise post hoc mostrou uma melhora significativa no último ensaio dos dias de treinamento. Ao medir a latência na barra, podemos estimar o desempenho de aprendizagem da habilidade pelo rato.
Em seguida, mostraremos a você um teste de inibição da evitação. Este teste é útil para analisar o desempenho do aprendizado contextual. O aparelho de inibição da evitação consiste em lados claro e escuro separados por uma porta de armadilha.
Durante a sessão de treinamento, os ratos são colocados na área iluminada e têm um curto período de tempo para se aclimatarem ao ambiente. Assim que a porta se abre, os ratos podem entrar livremente na área escura. Ao entrarem na área escura, a porta é fechada e os ratos recebem um choque elétrico leve durante dois segundos.
Após serem devolvidos às suas gaiolas por 30 minutos ao final do ensaio, os ratos são colocados novamente na área iluminada do aparelho. Trinta minutos após o choque, os ratos treinados mostraram consistentemente uma latência maior antes de entrar na área escura. Aqui podemos ver os resultados do teste de evitação inibitória.
Após o choque elétrico, os ratos aprenderam a evitar a área escurecida e permanecer no lado iluminado, o qual normalmente não prefeririam. Essa tendência de evitar o lado escurecido indica a aquisição de memórias contextuais. Fatias cerebrais pós-treinamento.
Antes da incisão, resfriamos todas as tesouras, pinças hemostáticas e béqueres com gelo picado. Aqui você pode ver nossa preparação para a dissecação. A dissecação cerebral deve ser realizada o mais rapidamente possível.
Após essa anestesia profunda, o rato é colocado em uma bandeja rasa com gelo picado e é feita uma incisão para abrir a cavidade abdominal. Após a incisão do diafragma, é feita uma incisão lateral adicional. Para abrir a cavidade torácica, a cartilagem costal deve ser fechada com pinça hemostática.
Após expor o coração, uma agulha de aço inoxidável de 18 calibres é inserida na parte posterior do ventrículo esquerdo. A ponta da agulha deve ser visível através da parede da aorta. Após cortar a aurícula direita, inicia-se a perfusão.
Certifique-se de que tanto a agulha quanto a seringa estejam primeiramente preenchidas com tampão de dissecção gelado e gaseificado. Quaisquer bolhas de ar também devem ser removidas antes da perfusão. Primeiramente, corte na região posterior do crânio.
Em seguida, faça um corte lateral, seguido por um corte central para expor o cérebro. Após a dissecação, o cérebro deve ser colocado em tampão gelado e borbulhante por cinco minutos. Antes de prosseguir com a dissecação, o papel-filtro deve ser umedecido com tampão gelado.
Em seguida, o cérebro é colocado sobre uma plataforma de aço inoxidável gelada. O ângulo da plataforma de corte é crucial para garantir um ângulo adequado de corte da fatia cerebral. Um ângulo incorreto poderia potencialmente seccionar os neurônios piramidais alvo.
Após o corte, uma gota de cola instantânea deve ser colocada sobre a platina do vibrátomo. Para garantir uma adesão firme, o excesso de tampão de dissecação deve ser removido usando um pedaço de papel de filtro. Utilizando o vibrátomo, podem ser obtidos cortes finos de cérebro mantidos em um tampão gelado e borbulhante.
Nossa área-alvo é o córtex motor primário. A área cerebral-alvo pode ser removida usando tesoura de íris. A câmara de interface pode ser feita usando um recipiente plástico para alimentos.
A tampa da câmara de interface é necessária para conter o gás. As fatias são observadas usando um microscópio infravermelho-DIC. Aqui podemos ver um exemplo de neurônios da camada 2/3 na córtex motora primária.
As pipetas para gravação em patch são preenchidas com a solução intracelular apropriada. A solução para a análise em clamp de corrente é diferente daquela usada na análise em clamp de voltagem. Resultados representativos.
A técnica de fixação de corrente é útil para analisar propriedades intrínsecas da célula. Após o treinamento no bastão rotativo, foi possível obter os dados de fixação de corrente de neurônios da camada 2/3 do córtex motor primário. O painel A indica traços típicos induzidos por injeções de corrente.
O painel B indica a relação entre a corrente injetada e o número de potenciais de ação. Ratos treinados por um dia induziram menos potenciais de ação, enquanto ratos treinados por dois dias induziram muito mais potenciais de ação do que ratos não treinados. Como pode ser observado nos painéis inferiores, ratos treinados por um dia exibiram potencial de repouso mais baixo, limiar de disparo mais alto e afterhiperpolarização mais profunda.
Ratos treinados por dois dias exibiram potencial de repouso e resistência da membrana mais elevados. A técnica de fixação de voltagem é útil para analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado. Aqui, podemos observar dados de neurônios CA1 após treinamento contextual.
Obtivemos correntes pós-sinápticas miniaturas de neurônios CA1 induzidas por vesículas únicas de glutamato ou GABA. Os painéis A e B mostram traçados representativos de correntes pós-sinápticas miniaturas. Na presença de tetrodotoxina, EPSCs miniaturas a menos 16 milivolts e IPSCs miniaturas a zero milivolts foram medidos sequencialmente nos mesmos neurônios.
O painel C mostra gráficos bidimensionais das amplitudes dos EPSCs e IPSCs miniaturas nas amplitudes dos EPSCs e IPSCs miniaturas em ratos não treinados, treinados, não pareados e walk-through. O painel D mostra os gráficos para as frequências miniaturas. Como pode ser observado nos painéis inferiores, os treinamentos contextuais fortaleceram significativamente tanto as sinapses excitatórias quanto as inibitórias, promovendo a diversidade das entradas sinápticas para os neurônios.
Em resumo, a técnica de fixação de corrente é útil para analisar alterações induzidas pelo aprendizado nas propriedades celulares. Além disso, a técnica de fixação de tensão é uma ferramenta poderosa para analisar a plasticidade induzida pelo aprendizado em sinapses excitatórias e inibitórias. Os resultados detalhados dessas análises podem ser encontrados nas publicações a seguir.
Visão Geral
Este artigo demonstra a técnica de patch clamp em fatias para analisar alterações induzidas pelo aprendizado nas propriedades sinápticas e na plasticidade. O estudo concentra-se na cognição motora e no aprendizado contextual em ratos treinados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Electrofisiologia
- Análise Comportamental
Contexto
- A técnica de patch clamp em fatias é fundamental para estudar a função sináptica.
- A cognição motora pode ser avaliada utilizando o teste do bastão rotatório.
- A aprendizagem contextual é avaliada por meio de testes de evitação inibitória.
- Compreender a plasticidade sináptica é essencial para obter insights sobre os mecanismos de aprendizagem.
Objetivo do Estudo
- Analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado em ratos.
- Comparar as propriedades sinápticas entre animais treinados e não treinados.
- Investigar o mecanismo neurológico da corrida motora.
Métodos Utilizados
- Teste do bastão rotativo para avaliação da aquisição de habilidades motoras.
- Teste de evitação inibitória para análise de memória contextual.
- Preparação de fatias cerebrais e registros de patch clamp.
- Técnicas de clampagem de corrente e voltagem para análise da atividade sináptica.
Resultados Principais
- Dois dias de treinamento melhoraram significativamente o desempenho da habilidade motora.
- Ratos treinados exibiram propriedades sinápticas aprimoradas em comparação com ratos não treinados.
- Dados de registro em clamping de corrente mostraram aumento da atividade de disparo em ratos treinados.
- Resultados de clamping de voltagem indicaram alterações nas correntes pós-sinápticas miniaturas.
Conclusões
- O estudo confirma a eficácia da técnica de patch clamp em fatias.
- O treinamento melhora tanto as habilidades motoras quanto a plasticidade sináptica.
- Esses achados contribuem para a compreensão da base neural da aprendizagem.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A técnica de patch clamp em fatias permite a medição direta de alterações induzidas pelo aprendizado na excitabilidade neuronal e na força sináptica, fornecendo subsídios mecanicistas sobre a adaptação de circuitos neurais. Essa abordagem auxilia na validação de alvos no descobrimento de fármacos em neurociência, associando fenótipos comportamentais a fenótipos celulares e sinápticos. Ela aumenta a confiança preditiva no estágio inicial do descobrimento, reduzindo os riscos associados às hipóteses sobre os efeitos de compostos em vias relacionadas à plasticidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de alterações no potencial de repouso da membrana, no limiar de disparo e na resistência da membrana em neurônios treinados versus não treinados.
- Valor Científico: Esclarece o envolvimento de vias ao demonstrar aumentos na atividade de disparo induzidos pela aprendizagem em neurônios piramidais da camada II/III do córtex motor.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao quantificar a plasticidade sináptica em sinapses excitatórias e inibitórias em neurônios do hipocampo CA1 após aprendizagem contextual.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados (fatias cerebrais agudas) para avaliação posterior dos efeitos de compostos sobre propriedades neuronais intrínsecas e sinápticas.
- Valor Científico: Permite a padronização de ensaios por meio da gravação sequencial de mEPSCs e mIPSCs a partir do mesmo neurônio, reduzindo a variabilidade nas medições de força sináptica.
- Valor Científico: Fornece resultados quantitativos (amplitude e frequência de correntes pós-sinápticas) que apoiam a avaliação confiável de compostos em campanhas de triagem fenotípica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a utilidade do sistema em doenças relevantes ao modelar a plasticidade induzida pelo aprendizado no córtex motor e no hipocampo, regiões relacionadas a distúrbios cognitivos e motores.
- Valor Científico: Garante a continuidade translacional do treinamento comportamental (rotor-rod, evitação inibitória) até leituras celulares, apoiando a validação de alvos baseada em mecanismos.
- Valor Científico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar compostos que normalizam a hiperatividade induzida pelo aprendizado ou o desequilíbrio sináptico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A técnica integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, especialmente para alvos que modulam a excitabilidade neuronal ou a transmissão sináptica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da comparação das propriedades neuronais entre animais submetidos a treinamento comportamental e animais ingênuos, a fim de validar o engajamento do alvo.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios mediante gravações estáveis e reprodutíveis de patch clamp em modo de célula inteira em fatias agudas, permitindo a análise de resposta à dose de compostos em teste.
- Análise: Gera parâmetros-chave, incluindo contagem de potenciais de ação, potencial de repouso, resistência da membrana e amplitude/frequência de mEPSC/mIPSC, para quantificar respostas neuronais e sinápticas.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica ao associar alterações sinápticas induzidas pelo aprendizado a possíveis biomarcadores de disfunção de circuitos em modelos de doenças neuropsiquiátricas.
- Reutilização Corporativa: Atua como uma plataforma eletrofisiológica reutilizável, aplicável a diversas regiões cerebrais (por exemplo, córtex sensorial, amígdala) e paradigmas de aprendizagem, maximizando o aproveitamento dos recursos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista sobre como a aprendizagem altera a função neuronal e sináptica.
- Valor Operacional: Promove a padronização por meio de protocolos definidos de preparo de fatias, perfusão e gravação que aumentam a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao fornecer evidência eletrofisiológica direta de efeitos mediados pelo alvo em vias de plasticidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos que revertam a plasticidade patológica sem perturbar a função basal.
Considerações sobre a Implementação
- Exige expertise em eletrofisiologia, corte de tecido cerebral e neurociência comportamental para garantir a qualidade dos dados e sua interpretação.
- Depende de instrumentação, incluindo vibratomos, amplificadores para registro por patch clamp, sistemas de perfusão e microscopia infravermelha com contraste de interferência diferencial (infrared-DIC), para o preparo adequado dos cortes e registros.
- Necessita padronização entre equipes envolvendo comportamento, histologia e eletrofisiologia, a fim de alinhar os paradigmas de treinamento com o tempo de coleta dos cortes e o direcionamento das regiões cerebrais.
- Requer considerações de adaptação ao aplicar a técnica a diferentes regiões cerebrais ou tipos de neurônios, como o ajuste da orientação dos cortes ou da composição da solução intracelular.
- É limitado pela natureza aguda dos cortes de tecido cerebral, o que restringe estudos longitudinais, mas preserva a conectividade nativa para análises mecanicistas ex vivo.
