Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem
November 11th, 2017
A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.
Olá, meu nome é Dai Mitsushima. Aqui, mostraremos como fazer fatias de cérebro em animais treinados, comparando os dados do patch clamp em animais não treinados. Podemos analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado.
Olá, meu nome é Hiroyuki Kida. Neste experimento, investigamos o neuromecanismo do funcionamento do motor usando o teste da haste do rotor. O teste da haste do rotor é amplamente utilizado para avaliar a cognição motora de roedores.
A vantagem deste método é que podemos alterar o nível de descoberta durante o teste, aumentando a velocidade do rotador. Teste da haste do rotor. Antes da tarefa do motor, o aparelho da haste do rotor deve ser ajustado para o modo de aceleração de 4 a 40 rpm em 300 segundos.
Os ratos foram feitos para realizar dez tentativas para cada teste. No intervalo de tempo entre as tentativas foi de 30 segundos. Durante a primeira sessão de treinamento, os ratos geralmente caem da vara, mesmo em baixas velocidades e às vezes andam na direção errada.
Depois de repetir o treinamento, no entanto, o rato pode andar em uma velocidade mais alta. Ao medir a latência na haste, podemos estimar o desempenho de aprendizado da habilidade do rato. Aqui podemos ver os resultados do teste da haste do rotor.
Conforme mostrado nesta figura, dois dias de treinamento são suficientes para adquirir a habilidade motora. Em comparação com a latência na primeira tentativa, a análise post hoc mostrou melhora significativa na tentativa final dos dias de treinamento. Ao medir a latência na haste, podemos estimar o desempenho de aprendizado da habilidade do rato.
A seguir, mostraremos um teste de evitação inibitória. Este teste é útil na análise do desempenho da aprendizagem contextual. O aparelho de prevenção inibitória consiste em lados claros e escuros separados por um alçapão.
Durante a sessão de treinamento, os ratos são colocados na área iluminada e recebem um curto período de tempo para se aclimatarem ao ambiente. Uma vez que a porta se abre, os ratos estão livres para entrar na área escura à vontade. Ao entrar na área escura, a porta é fechada e os ratos recebem um leve choque elétrico por dois segundos.
Depois de serem devolvidos às suas gaiolas por 30 minutos após a conclusão do teste, os ratos são colocados novamente na área iluminada do aparelho. Trinta minutos após o choque, os ratos treinados mostraram consistentemente uma latência mais longa antes de entrar na área escura. Aqui podemos ver os resultados do teste de evitação inibitória.
Após o choque elétrico, os ratos aprenderam a evitar a área escura e ficar do lado iluminado, o que eles não prefeririam normalmente. Essa tendência de evitar o lado escurecido indica a aquisição de memórias contextuais. Fatias cerebrais pós-treino.
Antes da incisão, resfriamos todas as tesouras, hemostáticos e copos com gelo picado. Aqui você pode ver nossa preparação para dissecação. A dissecção cerebral deve ser realizada o mais rápido possível.
Depois de profundamente anestesiado, o rato é colocado em uma bandeja rasa com gelo picado e uma incisão é feita para abrir a cavidade abdominal. Após a incisão do diafragma, é feita uma nova incisão lateral. Para abrir a cavidade torácica, a cartilagem costal deve ser fechada com um hemostático.
Após a exposição do coração, uma agulha de aço inoxidável calibre 18 é inserida na parte posterior do ventrículo esquerdo. A ponta da agulha deve ser visível através da parede da aorta. Após o corte da aurícula direita, inicia-se a perfusão.
Certifique-se de que a agulha e a seringa sejam primeiro preenchidas com tampão de dissecção gelado gaseado. Quaisquer bolhas de ar também devem ser removidas antes da perfusão. Primeiro, corte na parte posterior do crânio.
Em seguida, faça um corte lateral, seguido de um corte central para expor o cérebro. Após a dissecação, o cérebro deve ser colocado em um tampão gelado borbulhante por cinco minutos. Antes de prosseguir com a dissecação, o papel de filtro deve ser molhado com tampão gelado.
Em seguida, o cérebro é colocado em um palco de aço inoxidável gelado. O ângulo do estágio de corte é crucial para garantir um ângulo de corte correto para a fatia do cérebro. Um ângulo incorreto poderia potencialmente cortar os neurônios piramidais alvo.
Após o corte, uma gota de supercola deve ser colocada no palco do vibratone. Para garantir uma adesão firme, o excesso de tampão de dissecção deve ser removido usando um pedaço de papel de filtro. Usando o vibratone, fatias finas de cérebro podem ser mantidas em um tampão gelado borbulhante.
Nossa área-alvo é o córtex motor primário. A área alvo do cérebro pode ser aparada usando uma tesoura de íris. A câmara de interface pode ser feita usando um recipiente de plástico para alimentos.
A tampa da câmara de interface é necessária para conter o gás. As fatias são observadas usando um microscópio infravermelho-DIC. Aqui podemos ver um exemplo de neurônios da camada 2/3 no córtex motor primário.
As pipetas de registo de adesivos são preenchidas com a solução intracelular adequada. A solução para a análise do alicate de corrente é diferente da análise do alicate de tensão. Resultados representativos.
A técnica de pinça de corrente é útil para analisar as propriedades intrínsecas da célula. Após o treinamento da haste do rotor, conseguimos obter os dados da pinça de corrente dos neurônios da camada 2/3 no córtex motor primário. O painel A indica traços típicos induzidos por injeções de corrente.
O painel B indica a relação entre a corrente injetada e o número de picos. Ratos treinados em um dia induziram menos picos, enquanto ratos treinados em dois dias induziram muito mais picos do que ratos não treinados. Como pode ser visto nos painéis inferiores, os ratos treinados em um dia exibiram menor potencial de repouso, maior limiar de pico e pós-hiperpolarização mais profunda.
Ratos treinados por dois dias exibiram maior potencial de repouso e resistência à membrana. A técnica de grampo de tensão é útil para analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado. Aqui, podemos ver dados de neurônios CA1 após o treinamento contextual.
Obtivemos correntes pós-sinápticas em miniatura de neurônios CA1 induzidas por vesículas únicas de glutamato ou GABA. Os painéis A e B mostram traços representativos de corrente pós-sináptica em miniatura. Na presença de Tetrodotoxina, EPSCs em miniatura a menos 16 milivolts e IPSCs em miniatura a zero milivolts foram medidas sequencialmente nos mesmos neurônios.
O painel C mostra gráficos bidimensionais das amplitudes EPSC em miniatura e IPSC em miniatura em ratos não treinados, treinados, não pareados e walk-through. O painel D mostra os gráficos para as frequências em miniatura. Como pode ser visto nos painéis inferiores, os treinamentos contextuais fortaleceram significativamente as sinapses excitatórias e inibitórias, promovendo a diversidade de entradas sinápticas para os neurônios.
Em resumo, a técnica de pinça de corrente é útil para analisar mudanças induzidas por aprendizado na propriedade celular. Além disso, a técnica de clamp de voltagem é uma ferramenta poderosa para analisar a plasticidade induzida pelo aprendizado em sinapses excitatórias e inibitórias. Os resultados detalhados dessas análises podem ser encontrados nas publicações a seguir.
Visão Geral
Este artigo demonstra a técnica de slice patch clamp para analisar mudanças induzidas pelo aprendizado nas propriedades sinápticas e plasticidade. O estudo concentra-se na cognição motora e aprendizagem contextual em ratos treinados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrofisiologia
- Análise Comportamental
Fundo
- A técnica de slice patch clamp é crucial para estudar a função sináptica.
- A cognição motora pode ser avaliada usando o teste da haste rotativa.
- A aprendizagem contextual é avaliada através de testes de evitação inibitória.
- Entender a plasticidade sináptica é essencial para insights sobre os mecanismos de aprendizagem.
Propósito do Estudo
- Analisar a plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado em ratos.
- Comparar as propriedades sinápticas entre animais treinados e não treinados.
- Investigar o neuromecanismo da corrida motora.
Métodos Utilizados
- Teste da haste rotativa para avaliação da aquisição de habilidades motoras.
- Teste de evitação inibitória para análise de memória contextual.
- Preparação de fatias cerebrais e registros de patch clamp.
- Técnicas de clamp de corrente e voltagem para analisar a atividade sináptica.
Principais Resultados
- Dois dias de treinamento melhoraram significativamente o desempenho das habilidades motoras.
- Ratos treinados exibiram propriedades sinápticas aprimoradas em comparação com ratos não treinados.
- Os dados de clamp de corrente mostraram aumento na atividade de picos em ratos treinados.
- Os resultados do clamp de voltagem indicaram mudanças nas correntes pós-sinápticas miniaturas.
Conclusões
- O estudo confirma a eficácia da técnica de slice patch clamp.
- O treinamento melhora tanto as habilidades motoras quanto a plasticidade sináptica.
- Esses achados contribuem para a compreensão da base neural do aprendizado.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
