Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

O objetivo geral deste método é determinar o potencial inibitório de HDAC de compostos e identificar a seletividade para HDAC6 ou HDAC1 em células usando um único ensaio de espectrometria de massa de cromatografia líquida de ultra alta eficiência. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de descoberta de medicamentos, como determinar se um inibidor de HDAC é seletivo para HDAC6 em relação a HDACs de Classe I em células vivas. A principal vantagem dessa técnica é que ela requer uma única etapa de incubação com células, inibidores e substratos seletivos para determinar a potência contra duas isoformas de HDAC simultaneamente.

A implicação dessa técnica se estende à descoberta precoce de medicamentos de inibidores seletivos de HDAC, pois detecta se a seletividade de HDAC6 é mantida em células vivas, evitando ensaios de acetilação de proteínas endógenas. Embora este método avalie a seletividade dos inibidores de HDAC em células HeLa, ele também pode ser aplicado a outras linhagens celulares, como células primárias e outras células tumorais, incluindo espécimes clínicos. Cultive células HeLa a 80% de confluência em um frasco de cultura de células T75 em meio essencial mínimo suplementado com 10% de soro bovino fetal, penicilina G e estreptomicina.

Lave as células duas vezes com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. Em seguida, aspire o tampão e adicione um mililitro de reagente de dissociação celular. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos para separar as células.

Após cinco minutos, adicione nove mililitros de meio de cultura MEM às células e ressuspenda completamente a suspensão celular. Transfira as células para um novo tubo de 15 mililitros e conte as células usando um hemocitômetro. Ajuste a densidade da suspensão celular para 60.000 células por mililitro em MEM.

Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão celular aos poços de controle e teste de uma placa de 96 poços estéril, de fundo plano, tratada com cultura de tecidos. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura MEM aos poços em branco da placa de 96 poços. Incube a placa de 96 poços a 37 graus Celsius por 24 horas.

Aspirar o meio dos poços da placa de 96 poços. Ao aspirar o meio, evite desprender e remover as células do poço. Isso pode ser conseguido usando uma baixa taxa de aspiração e colocando cuidadosamente as pontas de aspiração no canto inferior da superfície do poço.

Em seguida, adicione 25 microlitros dos compostos de teste de duas vezes em MEM aos poços de teste, incluindo Tricostatina A, MS275 e Tubvastatina A. Adicione 25 microlitros de MEM aos poços de controle e brancos. Em seguida, adicione 25 microlitros da mistura de substrato aos poços de controle e teste. Em seguida, adicione 25 microlitros de MEM aos poços em branco.

Incube a placa de 96 poços a 37 graus Celsius por oito horas em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono. Para realizar a lise celular, primeiro adicione 10 microlitros de tampão RIPA seis vezes suplementado com inibidor de protease a cada poço da placa de 96 poços. Pare a reação adicionando 160 microlitros de acetonitrila fria a cada poço e misture pipetando para cima e para baixo.

Coloque o prato em um freezer de 80 graus Celsius negativos por 10 minutos. Retire a placa do freezer e transfira 220 microlitros do conteúdo de cada poço para uma placa de fundo cônico não estéril de 96 poços. Centrifugar a placa a 5 000 vezes g e quatro graus Celsius durante 10 minutos.

Após a centrifugação, transfira 200 microlitros de sobrenadante para uma placa de 96 poços compatível com o sistema UHPLC. Em seguida, sele a placa com uma folha de selagem a quente destacável usando um selador de placas. Prepare o sistema de espectrometria de massa de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência, preenchendo-o com o sistema de fase móvel.

Coloque a placa de 96 poços em um gerenciador de amostras contendo um suporte de placa. Execute as amostras de acordo com as condições UHPLC ESI MS/MS encontradas no texto. Para realizar a análise de dados, integre a área do pico de cada substrato e seu produto desacetilado com o software de integração UHPLC apropriado.

Para cada substrato, calcular a razão da área de pico do desacetilado para o acetilado em cada cromatograma. Inclua as amostras de teste e controle. Finalmente, calcule a porcentagem de inibição de HDAC de cada amostra de teste de acordo com a equação no protocolo de texto.

O cromatograma UHPLC-MS de uma amostra é apresentado aqui. Os picos correspondentes aos substratos adicionados às células são detectados de acordo com suas transições de massa, conforme descrito na tabela um do protocolo escrito. O MOCPAC é desacetilado pelo HDAC1 para fornecer o pico do MOCPAC desacetilado.

Da mesma forma, o BATCP é desacetilado pelo HDAC6 para fornecer o pico de BATCP desacetilado. Finalmente, o MAL fornece o pico de MAL desacetilado, que reflete a desacetilação de vários HDACs endógenos de forma inespecífica. Mostrada aqui, foi realizada a figura com o cromatograma obtido com diferentes concentrações do inibidor de HDAC Trichostatin A.A avaliação da resposta à dose dos inibidores padrão de HDAC.

Os valores integrados obtidos de MOCPAC e dMOCPAC foram usados para calcular a potência dos inibidores padrão contra HDAC1. Após os cálculos do IC 50, o MS275, um inibidor seletivo de HDAC de Classe I, mostrou valores mais baixos de IC 50 para HDAC1 do que a tubvastatina A, um conhecido inibidor de HDAC6. Por outro lado, os valores isolados de BATCP e dBATCP foram utilizados para calcular a potência dos padrões em relação ao HDAC6.

Desta vez, a tubvastatina A forneceu um valor de IC 50 menor do que o MS275, confirmando seu perfil de seletividade de isoforma. A tricostatina A é um inibidor potente e não seletivo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 72 horas se for realizada corretamente, incluindo o tempo de tratamento celular e a análise da placa de 96 poços.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os tempos de incubação indicados aqui são para células HeLa. Se outra linhagem celular for usada, isso precisa ser otimizado. Seguindo este procedimento, a atividade inibitória seletiva de HDAC de outras isoformas pode ser medida desde que existam substratos específicos.

Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos e outros produtos químicos pode ser extremamente perigoso e óculos de proteção, luvas e jaleco devem sempre ser usados durante a execução deste procedimento.