Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.

Meu nome é Devrim Gozuacik. Estamos trabalhando na Universidade Sabanci, Istambul, Turquia, na regulação da autofagia em mamíferos. Estamos nos concentrando em diferentes proteínas, vias, RNAs que regulam a autofagia.

Existem várias técnicas para estudar a autofagia. Estamos usando técnicas de biologia molecular, bioquímica e biologia celular para analisar diferentes caminhos que estamos descobrindo. Estamos usando técnicas de imunoprecipitação, imunofluorescência, microscopia confocal e várias outras técnicas para analisar as vias de autofagia.

Detalhes de diferentes técnicas e armadilhas e solução de problemas serão explicados pelo meu aluno de doutorado, Secil Erbil. O objetivo geral dos procedimentos de imunofluorescência e imunoprecipitação é monitorar as interações proteína-proteína endógenas em uma célula. Este método pode ajudá-lo a responder às principais perguntas sobre as interações proteína-proteína e a localização celular delas.

A principal vantagem dessas técnicas é a oportunidade de quantificar a intensidade da interação durante os tratamentos e condições desejados em comparação com o controle. Para começar, separe as células com tripsina. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro e calcule a concentração celular.

Pegue as lâminas de cobertura embaladas e autoclavadas e coloque-as em uma placa de Petri de 10 centímetros. Se você estiver trabalhando com uma linha celular de fácil descolamento, como HEK293T, como neste experimento, cubra as lâminas de cobertura com solução de poli-L-lisina 0,01% filtrada estéril. Após 10 minutos de incubação, remova a solução.

Espere até que toda a poli-L-lisina evapore e as lâminas de cobertura fiquem completamente secas. Em seguida, lave-os com PBS estéril. Coloque um mililitro de mídia em uma placa de 12 poços e coloque as lâminas de cobertura em cada poço.

Semeie 20.000 células por poço. É importante agitar a placa durante e após a inoculação para ter uma distribuição homogênea das células nas lâminas de cobertura. Trate suas células com o medicamento desejado e seu controle de forma que o tempo total de incubação das células não exceda 48 horas.

Ao final de 48 horas, remova a mídia nas lâminas de cobertura e lave as células uma vez com PBS. Em seguida, sob uma capela de exaustão, remova o PBS e fixe as células incubando-as com 4% de PFA por 20 minutos em temperatura ambiente. Como o PFA é sensível à luz, cubra a placa com papel alumínio durante o tempo de incubação.

Em seguida, remova o PFA e lave as amostras três vezes com PBS. Nesta etapa, é importante lavar as amostras uma a uma para não secá-las. Em seguida, rotule uma placa de seis poços de acordo com suas condições de tratamento e cubra cada poço com Parafilm.

Nesta etapa, preste atenção para ter um fundo liso após a cobertura do Parafilm. Em seguida, coloque as lâminas de cobertura em uma placa de seis poços e coloque 100 microlitros de mistura de BSA-saponina em cada lâmina de cobertura e incube-as por 30 minutos no gelo para bloquear. Em seguida, remova a solução de bloqueio e lave as amostras uma vez com PBS.

Prepare um a 100 anticorpos primários na mistura BSA-saponina e coloque 100 microlitros desta solução em cada lâmina de cobertura. Incube uma hora em temperatura ambiente. Durante a incubação, é melhor agitar a placa para ter uma distribuição igual do anticorpo nas lâminas de cobertura.

Em seguida, remova o anticorpo primário e lave as amostras três vezes com PBS. Prepare um a 500 anticorpos secundários Alexa Fluor na mistura BSA-saponina e coloque 100 microlitros desta solução em cada lâmina de cobertura. Como o Alexa Fluor é sensível à luz, é importante manter as amostras no escuro após esta etapa.

Portanto, cubra a placa de seis poços com papel alumínio e incube-a por uma hora em temperatura ambiente no shaker. Em seguida, remova o anticorpo secundário e lave as amostras três vezes com PBS. Rotule as lâminas com os nomes dos tratamentos e limpe-as com etanol usando Kimwipes.

Em seguida, coloque 10 microlitros de solução de montagem no meio de cada lâmina. Com uma pincette, coloque cada lâmina de cobertura nas lâminas. Em seguida, pegue a quantidade excessiva de solução de montagem com cuidado usando Kimwipe.

Primeiro, estabilize cada lâmina de cobertura com quatro gotas de esmalte. Em seguida, sele completamente a corrediça da tampa. Analise a amostra usando um microscópio confocal.

Aqui você vê um exemplo de resultado de colocalização obtido usando este protocolo recuperado de nosso artigo recente. Neste vídeo, a proteína endógena RACK1 foi corada com verde, enquanto a LC3 endógena foi corada com vermelho. Os pontos amarelos que ocorrem nas imagens de mesclagem são os locais onde os sinais verde e vermelho se sobrepõem.

Em outras palavras, os pontos amarelos representam a colocalização dessas duas proteínas. A imunoprecipitação é outro método comumente usado para estudar as interações proteína-proteína. Para começar, semeie quatro milhões de células HEK293T em placas de Petri de 15 centímetros para cada condição.

Trate as células com os medicamentos desejados de forma que o tempo total de incubação das células não exceda 48 horas. Após 48 horas de incubação, colha as células com PBS gelado. HEK293T células se desprendem facilmente da placa.

Portanto, lavar a placa com PBS pipetando é suficiente para separar e colher todas as células. Colete suas células em tubos Eppendorf e centrifugue-as por 15 minutos na velocidade máxima a quatro graus. Em seguida, descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com um mililitro de PBS, ressuspendendo-o por pipetagem.

Em seguida, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em tampão RIPA contendo inibidores de protease. Vortex a suspensão por 15 segundos e mantenha o tubo Eppendorf no gelo por cinco minutos.

Repita o vórtice cinco vezes, uma vez em cinco minutos. Em seguida, centrifugue a amostra na velocidade mais alta por 15 minutos a quatro graus. Em seguida, pegue o sobrenadante e centrifugue novamente para se livrar completamente dos detritos celulares.

Dilua os lisados de proteína de um a 50 e prepare uma placa de 96 poços com o branco, os padrões e as amostras diluídas. Misture-os com a solução de Bradford na proporção de um para 20, espere 15 minutos no escuro, meça a densidade óptica em 595 milímetros e calcule a concentração de proteína usando valores de absorbância para cada amostra. Em seguida, prepare os grânulos para o acoplamento de anticorpos.

Corte a borda de uma ponta de 200 microlitros usando uma tesoura e retire 25 microlitros da pasta de esferas para cada condição. Lave as esferas uma vez com PBS, uma vez com tampão RIPA e uma vez com tampão RIPA contendo inibidores de protease. Após a última lavagem, ressuspenda as esferas em 300 microlitros de tampão RIPA contendo inibidores de protease e adicione 1,5 micrograma de anticorpo específico para a proteína que você deseja retirar.

Incube o anticorpo e a mistura de grânulos durante a noite a quatro graus no rotador. Após a incubação, lave as esferas com tampão RIPA contendo inibidores de protease e carregue dois miligramas de lisado celular total de cada condição. Encha o volume total de até 300 microlitros com tampão RIPA contendo inibidores de protease e incube-os durante a noite no rotador a quatro graus.

Em seguida, lave as esferas três vezes com tampão RIPA contendo inibidores de protease. Após a última lavagem, usando uma pipeta menor, tente retirar todo o sobrenadante sem tocar nas contas. Em seguida, adicione 10 microlitros de corante de carregamento 3X.

Para controlar a expressão endógena de proteínas que serão verificadas no experimento de co-imunoprecipitação, prepare amostras de entrada usando pelo menos 100 microgramas de lisado de proteína. Adicione o volume apropriado de corante de carga 3X em cada amostra. Para desnaturar amostras de controle IP e de entrada, ferva-as a 95 graus por 10 minutos.

Em seguida, gire para baixo e carregue as amostras no gel SDS para separar as proteínas de acordo com seu tamanho, realizando western blot. Passe as amostras de proteína pelo gel SDS e, em seguida, transfira as proteínas para as membranas de nitrocelulose. Após a transferência úmida, seque a membrana de nitrocelulose enquanto a incuba com solução de leite desnatado a 5% por uma hora em temperatura ambiente no shaker.

Em seguida, lave a membrana três vezes em solução PBS-Torin por cinco minutos no agitador à temperatura ambiente. Incube a membrana no anticorpo primário que é específico para a proteína que você deseja detectar por uma hora em temperatura ambiente. Você pode preferir preparar anticorpos primários em solução vermelha para reutilizá-los sem perder sua qualidade.

Após a incubação primária do anticorpo, repita as etapas de lavagem do PBS-Torin três vezes. Em seguida, prepare a solução de anticorpos secundários conjugados com HRP em leite desnatado a 5% e incube com a membrana por uma hora em temperatura ambiente no agitador. Após a incubação, repita novamente as etapas de lavagem.

Em seguida, prepare a solução caseira de ECL e coloque a membrana em um. Em seguida, continue desenvolvendo suas etapas de fixação, conforme descrito no texto em um diagrama completo. Após fixar e secar o filme, marque de acordo com as bordas da membrana e a letra da proteína para poder prever a banda específica.

Repita todas essas etapas de incubação de anticorpos seguidas de procedimentos de câmara escura para todas as proteínas que você deseja verificar quanto à interação. Em seguida, analise os resultados. Aqui você vê um resultado de imunoprecipitação endógena recuperado de nosso artigo recente.

Neste vídeo, a proteína ATG5 endógena foi precipitada e os níveis de co-imunoprecipitação endógena de RACK1 foram verificados em diferentes condições. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de ter o máximo possível de repetições biológicas com controles positivos e negativos, a fim de coletar os níveis de interação quantificados em diferentes tratamentos. O quadro geral que todas as réplicas biológicas fornecem é definido como o padrão de interação sob diferentes condições.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como pesquisar a dinâmica das interações proteína-proteína.