Name: Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Aprenda técnicas de imunofluorescência e imunoprecipitação para estudar interações proteína-proteína em mamíferos. Este método ajuda pesquisadores a identificar componentes de vias de sinalização celular.

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Este trabalho foi financiado pelo científico e tecnológico pesquisa Conselho da Turquia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, da Universidade Sabanci. SEB e NMK são suportados por uma bolsa TUBITAK BIDEB 2211 para estudos de doutorado.

1. imunofluorescência <ol><li>HEK293T manter rim embrionário humano células em meio de glicose alta DMEM, e pilhas de neuroblasto N2A do rato em DMEM baixa média de glicose, em um 5% CO 2-umidificada incubadora a 37 ° C. Complementar os meios de cultura com soro bovino fetal 10% inactivadas pelo calor (FBS), antibióticos (50 U/mL penicilina, estreptomicina 50 de µ g/mL) e L-glutamina (2mm).</li>
	<li>Separar as células usando a tripsina 0,25%. Primeiro remova a mídia de cultura celular e depois lavar as células com 10 mL estéril fosfato salino (PBS) e incube com 1 mL de tripsina a 37 ° C por 5 min. inativar tripsina, adicionando 2 mL de meio de DMEM.</li>
	<li>Lavar a placa bem pipetando. Remover 10 µ l de solução de célula e misturá-lo com 10 µ l de trypan azul. Contar o número de células vivas, usando um hemocytometer.</li>
	<li>Ambos HEK293T e N2A é linhas de células aderentes, no entanto, as células HEK293T desanexar da placa facilmente. Portanto, se trabalhar com linha de celular HEK293T, casaco do coverslides com estéril filtrados 0,01% poli-L-lisina antes da semeadura das células.
	<ol><li>Lugar coverslides estéril em uma placa de Petri de 10 cm. Adicione a quantidade apropriada de solução de poli-L-lisina sobre cada coverslide. Incubar a coverslides com solução de poli-L-lisina durante 10 min.</li>
		<li>Remover a solução de poli-L-lysine. 
		Nota: Poli-L-lisina é re-utilizável; é opcional coletar e reutilizá-la para novas experiências. Desde que a poli-L-lisina é tóxico, esperar até que todos da solução sobre o coverslides completamente evapora e recuperar o poli-L-lisina.</li>
		<li>Lavar o coverslides com PBS estéril.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 1 mL de DMEM em cada poço de uma placa de 12. Coloque um coverslide em cada poço.</li>
	<li>Semente 20.000 células/poço, gota a gota, agitando a placa ao mesmo tempo para uma distribuição homogênea de células sobre o coverslides. Manter as células no CO 2 incubadora a 37 ° C e adicionar a droga para que o tempo de incubação no total não ultrapasse 48 h, ou seja, para 3h tratamento Torin, adicionar a droga na semeadura de post 45 h.
	Estudos de interação de <ol><li>para RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina e fome foram usados como indutores de autofagia. As células foram incubadas com 1 Torin para 3h (concentração final nM 250); com rapamicina para 16 h (concentração final nM 200); e com Earle &#39; s Balanced Salt solução (EBSS) por 2h para células de fome. 
		Nota: Incubação em DMEM com 10% FBS foi usado como a condição de controle.</li>
	</ol></li> <li>Após 48 h de tempo de incubação total, remova a mídia sobre a coverslides e lave-os com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Para consertar as células, Incube as celulas com 1 mL gelo frio estéril filtrada 4% paraformaldeído (PFA) em 1X PBS (pH 7,4), por 20 min em temperatura ambiente sem qualquer agitação. 
	Desde que o PFA é sensível à luz, manter (importante) a placa no escuro durante o período de incubação; pode ajudar a cobrir o prato com papel alumínio. Além disso, PFA é tóxico, portanto, trabalhar sob uma coifa ao reparar as células. 
	Nota: Tenha em mente que a fixação passo em experimentos de imunofluorescência deve ser otimizada, como os anticorpos específicos podem funcionar melhor usando agentes de fixação diferentes e condições.</li>
	<li>Depois de 20 min de incubação de PFA, primeiro remova a solução PFA no coverslides e depois lavar cada amostra 3 vezes com 1 mL de PBS filtrado estéril. At esta etapa, (importante) lavar os poços, um por um, para não deixá-los secar. Evitar a secagem desde que irá interferir com reações subsequentes das células, alterar a morfologia da célula e aumentar os sinais inespecíficos.</li>
	<li>Quando a lavagem for concluída, mantenha as amostras em 1 mL de PBS na Ice.</li>
	<li>Preparar a solução de bloqueio: PBS com saponina de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% 0,1%.</li>
	<li>Cobrir uma placa de 6 com película de parafina. Certifique-se de que a placa inferior é suave após o revestimento de película de parafina. Rotular a placa 6.</li>
	<li>Usando uma pinça, o coverslides de transferência das placas 12-poços para as placas de 6-poços cobertos com a película de parafina.</li>
	<li>Descartar a PBS na coverslides e adicionar 100 µ l de solução para cada coverslide para permeabilização de bloqueio. Incubar as amostras no gelo por 30 min.</li>
	<li>Preparar o anticorpo primário em solução de bloqueio. Antes das experiências, otimizar as diluições de anticorpo para definir as melhores concentrações de trabalho para a coloração. 
	Nota: por exemplo, LC3 anticorpo é usado com uma diluição de 1: 100 em solução de bloqueio.</li>
	<li>Após a incubação de 30 min, descartar a solução de bloqueio e lavar as amostras delicadamente com 1 mL de PBS uma vez.</li>
	Adicione 100 µ l de solução de anticorpo primário para cada coverslide de <li>. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h, um agitador. 
	Nota: O tempo de incubação com o anticorpo primário deve ser otimizado. Dependendo o anticorpo, uma incubação overnight a 4 ° C pode ser preferível. É melhor incubar um agitador suavemente (100 rotações/min) para distribuir igualmente o anticorpo sobre o coverslides.</li>
	<li>Após a incubação com o anticorpo primário, lavar as amostras individualmente, 3 vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>1: 500 preparar anticorpo secundário no bloqueio de solução (otimizações de diluições do anticorpo secundário podem ser necessárias). Aqui, anti-coelho IgG Alexa Fluor 568 utilizou-se como um anticorpo secundário de anti-coelho.
	<ol><li>Incubar as amostras com a 100 µ l de solução anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente em um shaker. Uma vez que os anticorpos secundários fluoróforo-etiquetados são sensíveis à luz, (importante) manter a solução no escuro. Colocar as amostras no escuro durante e após a incubação do anticorpo secundário.</li>
	</ol></li> <li>Após a incubação do anticorpo secundário, lavar a placa 3 vezes com PBS. 
	Nota: Baed em experiência, alguns anticorpos têm sinais de fundo elevado que não podem ser eliminados pela PBS lava. Se lidar com tal um anticorpo, depois passo 1.21, manter as amostras em PBS a 4 ° C, durante 6 h pode ajudar.
	<ol><li>Se necessário, manchar as células com um corante de ligação a DNA, tais como a Hoechst, para marcar os núcleos.</li>
	</ol></li> <li>Para manchar mais do que uma proteína, aplicar o mesmo procedimento a partir da etapa 1.16 para a segunda proteína.
	<ol><li>Certifique-se que não há nenhuma reatividade de espécies entre os anticorpos ao realizar a coloração com mais de um anticorpo (por exemplo, uso do mouse e coelho anticorpos). 
		Nota: Aqui, RACK1 está manchada como a segunda proteína usando anti-RACK1 anticorpos primários e os secundários anticorpos IgG Alexa Fluor 488 anti-rato usando as mesmas concentrações acima mencionadas.</li>
	</ol></li> <li>Preparar a solução de montagem: 50% glicerol em 1X PBS. Filtrar com um filtro de 22 µm.</li>
	<li>Limpe as lâminas com etanol utilizando um cotão e adicionar solução de montagem 10 µ l de cada slide. Usando uma pinça, coloque o coverslides em cada dropso que o lado com as células está em contato direto com o meio de montagem. Descartar a solução de montagem excesso suavemente usando toalhetes fiapos.</li>
	<li>Selar o coverslides com um esmalte transparente. Primeiro, estabilizar o coverslides adicionando gotas de esmalte nas 4 bordas e depois selá-los completamente.</li>
	<li>Analisar as amostras sob um microscópio confocal ou fluorescente logo que possível, desde que o sinal fluorescente pode descorar depois de algumas horas.</li>
</ol> < classe p = "SaritaE_TITLE "&gt; 2. Imunoprecipitação <ol><li>desanexar e contagem das células como descritas nos passos 1.2 e 1.3.</li>
	<li>De se trabalhar com células HEK293T, sementes 4 milhões de células para cada condição em placas de Petri 15 cm. Se trabalhar com células N2A, sementes de 5 milhões de células em placas de Petri 15 cm. Incubar as células numa incubadora de CO 2 a 37 ° C até o final do experimento.</li>
	<li>Tratar as células com as drogas relevantes ou condições por um prazo definido para que o tempo de incubação total das células não exceda 48 h. 
	Nota: Para os testes de imunoprecipitação, neste estudo, as células foram tratadas por 3h com Torin 1 (250 nM), 16 h com rapamicina (200 nM) e 2 h com EBSS. DMEM com 10% FBS foi adicionado às células, como o controle.</li>
	<li>Após 48 h de tempo de incubação total, remova a mídia e as células da colheita. Desde HEK293T células desprender facilmente do prato, lavar a placa com gelo frio PBS pode ser adequado para a colheita. No entanto, as células N2A são mais resistentes ao desprendimento; Raspe a célula para ajudar a colher as células.
	<ol><li>Recolher todas as pilhas em tubos microcentrifuga.</li>
	</ol></li> <li>Amostras de centrífuga a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C. descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 1 mL de PBS por re-suspenso em pipetando.</li>
	<li>Repita a etapa de centrifugação, mas para a maior velocidade de centrifugação a 4 ° C, durante 15 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Buffer de ensaio de imuno-precipitação de rádio (RIPA) preparar antes de começar o experimento. 
	Nota: Existem 3 tipos de amortecedor de RIPA; escolha de acordo com a intensidade de interação das proteínas sendo investigado (ver fórmulas abaixo).
	<ol><li>Se houver uma interação da proteína-proteína forte, escolha o amortecedor de RIPA regular.</li>
		<li>Se a interação é fraca, escolha suave RIPA ou mais suave RIPA. 
		Nota: As receitas desses buffers são nas etapas a seguir. Todos os buffers que são usados em testes de imunoprecipitação devem ser complementados com inibidores de protease.
		<ol><li>Preparar o amortecedor de RIPA regular usando 1% NP-40, 150 mM NaCl, Deoxycholate do sódio de 0,5% e 0,1% sulfato dodecyl de sódio em 50 mM Tris de pH 8.</li>
			<li>Preparar suave RIPA Buffer usando Deoxycholate do 1% NP-40, 150 mM NaCl e 0,25% de sódio em 50 mM Tris de pH 7.5.</li>
			<li>Preparar o amortecedor de RIPA mais suave usando 1% Triton X 100, 137 mM de NaCl, 1% de glicerol e 1mm ortovanadato de sódio em 50 mM Tris de pH 7,4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Depois de escolher o amortecedor RIPA apropriado, complementar o buffer com inibidores de protease (RIPA +). Em seguida, lisar as células com 3x o volume do centrifugado em RIPA +.</li>
	<li>Vortex a suspensão por 15 s. mantê-lo no gelo por 5 min. repetir o vórtice e confeiteiro 5 vezes e então Centrifugar as amostras a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga e centrífuga para remover os resíduos de célula remanescente. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo.</li>
	<li>Diluir a proteína lysates 01:50 e prepara uma placa de 96 poços com espaço em branco e padrões. Diluir as amostras.
	<ol><li>Amostras de mistura com Bradford solução 01:20. Incube por 15 min no escuro.</li>
		<li>Medir a densidade óptica em comprimento de onda de 595 nm. Calcular a concentração de proteína usando valores de absorvância para cada amostra.</li>
	</ol></li> <li>o dia antes da colheita das células, casal mais grânulos de proteínas com anticorpos que são específicos para a proteína de interesse.
	<ol><li>Cortar a borda de uma ponta de 200 µ l com uma tesoura e use 25 µ l de chorume o talão para cada condição.</li>
		<li>Lave os grânulos de uma vez com 1 mL de PBS, uma vez com 1 mL de tampão RIPA e uma vez com 1 mL RIPA +. Realizar as etapas de lavagem a 3.300 x g, 4 ° C, durante 1 min.</li>
		<li>Após a última lavagem, adicione 300 µ l de RIPA + sobre as contas e adicione 1,5 µ g anticorpo é específico para a proteína a ser puxado para baixo.</li>
		<li>Incubar os tubos a noite a 4 ° C, em rotacao (20 rotações/min). 
		Nota: Aqui, ATG5 era immunoprecipitated usando anticorpos específicos anti-ATG5.</li>
	</ol></li> <li>Após a incubação overnight de grânulos com o anticorpo, lave os grânulos de uma vez com PBS, uma vez com a RIPA e uma vez com RIPA + conforme descrito na etapa 2.12.2.</li>
	<li>Adicionar 2 mg de proteína lisada em grânulos para cada condição e completa o volume total de 300 µ l com RIPA + tubo de buffer /. Incubar os tubos durante a noite em um rotador a 4 ° C.</li>
	<li>Após a incubação, lave os grânulos como descritos anteriormente (etapa 2.12.2).
	<ol><li>Após a última lavagem, use a ponta da pipeta menor para remover todo o sobrenadante sem tocar os grânulos.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de 3 x tintura de carregamento: 6% SDS, 30% de glicerol, 16% β-Mercaptoetanol e azul de bromofenol 0,1% em 1M Tris-HCl pH 6,8.</li>
	</ol></li> <li>Preparar os controles de entrada usando o mínimo de 100 µ g proteína lisada para cada condição. Equalizar os volumes de amostra usando a água e adicionar o volume apropriado de 3x carregando tintura.</li>
	<li>Amostras de ferver a 95 ° C por 10 min. 
	Nota: Normalmente quando ferver as amostras, as tampas dos tubos podem abrir espontaneamente e amostras são perdidas. Evitar isto mantendo as tampas fechadas com um bloqueador específico cap.</li>
	<li>Spin para baixo as amostras e carga em geles de SDS-PAGE para separar as proteínas de acordo com seus tamanhos usando protocolos padrão. 
	Nota: Neste estudo sobre RACK1 e ATG5, as amostras foram executadas através de géis de poliacrilamida 12% em 80 V por 30 min e depois em 120 V para aproximadamente 90 min. No entanto, por mais pequenas proteínas tais como LC3, usar géis de poliacrilamida de 15% é mais adequado.</li>
	<li>Após o gel executando completo, transferir as proteínas para nitrocelulose ou membranas PVDF usando qualquer um dos métodos transferência molhada ou semi-seca. Em seguida, bloquear as membranas de incubação no leite desnatado de 5% em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) à temperatura ambiente para membranas de 1 h. lavagem 3 vezes com PBST 5 min.</li>
	<li>Incuba as membranas com anticorpos primários em concentrações de trabalho por 1h à temperatura ambiente. Para diluições de anticorpo primário, use BSA contendo soluções vermelhas (5% BSA Cohn V fração, 0,02% de azida de sódio em PBST, pH 7,5; adicionar vermelho de fenol adicionado como um marcador de pH) para permitir a reutilização de anticorpos. 
	Nota: por exemplo, dilua ATG5 anticorpo x 2.000 na solução de vermelho.
	<ol><li>No final do tempo de incubação, lavar as membranas 3 vezes com PBST.</li>
	</ol></li> <li>Incubar as membranas com anticorpos secundarios conjugados a HRP que foram preparadas em solução de leite desnatado de 5% (aqui, anti-IgG de coelho no 1:10.000 foi usado). Em seguida, lave as membranas 3 x com PBST 5 min.</li>
	<li>Fazem a solução ECL: 25mm luminol, ácido cumarínico 9mm, 3 x 10 -4% H 2 O 2 em pH 70 mM Tris-HCl 8,8. Usar o fresco H 2 O 2 para cada experimento. 
	Nota: A reação começa após H 2 O 2 adição e continua por aproximadamente 20 min.
	<ol><li>Incubar as membranas e raio-x filmes por 20 min em ECL. Desenvolver e corrigi-los em uma sala escura.</li>
	</ol></li> <li>Para verificar a co-imunoprecipitação de proteínas com close ou sobreposição de pesos moleculares, pode ser necessário retirar os anticorpos fora das membranas incubando as membranas a 60 ° C por 30 min no buffer de descascamento: (pH 25 mM Tris-HCl 2 e 1% SDS).</li>
	<li>2.20 a 2.23 repita os passos para verificar se há co-imunoprecipitação usando anticorpos diferentes. Por exemplo, após ATG5 de detecção e remoção das membranas, proteínas RACK1 foi testada sobre as membranas mesmas usando um anticorpo primário anti-RACK1 (1:1, 000) e anticorpos secundários (01:10, 000). Β-actina foi usado como o controle de carregamento; e sinal de IgG foi usado como o controle de carregamento para amostras de immunoprecipitated.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

As técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência são cruciais para o estudo das interações da proteína-proteína. Embora estas duas técnicas são comumente usadas e bem estabelecida, diversos critérios devem ser considerados para definir a qualidade das experiências ao usar estas técnicas.
Anticorpos primários, primeiros que são usados em testes devem ser específicos para as proteínas de interesse. Para garantir isso, use knockdowns shRNA ou células de nocaute para testar a especificidade d...

Macroautophagy (autofagia, neste documento) é um mecanismo de estresse celular que se caracteriza por sequestro de citoplasma em massa, proteínas e organelas em vesículas de membrana dupla chamadas vesículas autophagic. Através da fusão da camada externa da membrana dupla, vesículas autophagic e sua carga são entregues aos lisossomos e degradado nele1. Autofagia ocorre em níveis basais baixos em todos os tipos de células e em todos os organismos, realizando funções homeostáticas como degradação proteica e volume de negócios das organelas (por exemplo, as mitocôndrias). Sob condições que levaram ao estresse celular, tais como a fome, a autofagia é rapidamente upregulated e permite que a célula manter os níveis de energia e metabolismo básico1,2,3.
Cerca de 30 genes de autofagia foram clonados de levedura e seus produtos de proteína foram mostrados a desempenhar um papel em várias etapas do processo de autophagic, incluindo a nucleação de vesículas, a expansão, a fusão de vesículas atrasado endosome/lisossomo, e degradação de carga 4 , 5. Orthologs da maioria destes genes têm sido identificados e estudos em vários organismos confirmaram a preservação de suas funções celulares6. Estudos na última década que mostraram vários autofagia relacionados com complexos de proteínas e interações da proteína-proteína existem e que eles governam vias de autofagia de forma intrincada e controlada. Interseções, backups, feedback e feedforward mecanismos existem, e eles permitem que a célula coordenar autofagia com outros eventos relacionados (tais como biogênese lisossoma secreção vesicular, CDDP triagem e transporte7, etc.) Em uma tela de imparcial fermento-dois híbrido usando a proteína de autofagia ATG5 como uma isca, (ATG5 é uma proteína de autofagia chave envolvidos no sistema de conjugação de E2, como que medeia LC3 lipidation de fome induzida autofagia), nós identificamos Receptor ativado C-quinase 1 (RACK1; GNB2L1) como um forte interactor e um componente de autofagia romance8. Importante, a tela mostrou que a interação ATG5-RACK1 era indispensável para indução de autofagia por indutores de autofagia clássica (ou seja, à fome e mTOR inibição).
Métodos baseados em imunofluorescência são comumente usados para monitorar as interações da proteína-proteína. Estas técnicas são principalmente à base de anticorpos e ajudam a visualizar as interações e confirmar suas localizações celulares. Nesta técnica, fluorescente tag anticorpos conjugados que são específicos para as proteínas de interesse são geralmente usadas para a coloração específica. Cada proteína pode ser rotulada com anticorpos acoplados a corantes fluorescentes diferentes. Usando anticorpos específicos de proteínas, uma sobreposição no sinal quando imagens são mescladas indica a localização co das proteínas sob microscopia confocal. A técnica é aplicável para as células ou tecidos mesmo. Técnicas de imunofluorescência fornecem pistas sobre a dinâmica de interação e ajudam a identificar o tamanho e a distribuição de complexos de proteínas, enquanto o rastreamento de alterações gerais na morfologia celular sob diferentes condições de9. Imunoprecipitação é outra técnica comumente usada de anticorpo-baseado que permite a análise de interações entre proteínas10de dado. Usando esta técnica, as proteínas de interesse são isoladas de células ou tecidos extrai usando anticorpos específicos, originando a precipitação de proteínas em um complexo ou em contacto com uma proteína de interesse. Co-imunoprecipitação, onde a proteína e sua co interactor são detectados, revela não só a interação entre as duas proteínas, mas pode medir a sua força de interação sob circunstâncias diferentes11.
Este protocolo descreve em técnicas de chave de detalhe que foram usadas para confirmar e caracterizar a interação ATG5-RACK1 e RACK1-LC3. O foco é sobre as técnicas de imunofluorescência e imunoprecipitação, com ênfase de passos críticos e armadilhas para pesquisa de autofagia, bem como sugestões de resolução de problemas.

<table><tbody><tr><td>Solução de Tripsina EDTA A</td><td>Biological Industries&nbsp;</td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE Healthcare</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glicose alta)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (baixa glicose)</td> <td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>cobre slides</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>slides</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Biological Industries&nbsp;</td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A4503</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Anticorpo</td><td>Sigma</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Coelho IgG Alexa Fluor 568</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>&nbsp; sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadato de sódio</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 Anticorpo</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>Applichem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho de fenol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho IgG, HRP conjugado</td><td>Jackson Immuno.&nbsp;</td><td></td><td></td>1110305144</tr><tr><td>Luminol</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cumérico</td><td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>anti camundongo IgG, HRP conjugado</td><td>Jackson Immuno.</td><td>115035003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actina Anticorpo</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de coelho</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; R0395</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Proteína A-Agarose</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Solução de</td> penicilina/estreptomicina Biowest <td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Indústrias Biológicas&nbsp;</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Indústrias Biológicas</td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Solução</td><td>Sigma</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Nitocelulose</td><td>GE Healthcare</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>Filmes de raios-X</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Interações da proteína-proteína são importantes para cascatas de sinalização celular de compreensão e identificação via novela componentes e dinâmica da proteína. A maioria dos celulares atividades exigem interações físicas entre proteínas. Para analisar e mapear essas interações, foram desenvolvidas várias técnicas experimentais como ferramentas de Bioinformática. Autofagia é um celular, mecanismo que permite que as células lidar com estressores diferentes, incluindo hipoxia, produtos químicos e nutriente privação de reciclagem. Para entender melhor a sinalização de eventos relacionados a autofagia e descobrir novos fatores que regulam a complexos de proteínas em autofagia, realizamos telas de interação da proteína-proteína. Validação destes resultados de rastreio requer o uso de técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência. Neste sistema, interações específicas relacionadas a autofagia da proteína-proteína que descobrimos foram testadas em Neuro2A (N2A) e HEK293T linhas de celulares. Detalhes dos procedimentos técnicos utilizados são explicadas neste documento visualizado experimento.

Na Figura 1 um exemplo de localização de co é mostrado o resultado obtido usando este protocolo. Uma figura do nosso papel recente é apresentada8. Aqui, proteína endógena RACK1 estava manchada de verde, enquanto LC3 endógena estava manchado de vermelho. Os pontos amarelos que são observados nas fotos mescladas indicam sites de sobreposição entre os sinais verdes e vermelhos. Assim, os pontos amarelos representam a localização co parcial destas duas proteínas.
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Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Meu nome é Devrim Gozuacik. Estamos trabalhando na Universidade Sabanci, Istambul, Turquia, na regulação da autofagia em mamíferos. Estamos focando em diferentes proteínas, vias e RNAs que regulam a autofagia.Existem várias técnicas para estudar a autofagia. Estamos utilizando técnicas de biologia molecular, bioquímica e biologia celular para analisar diferentes vias que estamos descobrindo. Estamos empregando imunoprecipitação, técnicas de imunofluorescência, microscopia confocal e diversas outras técnicas para analisar as vias de autofagia.Os detalhes sobre diferentes técnicas, armadilhas e solução de problemas serão explicados pela minha estudante de doutorado, Secil Erbil. O objetivo geral dos procedimentos de imunofluorescência e imunoprecipitação é monitorar interações proteína-proteína endógenas em uma célula. Este método pode ajudá-lo a responder perguntas fundamentais sobre interações proteína-proteína e a localização celular delas.A principal vantagem dessas técnicas é a possibilidade de quantificar a intensidade da interação durante tratamentos e condições desejados em comparação com o controle. Para começar, desprenda as células com tripsina. Em seguida, conte as células utilizando um hemocitômetro e calcule a concentração celular.Retire lâminas de cobertura empacotadas e autoclavadas e coloque-as em uma placa de Petri de 10 centímetros. Se você estiver trabalhando com uma linhagem celular de fácil destacamento, como a HEK293T, usada neste experimento, recubra as lâminas de cobertura com solução de poli-L-lisina a 0,01%, previamente filtrada esterilmente. Após 10 minutos de incubação, remova a solução.Aguarde até que todo o poli-L-lisina evapore e as lamínulas fiquem completamente secas. Em seguida, lave-as com PBS estéril. Adicione um mililitro de meio em uma placa de 12 poços e coloque as lamínulas em cada poço.Semente 20.000 células por poço. É importante agitar a placa durante e após a inoculação para obter uma distribuição homogênea das células nas lamínulas. Trate suas células com o fármaco desejado e seu controle de modo que o tempo total de incubação das células não ultrapasse 48 horas.Após 48 horas, remova o meio das lamínulas e lave as células uma vez com PBS. Em seguida, sob capela, remova o PBS e fixe as células incubando-as com PFA 4% por 20 minutos à temperatura ambiente. Como o PFA é sensível à luz, cubra a placa com papel alumínio durante o período de incubação.Em seguida, remova o PFA e lave as amostras três vezes com PBS. Nesta etapa, é importante lavar as amostras uma a uma para não deixá-las secar. Em seguida, identifique uma placa de seis poços de acordo com as suas condições de tratamento e cubra cada poço com Parafilm.Neste passo, preste atenção para garantir um fundo liso após a cobertura com Parafilm. Em seguida, coloque as lamínulas em uma placa de seis poços e adicione 100 microlitros da mistura de BSA-saponina sobre cada lamínula, incubando-as por 30 minutos no gelo para bloqueio. Em seguida, remova a solução de bloqueio e lave as amostras uma vez com PBS.Prepare um anticorpo primário a 100 em uma mistura de BSA-saponina e coloque 100 microlitros dessa solução em cada lamínula. Incube por uma hora em temperatura ambiente. Durante a incubação, é preferível agitar a placa para obter uma distribuição uniforme do anticorpo nas lamínulas.Em seguida, remova o anticorpo primário e lave as amostras três vezes com PBS. Prepare o anticorpo secundário Alexa Fluor na diluição de um para 500 na mistura de BSA-saponina e adicione 100 microlitros dessa solução em cada lamínula. Como o Alexa Fluor é sensível à luz, é importante manter as amostras no escuro após este passo.Portanto, cubra a placa de seis poços com folha de alumínio e incube-a por uma hora à temperatura ambiente no agitador. Em seguida, remova o anticorpo secundário e lave as amostras três vezes com PBS. Rotule as lâminas com os nomes dos tratamentos e limpe-as com etanol utilizando Kimwipes.Em seguida, coloque 10 microlitros de solução de montagem no centro de cada lâmina. Com uma pinça, posicione cada lamínula sobre as lâminas. Em seguida, remova suavemente o excesso de solução de montagem utilizando um lenço de papel absorvente.Primeiro, estabilize cada lâmina de cobertura com quatro gotas de esmalte. Em seguida, selar completamente a lâmina de cobertura. Analise a amostra utilizando um microscópio confocal.Aqui você vê um exemplo de resultado de colocalização obtido utilizando este protocolo, retirado do nosso artigo recente. Neste vídeo, a proteína endógena RACK1 foi marcada com verde, enquanto a LC3 endógena foi marcada com vermelho. Os pontos amarelos que aparecem nas imagens Mescladas são os locais onde os sinais verde e vermelho se sobrepõem.Em outras palavras, os pontos amarelos representam a colocalização dessas duas proteínas. A imunoprecipitação é outro método comumente usado para estudar interações entre proteínas. Para começar, semeie quatro milhões de células HEK293T em placas de Petri de 15 centímetros para cada condição.Trate as células com os fármacos desejados de forma que o tempo total de incubação das células não exceda 48 horas. Após 48 horas de incubação, recolha as células com PBS frio. As células HEK293T destacam-se facilmente da placa.Portanto, lavar a placa com PBS por pipetagem é suficiente para destacar e colher todas as células. Colete suas células em tubos Eppendorf e centrifugue-as por 15 minutos em velocidade máxima a quatro graus. Em seguida, descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com um mililitro de PBS, ressuspendendo-o por pipetagem.Em seguida, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante. Resuspenda o pellet celular em tampão RIPA contendo inibidores de protease. Vortexe a suspensão por 15 segundos e mantenha o tubo Eppendorf no gelo por cinco minutos.Repita a vórtex por cinco vezes, uma vez a cada cinco minutos. Em seguida, centrifugue a amostra à velocidade máxima por 15 minutos a quatro graus. Então, retire o sobrenadante e centrifugue novamente para remover completamente os detritos celulares.Dilua os lisados proteicos de um para 50 e prepare uma placa de 96 poços com o branco, os padrões e as amostras diluídas. Misture-os com a solução de Bradford na proporção de um para 20, aguarde 15 minutos no escuro e meça a densidade óptica a 595 milímetros, calculando a concentração proteica utilizando os valores de absorbância de cada amostra. Em seguida, prepare as microesferas para o acoplamento do anticorpo.Corte a extremidade de uma ponteira de 200 microlitros usando uma tesoura e retire 25 microlitros da suspensão de microesferas para cada condição. Lave as microesferas uma vez com PBS, uma vez com tampão RIPA e uma vez com tampão RIPA contendo inibidores de protease. Após a última lavagem, reconstitua as microesferas em 300 microlitros de tampão RIPA contendo inibidores de protease e adicione 1,5 micrograma de anticorpo específico para a proteína que você deseja imunoprecipitar.Incube a mistura de anticorpo e esferas durante a noite a quatro graus em rotação. Após a incubação, lave as esferas com tampão RIPA contendo inibidores de protease e carregue dois miligramas de lisado celular total de cada condição. Complete o volume total até 300 microlitros com tampão RIPA contendo inibidores de protease e incube durante a noite em rotação a quatro graus.Em seguida, lave as esferas três vezes com tampão RIPA contendo inibidores de protease. Após a última lavagem, utilizando uma pipeta menor, tente remover todo o sobrenadante sem tocar nas esferas. Em seguida, adicione 10 microlitros de corante de carga 3X.Para controlar a expressão endógena de proteínas que serão verificadas em um experimento de co-imunoprecipitação, prepare amostras de entrada utilizando pelo menos 100 microgramas de lisado proteico. Adicione o volume apropriado de corante de carga 3X a cada amostra. Para desnaturar as amostras de IP e as amostras de controle de entrada, aqueça-as em banho-maria a 95 graus por 10 minutos.Em seguida, centrifugue e carregue as amostras no gel de SDS para separar as proteínas de acordo com seu tamanho por meio de western blot. Execute as amostras proteicas no gel de SDS e, em seguida, transfira as proteínas para membranas de nitrocelulose. Após a transferência úmida, bloqueie a membrana de nitrocelulose incubando-a com solução de leite desnatado a 5% por uma hora à temperatura ambiente em agitador.Em seguida, lave a membrana três vezes em solução PBS-Torin durante cinco minutos em agitação a temperatura ambiente. Incube a membrana com o anticorpo primário, específico para a proteína que deseja detectar, por uma hora a temperatura ambiente. Você pode preferir preparar os anticorpos primários em solução vermelha para reutilizá-los sem perder sua qualidade.Após a incubação com o anticorpo primário, repita os passos de lavagem com PBS-Torin três vezes. Em seguida, prepare a solução de anticorpo secundário conjugado com HRP em leite desnatado a 5% e incube com a membrana por uma hora em temperatura ambiente, sob agitação. Após a incubação, repita novamente os passos de lavagem.Em seguida, prepare uma solução ECL caseira e coloque a membrana em uma cassete. Continue então com os passos de revelação, conforme descrito no texto em um diagrama completo. Após o fixação e secagem do filme, marque de acordo com as bordas da membrana e a letra da proteína para poder prever a banda específica.Repita todos esses passos de incubação com o anticorpo seguidos pelos procedimentos no escuro para todas as proteínas cuja interação você deseja verificar. Em seguida, analise os resultados. Aqui você vê um resultado de imunoprecipitação endógena obtido a partir do nosso artigo mais recente.Neste vídeo, a proteína endógena ATG5 foi precipitada e os níveis de co-imunoprecipitação de RACK1 endógeno foram verificados sob diferentes condições. Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar de realizar o maior número possível de repetições biológicas, incluindo controles positivos e negativos, para coletar os níveis quantificados de interação após diferentes tratamentos. O panorama geral fornecido por todas as repetições biológicas é definido como o padrão de interação sob diferentes condições.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como pesquisar as dinâmicas das interações proteína-proteína.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

A biosensação de efeito de campo (FEB) é uma técnica livre de rótulos para detectar interações biomoleculares. Ele mede a corrente elétrica através do biosensor de grafeno ao qual os alvos de ligação são imobilizados. A tecnologia FEB foi utilizada para avaliar interações biomoleculares entre Hsp90 e Cdc37 e foi detectada uma forte interação entre as duas proteínas.

Explorando a interação biomolecular entre a acompanhante molecular Hsp90 e sua proteína cliente Kinase Cdc37 usando tecnologia de biosensão de efeito de campo

O presente protocolo descreve a indução de autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de nutrientes e analisa as alterações na autofagia utilizando linhagens de moscas transgênicas.

Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve vários métodos que podem ajudar no estudo da biologia da ATG9A, incluindo imunofluorescência seguida de análise de imagem, considerações de superexpressão transitória e investigação do estado de glicosilação da ATG9A usando western blot.

Imagem ATG9A, uma proteína de membrana multi-spanning

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Aprenda técnicas de imunofluorescência e imunoprecipitação para estudar interações proteína-proteína em mamíferos. Este método ajuda pesquisadores a identificar componentes de vias de sinalização celular.

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

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