Name: Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a realizar FISH para HER2 em amostras tumorais usando um fixador não reticulante sem formalina. Este método preserva a morfologia e a qualidade do RNA, permitindo análises moleculares superiores para medicina personalizada.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a equipe do laboratório de patologia molecular no Instituto de patologia da universidade médica Graz por seus conhecimentos e apoio. Além disso, nós agradecemos Iris Kufferath e Daniela Pabst para assistência técnica, Bernadette Rieger e Sylvia Eidenhammer para processar os casos de HER2 bem como Kinga Szurian (patologista) e Tamas Regényi (3DHISTEC). Agradecemos Penelope Kungl revisão do manuscrito. Este trabalho tem sido apoiado financeiramente por Christian Doppler fundo de investigação, o Ministério Federal austríaco de ciência, pesquisa e economia e a Fundação Nacional de investigação, tecnologia e desenvolvimento.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da universidade médica de Graz (referência número 20-066), Áustria. Amostras de tecido foram obtidas de dois casos de cânceres de mama invasivo primário cirurgicamente ressecado depois que os pacientes tinham dado consentimento escrito.
1. fixação de tecidos
Nota: Tecido a fixação é realizada também com solução de formalina tamponada padrão (SBFS), definido como solução de formol a 10%, contendo uma fração em massa de 3,7% (correspondente a uma fração de volume de 4%) formol tamponado para pH 6,8 a pH 7.2 de acordo com o CEN/TS 16827-1:2015 ou o sistema de fixação de tecido não-cross-linking, livre de formol (também referida como a solução de fixação alternativo abaixo) consiste em uma solução de estabilizador à temperatura ambiente (RT) e um fixador.
<ol>
	<li>Corte o peito de amostras de tecido de câncer com um bisturi estéril em duas metades cada 4 mm de espessura para garantir a quantidade adequada de tecido. Use um tamanho máximo de 4 x 15 x 15 mm para fixação de tecidos NCFPE ou SBFS.</li>
	<li>Coloque cada metade do espécime tumor em uma fita de tecido padrão e submirja em SBFS ou a solução alternativa de fixação para 24 h com um volume por relação de volume (v/v) do fixador 4 peças e uma parte do tecido (tecido (idealmente 10 mL/1 g)-4 mL/1 g).</li>
	<li>Transferi as amostras fixadas como alternativa para a solução de estabilizador para 2-72 h abertura do recipiente, rodando a fita de tecido em 180° e submergindo-lo.</li>
	<li>Coloque as fitas de tecido com as amostras SBFS-fixo em 250 mL de etanol a 70% por 30 min em RT para remover SBFS residual. Nota: Este passo é importante para evitar a contaminação de SBFS de amostras de tratados com fixador não-cross-linking no processador automático de tecidos, que destruiriam as propriedades benéficas do fixador não-cross-linking para preservação de biomoléculas. Atenção: SBFS é uma solução perigosa, provoca irritação na pele, lesões oculares graves, pode causar uma reação alérgica de pele, é suspeito de causar defeitos genéticos, podem causar câncer, irritação respiratória, sonolência e causa danos aos órgãos. O fixador alternativo é tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de ingestão, irritante para os olhos e pele, perigo de efeitos irreversíveis muito graves por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Inalação e contato físico devem ser evitados para ambas as soluções de fixação. Use vestuário de protecção adequado, luvas e proteção de olhos e da face. Trabalho em uma coifa.</li>
	<li>Proceda ao processamento do tecido, incorporação e corte de tecido (seções 2 e 3).</li>
</ol>
2. tecido processamento e incorporação
<ol>
	<li>Realizar a desidratação gradual de fitas de tecido com as amostras de tecido fixo em 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min), e álcool etílico 99% (2 x 60 min), seguido por xilol (2 x 60 min). Então se infiltre com parafina em um processador de tecido automatizado (4 x 45 min).</li>
	<li>Usando a pinça, coloque as amostras desidratadas e parafina-infiltrados (Alternativamente e SBFS-fixo) em moldes de metal.</li>
	<li>Incorporar as amostras em parafina derretida de 5-10 mL (ponto de solidificação 56-58 ° C) usando uma incorporação de parafina do instrumento.</li>
	<li>Coloque os moldes em uma placa de resfriamento a-5 ° C por 30 min.</li>
	<li>Recupere os blocos de parafina do tecido de moldes.</li>
	<li>Armazenar os blocos resultantes (Alternativamente-fixas, parafina (NCFPE) e SBFS-fixo parafina (FFPE)) no escuro a 4 ° C até o uso.</li>
</ol>
3. tecido de seccionamento e slide preparação para peixes
Nota: FFPE seções diretamente são usadas para os peixes, enquanto slides com seções NCFPE pós-fixados em SBFS 24 h antes do procedimento de peixe.
<ol>
	<li>Inserir uma lâmina descartável no micrótomo e ajustar o micrótomo para 10 µm.</li>
	<li>Pegue o primeiro bloco da placa de resfriamento e inseri-lo dentro do instrumento.</li>
	<li>Apare o bloco até que seja alcançada uma superfície plana. Limpe o micrótomo usando um pincel e ajustá-lo a 3 µm. descarte as primeiras seções de 2-3.</li>
	<li>Seções de corte 3 µm de blocos NCFPE e FFPE e colocá-los em um banho de água fria (água ultrapura). Nota: Para obter melhores fotografias sem sobreposição de núcleos, aqui, imagens de 2 µm secções, em vez de 3-5 µm, conforme recomendado nas instruções de manufacturer´s são mostradas.</li>
	<li>Pegue cada seção flutuante com um pincel fino e uma agulha numa lâmina de microscópio revestido para adesão das secções de tecido.</li>
	<li>Mergulhe neste slide um quente (40 ° C) banho de água e deixe a seção esticar completamente.</li>
	<li>Volte a colocar a seção para o slide puxando cuidadosamente o slide fora da água e evitar rugas.</li>
	<li>Deixe secar à temperatura ambiente durante 1 h-todas as seções.</li>
	<li>Aqueça os slides a 70 ° C por 30 min em uma incubadora para derreter a parafina.</li>
	<li>Colocar as lâminas horizontalmente em um vidro frasco de coloração.</li>
	<li>Hidratar as seções gradual no RT nos potes de coloração preenchidas com 250 mL de cada dos seguintes líquidos: xileno 100% 2 x 15 min, etanol a 96% 2 x 15 min, 90% etanol 2 min, 80% de etanol 2 min, 2 min, 50% etanol etanol a 70% 2 min e destilada água 2 x 10 min. Atenção: Execute etapas deparaffinization e reidratação em uma coifa, não inalar solventes tóxicos volatilizados. Nota: Dependendo da seções e tecido, pode ser necessário testar diferentes incubações com antecedência.</li>
</ol>
4. pós-fixação de espécimes NCFPE
<ol>
	<li>Realizar pós-fixação de slides NCFPE colocando-os em um frasco de coloração novo cheio de SBFS por 24 h no lugar do RT. o frasco em uma coifa durante a etapa de pós-fixação 24 h.</li>
	<li>Remover excesso SBFS lavando com fosfato tampão salino (3 x 10 min) e (2 x 10 min) de água destilada.</li>
</ol>
5. fluorescência situ hibridação in (peixe)
Nota: Aqui o peixe é executada usando a sonda de dupla cor HER2/CEN17 comercialmente disponível Kit de acordo com as instruções do fabricante. Não permita que as seções de tecido secar durante a hibridação e as etapas de lavagem. Não permita que a sonda de DNA e 4', 6-diamidino-2-phenylindole soluções de corante de contraste (DAPI) DNA para ser exposta à luz durante um período mais longo. Execute estas etapas no escuro usando recipientes opacos. Dependendo da idade e a etapa de fixação do material de amostra, aumentar ou diminuir a desnaturação e lavar as temperaturas para obter melhores resultados de hibridização.
<ol>
	<li>Coloque um coloração frasco contendo 250 mL de solução de pré-tratamento de calor cítrica em um banho de água de 98 ° C.</li>
	<li>Coloque o FFPE re-hidratado e pós-fixados NCFPE desliza para dentro do frasco e incube por 15 min.</li></ol>Não use mais de seis slides por frasco de coloração.
	<li>Lave as lâminas em água destilada por 3 min em RT em um novo frasco de coloração.</li>
	<li>Para proteólise, coloque os slides em um sistema de hibridização de temperatura controlada a 37 ° C.<ol>
		<li>Aplique imediatamente, o ready-to-use solução de pepsina (2mg/ml), gota a gota (~ 30 µ l por gota) para as secções de tecido até está completamente coberto. Incube durante 9 min a 37 ° C no sistema de hibridização. Nota: Recomenda-se um tempo de incubação de 5-15 min. O tempo ideal para proteólise deve ser determinado antecipadamente.</li>
		<li>Coloque os slides em um frasco contendo tampão de lavagem SSC e incubar durante 5 min.</li>
		<li>Lavar as lâminas em água destilada por 1 min em RT</li>
		<li>Realizar a desidratação das seções nos seguintes álcoois classificados: 50%, 70%, 90% e 100% cada por 1 min. o ar seco as seções.</li>
		<li>Para a hibridação, pipeta de 10 µ l da sonda HER2/CEN17 para as seções de tecido seco, cubra cada amostra com uma lamela e selá-lo com cimento de borracha. Nota: recomenda-se 10 µ l de sonda por área de tecido de 22 x 22 mm. Um suave aquecimento da sonda facilita o processo de pipetagem. Evite bolhas e longa exposição da sonda para a luz.</li>
		<li>Co Desnature sonda e a amostra de DNA no sistema de hibridação em 75 ° C por 10 min.</li>
		<li>Definir o sistema de hibridação a 37 ° C e cruzar durante a noite.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o cimento de borracha com fórceps para pós-hibridação e detecção.</li>
		<li>Incube os slides em um coloração jar contendo 37 ° C pré aquecido 1 x lavagem de tampão A 5 min. remover as lamelas.</li>
		<li>Lave os slides usando pré aquecido 1 x tampão de lavagem A duas vezes por 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Desidrate os slides em etanol a 70%, 90% e 100%, 1 min cada.</li>
		<li>Secar as amostras no ar e proteger da luz.</li>
		<li>Para a coloração, aplicar 30 µ l DAPI-solução para a área hibridizada evitando bolhas. Cobrir as seções com uma lamela.</li>
		<li>Incube durante 15 min, protegido da luz.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o excesso de solução de DAPI pressionando suavemente o slide entre papéis de filtro.</li>
		<li>Armazene os slides a 2-8 ° C no escuro por até 2 semanas até a avaliação pela microscopia confocal.</li>
	</ol>
	</li>

6. confocal imaging e digitalização de slides de peixes
<ol>
	<li>Executar a imagem latente confocal e digitalização de slides em um scanner digital confocal, equipado com um x 40 / 1.2 objectivo at, filtros quad-band (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) e um 5.5Mpx, 16 bits, câmera de semicondutor (CMOS) científica de óxido metálico complementar de refrigeração.</li>
	<li>Adquirir as imagens com filtros para verde (excitação: 503 nm, emissão: 528 nm) e laranja (excitação: 547 nm, emissão: 572 nm) canais.</li>
</ol>
7. interpretação
Nota: A sonda HER2/CEN17 é uma mistura de uma vermelho marcado com fluorocromo CEN17 sonda específica para a região centromérica satélite alfa do cromossomo 17 (D17Z1) e uma verde marcado com fluorocromo HER2 sonda específica para o gene HER2 (sonda localização 17q12). Amostras de tumor com um rácio de HER2:CEN17 ≤ 2.0 por núcleo são marcadas como normal, Considerando que aqueles com uma proporção de HER2:CEN17 ≥ 2.0 são marcados como amplificado17.
<ol>
	<li>Realizar análise de qualidade das imagens com o open source CaseViewer 2.120.<ol>
		<li>Avalie pelo menos 20 células que estão localizadas em duas regiões diferentes do componente invasivo do carcinoma conforme definido por um patologista. Inclua claramente distinguíveis núcleos bem distribuídos na área de contagem. Exclua da contagem de regiões do tecido no limite e em áreas retraídas ou espremidas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RNA qualidade
<ol>
	<li>Extração de RNA<ol>
		<li>Certifique-se de que todos os instrumentos e ferramentas são RNAse livre. Use uma solução de RNAse-remoção.</li>
		<li>Seções de corte 10 a 20 (5 µm de espessura) de amostras NCFPE ou FFPE usando um micrótomo seguindo o protocolo até o passo 3.8.</li>
		<li>Extrair o RNA de NCFPE kit de amostras usando o isolamento de RNA (consulte a tabela de materiais). Extraia o RNA de amostras FFPE usando um kit de isolamento de RNA FFPE. Nota: Extração de RNA de fixadores não-cruz-ligação requer um método de isolamento adaptado ao método de fixação. Não utilize qualquer outro RNA isolamento método (por exemplo, Trizol, RNeasy FFPE, etc. para a amostra NCFPE).</li>
		<li>Determine a concentração de RNA e pureza usando um espectrofotômetro. A razão entre a absorvância a 260 nm e 280 nm (A260/280) deve ser ~ 2.0.</li>
		<li>Armazene o RNA isolado a-70 ° C até uma análise mais aprofundada.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Executar uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em tempo real a transcrição reversa PCR utilizando primers para gerar amplicons de comprimentos diferentes8,9.<ol>
		<li>Use um kit de transcrição reversa do cDNA de acordo com as instruções do manufacturer´s para a síntese do cDNA. Use 500 ng RNA de cada amostra. Loja do cDNA a-20 º C até utilização posterior.</li>
		<li>Prepare a mistura de mestre de PCR de acordo com as instruções do manufacturer´s.</li>
		<li>Pipete o mix de mestre de PCR em triplica em uma placa de reação 384-bem. Adicionar 4 µ l de 01:16 diluído do cDNA (modelo PCR). Realize o PCR de acordo com as instruções do manufacturer´s. Nota: Para GAPDH humana, os seguintes primers foram utilizados: GAPDH para a frente: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH reverso: 71 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´ da bp, bp 153 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, bp 323 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ e 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.</li>
		<li>Analise os resultados usando um software aplicável à máquina de PCR. Produtos não específicos devem ser excluídos com base na análise de curva21a derreter.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+banks%3A+well-guarded+treasures+in+the+interest+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).</li>
<li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li>
<li>Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins%3A+reactionswith+model+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides.</a> J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).</li>
<li>Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+formaldehyde+fixation+on+RNA%3A+optimization+of+formaldehyde+adduct+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal.</a> J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).</li>
<li>Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-formalin+fixative+versus+formalin-fixed+tissue%3A+A+comparison+of+histology+and+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).</li>
<li>Do, H., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artifacts+in+DNA+from+formalin-fixed+tissues%3A+causes+and+strategies+for+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization.</a> Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).</li>
<li>Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+of+RNA+Preservation+and+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissue%3A+Implications+for+RT-PCR+and+Microarray+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis.</a> PloS One. 8 (7), e70714(2013).</li>
<li>Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technology+for+stabilization+of+biomolecules+in+tissues+for+combined%09histological+and+molecular+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined	histological and molecular analyses.</a> J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).</li>
<li>Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+colon+cancer+histomorphology%3A+A+comparison+between+formalin+and+PAXgene+tissue+fixation+by+an+international+ring+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial.</a> Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).</li>
<li>Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+PAXgene-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues.</a> J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).</li>
<li>Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+Assessment+of+PAXgene+Tissue+Fixation+and+Stabilization+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27704(2011).</li>
<li>Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Evaluation+of+the+PAXgene+Tissue+Fixation+System%3A+Morphology%2C+Immunohistochemistry%2C+Molecular+Biology%2C+and+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics.</a> Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).</li>
<li>Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+HER2+FISH+determination+on+PAXgene-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Path%22%5BJournal%5D)">Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer.</a> Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).</li>
<li>Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+ofHER-2%2Fneu+gene+amplification+in+human+breast+cancer+archival+material+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization.</a> Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).</li>
<li>Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+amplification+ratios+by+fluorescence+in+situ+hybridization+and+correlation+with+immunohistochemistry+in+a+cohort+of+6556+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues.</a> Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).</li>
<li>Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19548375">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer.</a> Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).</li>
<li>Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER-2%2Fneu+gene+amplification+characterized+by+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+poor+prognosis+in+node-negative+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas.</a> J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).</li>
<li>Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+a+tumor+marker+ready+for+prime+time%3F+A+case+study+of+c-erbB-2+as+a+predictive+factor+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).</li>
<li>Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+image+analysis+algorithm+for+detecting+nuclear+signals+in+digital+whole+slides+for+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology.</a> Cytometry A. , (2017).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4489822.pdf">QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</a>. , Publication Number 4489822 (2013).</li>
<li>NCCLS. <a target="_blank" href="https://infostore.saiglobal.com/store/details.aspx?ProductID=800906">Quality Assurance for Immunocytochemistry</a>. , Wayne. (1999).</li>
<li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+JR+%22Principles+of+Biological+Microtechnique%22">Principles of Biological Microtechnique</a>. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).</li>
<li>Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+specimen+preparation+in+surgical+pathology%3A+issues+concerning+the+recovery+of+nucleic+acids+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).</li>
</ol>

D.G. empregado pela Qiagen e tem participações de opções ou vínculo das ações no plano de pensões da empresa. Os dados apresentados neste manuscrito referem-se ao sistema de tecido PAXgene, que foi desenvolvido em um esforço conjunto pela Qiagen e PreAnalytiX. Qiagen é parceiro industrial do laboratório de Doppler Christian financiamento público para pesquisa de Biospecimen e tecnologias Biobanking. Todos os autores têm nenhum conflito de interesses e sem interesses financeiros concorrentes.

Os resultados demonstram dois principais descobertas. Primeiro, um passo de pós-fixação SBFS simples 24h de seções de corte de tecidos NCFPE é suficiente para obter resultados equivalentes àqueles com FFPE nas análises de peixe utilizando ensaios de peixe aprovados para tecidos FFPE (Veja também referência14). Este protocolo tem a vantagem do uso de ensaios de peixes originalmente desenvolvido e aprovado para FFPE sem a necessidade de revalidação abrangente (por exemplo, através da otimização das condições pré-hibridização de tecido non-cross-linked). O protocolo de peixe pode ser usado exatamente como descrito nas instruções do fabricante.
Pequenas modificações das instruções manufacturer´s descritas no presente protocolo (por exemplo, tecido seção diâmetro e incubação períodos nas etapas a seguir deparaffinization) resultam adaptações anteriores, que é explicitamente recomendado pelo fabricante devido ao uso de tipos de tecido diferentes e métodos de fixação.
A etapa de pós-fixação é crítica, porque ele requer um tempo de reação químico de 18-24 h, que estende o tempo de análise, um dia, mas permite que o mesmo fluxo de trabalho diário, como desenvolvido para tecidos FFPE (Figura 1). SBFS é relatado para penetrar o tecido a uma taxa média de 1 mm por hora22 a 5 mm em 2 h, dependendo do tipo de tecido23,24. A observação que somente pós-fixação de prolongada mais de 18 h pode alterar as propriedades de NCFPE seções FFPE, indica que não a penetração do fixador, mas o tempo de reação químico é fundamental para alcançar os resultados desejados1 ,14.
Em segundo lugar, o NCFPE o tecido remanescente que não é usado para pós-fixação pode ser usado para mais análises moleculares como as biomoléculas são bem preservadas. Isso foi demonstrado pela transcrição reversa em tempo real do PCR (Figura 3). O ensaio é mais sensível e específico do que o derivado electroferograma RIN valor (número de integridade do RNA) no que respeita à qualidade do RNA (i.e., modificação química e fragmentação) para mRNA isolado de tecidos parafina8. Controle de qualidade estava restrita neste estudo para PCR em tempo real, uma vez que grupos independentes demonstraram que, além de RNA, a qualidade de DNA e proteínas isoladas de NCFPE é melhor da FFPE tecidos 8,9, 13.
O protocolo apresentado segue, quando aplicável (por exemplo, receita SBFS condições de fixação, controle de qualidade de RNA, validação), os requisitos das especificações técnicas para procedimentos pré-analíticos para diagnóstico in vitro (IVD), CEN que têm sido recentemente lançado pelo Comité Europeu de normalização (CEN) (por exemplo, CEN/TS 16827-1:2015 para isolamento de RNA de tecidos FFPE que se refere à norma ISO 15189).
O método é limitado a este fixador específico. Embora a boa preservação das biomoléculas e morfologia usando o fixador não-cross-linking, livre de formol foi apresentada em vários estudos, é usado principalmente em pesquisa, mas não em aplicações médicas de rotina. Uma razão é que substituindo o padrão-ouro SBFS fixação por outro fixador que exigem uma variedade de estudos de validação, como nem todos os protocolos otimizados para material FFPE podem ser usados para materiais fixadas com fixador não-cross-linking. Outros métodos de fixação de tecidos não foram testados para este protocolo de peixe.
A etapa de pós-fixação simples descrita neste manuscrito tem a vantagem do uso de ensaios de IVD aprovado para tecidos FFPE e NCFPE.

Medicina personalizada depende cada vez mais multiparâmetros testes envolvendo análises morfológicas e moleculares no tecido. Fixação de formol de tecidos como o padrão ouro fornece excelente qualidade morfológica1,2. No entanto, a modificação química induzida por formalina e cross-linking de proteínas e ácidos nucleicos3,4,5 negativamente interfere com análise molecular6. Essas modificações moleculares limitar a qualidade dos ácidos nucleicos e proteínas e podem resultar em gene sequência artefatos7 ou sensibilidade reduzida da reação em cadeia da polimerase (PCR)-com base em ensaios de8. Embora grandes esforços foram tomados para otimizar os testes moleculares para tecido FFPE, crio-preservação de tecidos é em geral superior à fixação de formalina, tornando-se necessário dividir as amostras de tecido para procedimentos diferentes de preservação. Para evitar a necessidade de crio-preservação para análises moleculares, um não-cross-linking, livre de formol fixador, PAXgene tecido foi desenvolvido. Este sistema comercialmente disponível consiste de uma fixação e uma solução de estabilização contendo diferentes álcoois, ácido acético e um composto orgânico solúvel. Boa conservação dos ácidos nucleicos, proteínas (phospo) e morfologia foi mostrada em vários estudos6,9,10,11,12,13.
Um aplicativo específico no diagnóstico de câncer é peixe detectar uma gama abrangente de alterações cromossômicas, como translocações, deleções submicroscópicas e amplificações 14. Por exemplo, vinte por cento dos tumores de câncer de mama invasivo mostrar amplificação do receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) gene15,16,,17, que está associada com mau prognóstico18 ,19. Determinação do estatuto de superexpressão e amplificação do HER2 no câncer de mama por peixe é necessária para selecionar pacientes para a terapia anti-HER2-dirigido e é um complemento diagnóstico listado pelo Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. A fim de permitir uma ampla aplicação de diagnóstico complementar à base de peixe em cuidados de saúde, os ensaios foram desenvolvidos e aprovados para tecidos FFPE.
Em um estudo anterior, mostramos que os tecidos NCFPE não podem ser usados para ensaios de peixes que tenham sido aprovados para tecido FFPE. No entanto, testes de tempo série de post diferentes procedimentos de fixação de tecidos NCFPE com formol 4% tamponado, mostrou que postar os tempos de fixação de 18 h ou mais NCFPE seções do tecido alcançado resultados equivalentes àqueles com FFPE tecidos14.
Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado e demonstrar que o impacto de tecido não-cross-linking, livre de formol fixação e 24 h a 4% tamponado pós-fixação de formaldeído em seções usadas para qualidade HER2 peixe e RNA do mesmo espécime tecido primário.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig1.jpg"> 
Figura 1: diagrama mostrando as etapas de fluorescência em situ da hibridação (peixe) e análise de RNA de formalina fixada parafina incorporada (FFPE) e não-cross-linking, livre de formol fixa parafina incorporado tecidos (NCFPE). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Alemanha</td><td>www.sav-lp.de</td><td>FN-200L-4-1</td><td>Fixador de tecido</td></tr><tr><td>Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canadá</td><td>www.simport.com</td><td>M-498</td><td>Dispositivo de segurança que fornece rotulagem, fixação e incorporação de parafina para amostras de tecido.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Alemanha</td><td>www.qiagen.com</td><td>765112</td><td>Para coleta, fixação e estabilização de amostras de tecido: 10 recipientes de reagentes pré-preenchidos, contendo PAXgene Tissue FIX e PAXgene Tissue STABILIZER.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>813150</td><td>Processamento de amostras biológicas desde a fixação química até à infiltração de parafina</td></tr><tr><td>Merck Millipore, Munique, Alemanha</td><td>www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html</td><td>MC1009834000</td><td>Desidratação de amostras de tecido</td></tr><tr><td>VWR Chemicals, Darmstadt, Alemanha</td><td>https://at.vwr.com</td><td>10293EP</td><td>Desidratação de amostras de tecido</td></tr><tr><td>ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Viena, Áustria</td><td>www.herba-chemosan.at</td><td>2549662 32</td><td>Parafina usada em um dispositivo de processamento de tecidos</td></tr><tr><td>Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Viena, Áustria</td><td>www.LeicaBiosystems.com</td><td>39602004</td><td>Meio de inclusão de parafina</td></tr><tr><td>Sanova Diagnostik, Viena, Áustria</td><td>www.sanova.at</td><td>5229</td><td>Instrumento de inclusão de parafina para tecidos para histologia</td></tr><tr><td>Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Áustria</td><td>www.histocom.info</td><td>M 910010</td><td>Este dispositivo é usado para técnicas de seccionamento de parafina especialmente sofisticadas em biologia e medicina. Somente pessoal qualificado ou especialmente treinado deve operar o micrótomo, ou seja, clampeando a amostra, aparando, seccionando e retirando as seções do instrumento.</td></tr><tr><td>Dako Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca</td><td>www.chem.agilent.com</td><td>K802021-2</td><td>Corrediças de vidro revestidas, destinadas à montagem de seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Alemanha</td><td>www.qiagen.com</td><td>73504</td><td>Para purificação de RNA total de seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Alemanha</td><td>www.qiagen.com</td><td>765134</td><td>Para purificação de RNA total de seções de tecido fixadas em PAXgene e embebidas em parafina</td></tr><tr><td>ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Alemanha</td><td>www.zytovision.com</td><td>Z-2015-200</td><td>Para a detecção da amplificação do gene ERBB2 (também conhecido como HER2) frequentemente observado em neoplasias malignas sólidas, por exemplo, amostras de câncer de mama.</td></tr><tr><td>3DHISTEC, Budapeste, Hungria</td><td>www.3dhistech.com</td><td></td><td>Dispositivo digital para escaneamento de lâminas de tecido equipado com objetiva de 40x/1,2 NA, filtros de banda quádrupla (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) e uma câmera CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) científica refrigerada de 5,5 Mpx, 16 bits.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4368814</td><td>O Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade contém todos os componentes necessários para a conversão quantitativa de até 2 &micro; g de RNA total para cDNA de fita simples em um único 20 &micro; L.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4367659</td><td>PCR Master Mix contendo polimerase, nucleotídeos e SYBR Green para PCR e quanitificação de amplicons.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE</td><td>www.thermofisher.com</td><td>Ser. Nr. F239</td><td>Espectrofotômetro para quantificação de ácidos nucleicos.</td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 7 Flex</td><td>www.thermofisher.com</td><td>máquina de</td><td>PCR 4485701,</td></tr> <tr><td>Vysis / Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, EUA</td><td>www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order</td>, <td>por exemplo, (ThermoBrite) 07J91-020</td><td>Sistema de processamento de lâminas com temperatura controlada para procedimentos de desnaturação/hibridização in-situ.</td></tr></tbody></table>

protocolo para her2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Avaliação morfológica de amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) tem sido o padrão-ouro para diagnóstico de câncer há décadas devido a sua excelente preservação da morfologia. Medicina personalizada cada vez mais fornece terapias individualmente adaptadas e direccionadas para caracterizadas doenças individuais habilitadas combinadas morfológicas e moleculares tecnologias analíticas e diagnósticos. Desempenho dos ensaios morfológicos e moleculares do mesmo espécime FFPE é um desafio devido ao impacto negativo de formol devido a modificação química e cross-linking de ácidos nucleicos e proteínas. Um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol foi recentemente desenvolvido para satisfazer ambos os requisitos, ou seja, para preservar a morfologia como FFPE e biomoléculas como crio-preservação. Desde que o peixe é geralmente necessário em combinação com histopatologia e diagnóstico molecular, testamos a aplicabilidade dos protocolos de peixe sobre os tecidos tratados com este novo fixador. Encontramos essa pós-fixação formol de cortes histológicos de não-cruz-ligação, livre de formol e parafina (NCFPE) mama câncer tecido gerado resultados equivalentes àqueles com tecido FFPE no receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2 Análise de peixe. Este protocolo descreve como um ensaio de peixes originalmente desenvolvido e validado para o tecido FFPE pode ser usado para tecidos NCFPE por uma simples etapa pós-fixação de cortes histológicos.

Determinação do HER2 de peixe:
As intensidades de sinal HER2-peixe da FFPE e NCFPE são semelhantes (Figura 2). Ambos os casos, na maioria das células mostram um claro excesso do sinal verde (indicativo do locus de gene HER2 amplificado) em comparação com o sinal vermelho (gene de referência CEN17). Portanto, o caso mostra um gene HER2 amplificado, o que significa que este paciente deve responder ao Trastuzumabe, uma terapia anti-HER2 direcionados. O espécime FFPE serviu como controle positivo. Os sinais observados nas células não-neoplásicos (tanto em FFPE e NCFPE) servem como referência interna e o controlo negativo para a amplificação do gene HER2. Para cada série de análise, pelo menos uma seção com status de amplificação de gene conhecido deve ser usada como controle positivo para a reação de hibridação.
Qualidade do RNA:
FFPE correspondente e NCFPE amostras de dois casos diferentes mostram diferenças na qualidade do RNA empregando transcrição reversa em tempo real do PCR. Resultados obtidos mostram eficiência de amplificação diferentes para comprimentos diferentes amplicons (i.e., 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) do mRNA GAPDH. Todos os valores de Ct (ciclo limiar) obtidos de amostras FFPE foram superiores aos de NCFPE. Essa diferença demonstra a amplificability PCR inferior do mRNA isolado de tecidos FFPE, sugerindo uma modificação química mais pronunciada. Além disso, os valores mais elevados de Ct por muito tempo comparado com amplicons curto são um indicador para a fragmentação do mRNA. Em comparação, as encostas de valor de Ct dos comprimentos diferentes amplicons mostra mais pronunciado fragmentação de mRNA em FFPE do que NCFPE os tecidos (Figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2.jpg"> 
Figura 2: resultados representativos de HER2 peixe para formalina correspondente fixada parafina incorporado (FFPE) e não-cross-linking, livre de formol parafina fixa incorporado cortes de tecido (NCFPE). Correspondentes amostras dos mesmos tecidos FFPE (A) e NCFPE (B) são mostradas. Em contraste com as células normais da interfase (C), onde dois verdes (HER2) e dois sinais de vermelho (CEN17) são esperados, células com locus de gene HER2 amplificado representam várias cópias de sinais verdes (HER2) (D). Status de amplificação do HER2 era idêntica em ambos FFPE e as seções NCFPE pós-fixas (A, B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig3.jpg"> 
Figura 3: resultados de um ensaio PCR em tempo real transcrição reversa utilizado para controle de qualidade de RNA. Eixo y: Valores de Ct (limiar de ciclo) do gene da GAPDH são mostradas para comprimentos diferentes amplicons (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) no eixo x. mRNA foi isolado FFPE e NCFPE de duas amostras de tecido do câncer mama diferentes transformadas em paralelo e transcrito de cDNA para PCR. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Hibridação in situ de fluorescência (FISH) é geralmente necessário em combinação com histopatologia e diagnóstico molecular para seleção da terapia na medicina personalizada. Um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol romance que permite alta qualidade morfológica, molecular e análises de peixes do mesmo espécime por adição de uma etapa pós-fixação antes de peixes é apresentado.

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

A medicina personalizada exige diferentes tipos de análise, desde a histologia clássica até a análise molecular, e várias técnicas in situ são realizadas em um tumor para selecionar a melhor terapia. As técnicas investigativas permitem diversas tecnologias analíticas a partir de um único espécime. Demonstramos aqui que, ao utilizar um fixador sem ligação cruzada na etapa simples de pós-fixação com formalina, é possível empregar protocolos originalmente desenvolvidos e validados para materiais fixados em formalina e embutidos em parafina, a partir de amostras celulares, obtendo boa morfologia, boa qualidade de RNA e bons resultados para hibridização in situ completa.As condições típicas de hibridização não são apropriadas para tecidos fixados sem formalina a fim de gerar resultados de FISH. Revelamos que não é a penetração, mas sim o tempo de correção química que é crítico para obter resultados de FISH comparáveis a partir de tecido fixado com pectina. Apenas a seção utilizada para FISH é fixada formal e posteriormente.O tecido fixado livre de formalina remanescente permite uma análise molecular superior em comparação com o tecido FFP, como demonstrado por RT-PCR. O procedimento que demonstramos foi realizado por Daniela Pabst, a técnica do meu laboratório. Para começar, corte as amostras de tecido de câncer de mama com um bisturi estéril em duas metades, cada uma com quatro milímetros de espessura, para garantir quantidade adequada de tecido.Utilize um tamanho máximo de 4x15x15 milímetros para a fixação através de solução padrão de formalina tamponada ou por meio de fixação tecidual alternativa, sem ligação cruzada e livre de formalina. Coloque uma metade da amostra tumoral em um cassete tecidual padrão e submerja-o em SBFS. Coloque a outra metade da amostra tumoral na solução de fixação alternativa por 24 horas com uma proporção volume por volume de quatro partes de fixador para uma parte de tecido.Em seguida, transfira as amostras fixadas alternativamente para a solução estabilizadora por duas a 72 horas, abrindo o recipiente, girando o cassete tecidual em 180 graus e submergindo-o. Depois, coloque os cassetes teciduais com as amostras fixadas em SBFS em um recipiente contendo etanol 70% por 30 minutos à temperatura ambiente para remover o SBFS residual. Após o processamento e inclusão dos tecidos conforme descrito no protocolo textual, utilize um micrótomo para cortar secções de três mícrons dos blocos FFPE e NCFPE.Coloque alguns de cada tipo de seção em um banho de água fria. Pegue a seção flutuante com um pincel fino sobre uma lâmina de microscópio fina e transfira-a para um banho de água morna. Pegue novamente as seções esticadas com o pincel sobre a lâmina de microscópio, sem formar rugas.Prepare também o isolamento de RNA para realizar a reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa na mesma amostra, colocando um pouco de cada tipo de corte em um tubo de reação. Para a desparafinização dos cortes de tecido, hidratamos os cortes progressivamente à temperatura ambiente nos frascos de coloração com 250 mililitros de diferentes reagentes. Primeiro, coloque os cortes em xilol a 100% duas vezes por 15 minutos, depois transfira os cortes para etanol a 96% duas vezes por 15 minutos.Em seguida, transfira as seções por percentuais progressivamente menores de etanol, incubando cada solução por dois minutos. Por fim, transfira as seções para água destilada duas vezes durante 10 minutos. Realize a pós-fixação de lâminas NCFPE colocando-as em um novo frasco de coloração preenchido com SBFS por 24 horas à temperatura ambiente.Deixe o frasco na capela durante o passo de pós-fixação de 24 horas. Surpreendentemente, todos os tempos de pós-fixação superiores a 18 horas apresentaram resultados semelhantes aos obtidos com material fixado em formalina e embebido em parafina. Remova o excesso de SPFS das lâminas lavando-as em solução salina tamponada com fosfato durante 10 minutos, três vezes.Prossiga com a segunda lavagem em água destilada por 10 minutos, duas vezes. Em seguida, coloque o frasco de coloração contendo 250 mililitros da solução pré-tratamento térmico cítrica em um banho-maria a 98 graus celsius. Coloque as lâminas de FFPE hidratadas e pós-fixadas em NCFPE no frasco e incube por 15 minutos.Em seguida, lave as lâminas em água destilada durante três minutos à temperatura ambiente em um novo frasco de coloração. Para a proteólise, coloque as lâminas em uma hibridização com temperatura controlada a 37 graus celsius. Aplique imediatamente a solução de pepsina pronta para uso gota a gota sobre as seções de tecido até que fiquem completamente cobertas.Em seguida, incubar por nove minutos a 37 graus Celsius no sistema de hibridização. Depois, colocar as lâminas em um frasco contendo tampão de lavagem SSC e incubar por cinco minutos. Colocar as lâminas em água destilada por um minuto à temperatura ambiente.Realize a desidratação das seções em uma série de álcoois graduados, cada um por um minuto. Após a série de desidratação, seque as seções ao ar. Para hibridização, pipete 10 microlitros da sonda combinada HER2 e sun 17 sobre as seções de tecido secas, cubra cada amostra com uma lamínula e feche com cola de borracha.Código desnaturar a sonda e o DNA do espécime no sistema de hibridização a 75 graus Celsius por 10 minutos. O sistema de hibridização diminui automaticamente para 37 graus Celsius, e a hibridização prossegue durante a noite. No dia seguinte, remova cuidadosamente o cimento de borracha e as lamínulas também com pinça para pós-hibridização e proteção.Incube os cortes em um frasco de coloração contendo tampão A 1X pré-aquecido a 37 graus celsius por cinco minutos. Em seguida, lave as lâminas usando tampão de lavagem 1X pré-aquecido duas vezes por cinco minutos a 27 graus celsius. Então, desidrate as lâminas em etanol 70%, 90% e 100% por um minuto em cada concentração.Seque as amostras ao ar e proteja-as da luz. Para coloração, aplique 30 microlitros da solução de DAPI na área hibridizada, evitando bolhas. Cubra as seções com uma lamínula antes de incubar as seções por 15 minutos, protegidas da luz.Remova cuidadosamente o excesso de solução de DAPI pressionando suavemente a lâmina entre papéis-filtro. Armazene as lâminas entre dois e oito graus Celsius, no escuro, por até duas semanas, até a avaliação por microscopia confocal. Adquira as imagens com filtros para os canais verde e laranja.Prossiga para a interpretação dos dados e avaliação da qualidade do RNA conforme descrito no protocolo textual. É mostrada aqui a comparação direta do resultado obtido a partir da amostra formalina-fixada e da amostra fixada sem reticulação que foi pós-fixada. Os sinais têm intensidade semelhante, e o fundo também é semelhante.Em células interfásicas normais, há um número igual de sinais vermelhos e verdes correspondentes ao locus HER2 e ao locus de referência cen 17, o que indica que não há amplificação no gene HER2. É mostrado aqui o resultado de outro caso em que o gene HER2 está amplificado, e há um sinal muito mais forte e amplo para o locus HER2 do que para o gene de referência. Esse fenômeno é evidente no tecido formal e fixado, bem como no tecido fixado sem reticulação.Este gráfico mostra a eficácia de amplificação para os diferentes comprimentos de amplicon do mRNA da GAPDH. Para o formalina, cerca de 23 ciclos são necessários, e para material fixado sem ligação cruzada, isso diminui para 20 ciclos. A diferença torna-se mais evidente em amplicons mais longos, o que indica que tanto a fragmentação quanto a modificação química são acentuadamente reduzidas ao se utilizarem fixadores sem ligação cruzada.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como se pode usar uma chave aprovada pela FDA para material FFPN em amostras fixadas sem ligação cruzada, adicionando um simples passo de pós-fixação no procedimento pré-analítico. A principal vantagem dessa técnica é que apenas a lâmina utilizada para hibridização in situ de fita completa é submetida à pós-fixação com formalina, enquanto o bloco remanescente é fixado com fixador sem ligação cruzada e, portanto, pode ser usado para uma ampla gama de análises moleculares. Este protocolo é particularmente útil no contexto da medicina personalizada moderna, quando múltiplas análises precisam ser realizadas a partir de tumores relativamente pequenos, e o processamento de espécimes teciduais para diferentes protocolos não é viável.Além disso, o uso de um fixador não reticulante apresenta a vantagem de preservar propriedades teciduais como a criopreservação. Isso evita a necessidade de utilizar nitrogênio líquido congelado e de manter uma cadeia de refrigeração em um contexto químico. Essas diferenças na qualidade do RNA não são evidentes, de modo que ao utilizar ensaios clássicos de controle de qualidade do RNA, como os números de integridade do RNA, esses ensaios não são totalmente informativos sobre a qualidade do RNA isolado de material fixado e embutido em parafina.

protocol-for-her2-fish-using-non-cross-linking-formalin-free-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A combinação de diferentes técnicas para maximizar a coleta de dados a partir de tecido do mouse é apresentado.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

Temos protocolos e desenvolvido um aparelho personalizado para permitir a inserção de espécimes de milímetro-escala. Apresentamos os procedimentos de preparação de amostra com ênfase na incorporação em resina acrílica e poliimida tubulação para alcançar a imobilização rígida e armazenamento a longo prazo de espécimes para o interrogatório de morfologia de arquitetura e células de tecidos por micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC).  Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Aqui, um protocolo passo-a-passo otimizado é fornecido para fixação, imunostaining e secção de embriões para detectar filopodia de sinalização especializada chamada citonês no desenvolvimento de tecidos de camundongos.

Fixação de tecido de rato embrionário para análise de cytoneme

Aprenda a realizar FISH para HER2 em amostras tumorais usando um fixador não reticulante sem formalina. Este método preserva a morfologia e a qualidade do RNA, permitindo análises moleculares superiores para medicina personalizada.

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

Explorar mais vídeos