Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

A medicina personalizada requer os diferentes tipos de análise, desde a histologia clássica até a análise molecular, e várias técnicas in-situ são realizadas em um tumor para selecionar a melhor terapia. As técnicas de investigação permitem várias tecnologias analíticas a partir de um único espécime. Demonstramos aqui, usando um fixador sem reticulação na etapa simples de pós-fixação de formalina, que você pode usar protocolos originalmente desenvolvidos e validados para material embebido em parafina formal e fixa, pode ser usado a partir da amostra de célula produzindo boa morfologia, boa qualidade de RNA e bons resultados para hibridização in-situ de sentido mais completo.

As condições típicas de hibridização não são apropriadas para tecidos fixos livres de formalina para gerar resultados de FISH. Revelamos que não é a penetração, mas o tempo de correção química que é crítico para alcançar resultados comparáveis de FISH do tecido fixado em pectina. Apenas a seção usada para FISH é formal e pós-fixada.

O tecido fixo livre de formalina remanescente permite uma análise molecular superior em relação ao tecido FFP, conforme demonstrado pelo RTPCR. O procedimento que demonstramos por Daniela Pabst, a técnica do meu laboratório. Para começar, corte as amostras de tecido de câncer de mama com um bisturi estéril em duas metades, cada uma com quatro milímetros de espessura para garantir a quantidade adequada de tecido.

Use um tamanho máximo de 4x15x15 millimitadores para fixação por meio de solução de formalina tamponada padrão ou por meio de fixação alternativa de tecido sem reticulação e sem formalina. Coloque metade da amostra do tumor em um de tecido padrão e mergulhe-o em SBFS. Coloque a outra metade da amostra do tumor na solução de fixação alternativa por 24 horas com uma proporção de volume por volume de quatro partes de fixador e uma parte de tecido.

Em seguida, transfira as amostras fixadas alternativamente para a solução estabilizadora por duas a 72 horas, abrindo o recipiente, girando o de tecido em 180 graus e submergindo-o. Em seguida, coloque os de tecido com as amostras fixadas em SBFS em um recipiente cheio de etanol a 70% por 30 minutos em temperatura ambiente para remover o SBFS residual. Após o processamento e incorporação de tecidos, conforme descrito no protocolo de texto, use um micrótomo para cortar seções de três mícrons de blocos FFPE e NCFPE.

Coloque um pouco de cada tipo de seção em um banho de água fria. Pegue a seção flutuante com um pincel fino em uma lâmina fina de microscópio e transfira-a para um banho de água morna. Pegue as seções esticadas novamente com o pincel na lâmina do microscópio sem rugas.

Prepare-se também para o isolamento de RNA para realizar PCR de transcrição reversa na mesma amostra, colocando um pouco de cada tipo de seção em um frasco de reação. Para desparafinização de seções de tecido, hidratamos as seções gradualmente à temperatura ambiente nos frascos de coloração com 250 mililitros de diferentes reagentes. Primeiro coloque as seções em xileno 100% duas vezes por 15 minutos, depois transfira as seções para etanol 96% duas vezes por 15 minutos.

Em seguida, mova as seções por porcentagens incrementalmente mais baixas de etanol, incubando cada solução por dois minutos. Por fim, transfira as seções para destiladas duas vezes por 10 minutos. Realize a pós-fixação das lâminas NCFPE colocando-as em um novo frasco de coloração cheio de SBFS por 24 horas em temperatura ambiente.

Deixar o frasco na hotte durante a fase de 24 horas após a fixação. Surpreendentemente, todos os tempos de pós-fixação superiores a 18 horas deram resultados semelhantes aos obtidos com material de parafina formal e fixo. Remova o excesso de SPFS das lâminas lavando-as em solução salina tamponada com fosfato por 10 minutos três vezes.

Siga com a segunda lavagem em água destilada por 10 minutos duas vezes. Em seguida, coloque o frasco de coloração contendo 250 mililitros de solução de pré-tratamento térmico cítrico em um banho-maria a 98 graus Celsius. Coloque o FFPE hidratado em lâminas NCFPE pós-fixadas no frasco e incube por 15 minutos.

Em seguida, lave as lâminas em água destilada por três minutos em temperatura ambiente em um novo frasco de coloração. Para proteólise, coloque as lâminas em uma hibridização com temperatura controlada a 37 graus Celsius. Aplique imediatamente a solução de pepsina pronta para uso gota a gota nas seções de tecido até que estejam completamente cobertas.

Em seguida, incube por nove minutos a 37 graus Celsius no sistema de hibridização. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco contendo tampão de lavagem SSC e incube por cinco minutos. Coloque as lâminas em água destilada por um minuto em temperatura ambiente.

Realize a desidratação das seções em uma série de álcoois graduados, cada um por um minuto. Após a série de desidratação, seque as seções ao ar. Para hibridização, pipete 10 microlitros da sonda combinada HER2 e sun 17 nas seções de tecido seco, cubra cada amostra com uma lamínula e sele-a com cimento de borracha.

O código desnatura a sonda e o DNA da amostra no sistema de hibridização a 75 graus Celsius por 10 minutos. O sistema de hibridização diminui automaticamente para 37 graus Celsius e a hibridização continua durante a noite. No dia seguinte, remova cuidadosamente o cimento de borracha e as lamínulas também com uma pinça para pós-hibridização e proteção.

Incube os tamanhos em um frasco de coloração contendo 37 graus Celsius pré-aquecido 1X tampão A por cinco minutos. Em seguida, lave as lâminas usando tampão de lavagem 1X pré-aquecido duas vezes por cinco minutos a 27 graus Celsius. Em seguida, desidrate as lâminas em etanol a 70%, 90% e 100% em um minuto para cada concentração.

Seque as amostras ao ar e proteja-as da luz. Para coloração, aplique 30 microlitros de solução DAPI na área hibridizada, evitando bolhas. Cubra as seções com uma lamínula antes de incubar as seções por 15 minutos, protegidas da luz.

Remova cuidadosamente o excesso de solução de DAPI pressionando suavemente a lâmina entre os papéis de filtro. Armazene as lâminas a dois a oito graus Celsius no escuro por até duas semanas até a avaliação por microscopia confocal. Adquira as imagens com filtros para canais verdes e laranja.

Prossiga para a interpretação dos dados e avaliação da qualidade do RNA conforme descrito no protocolo de texto. Aqui é mostrada a comparação direta do resultado obtido da amostra formal e fixa, e a amostra fixa sem reticulação que foi pós-fixada. Os sinais são de intensidade semelhante e o fundo também é semelhante.

Em células interfásicas normais, há um número igual de sinais vermelhos e verdes correspondentes ao locus HER2 e ao locus de referência sen 17, o que mostra que não há amplificação no gene HER2. Aqui é mostrado o resultado de outro caso em que o gene HER2 é amplificado e há um sinal muito mais forte e amplo para o locus HER2 do que para o gene de referência. Este fenômeno é aparente no tecido fixo formal e fixo, e no tecido fixo não reticulado.

Este gráfico mostra a eficácia da amplificação para os diferentes comprimentos de amplicon do mRNA do GAPDH. Para a formalina, são necessários cerca de 23 ciclos e, para o material fixo sem reticulação, isso é reduzido para 20 ciclos. A diferença torna-se mais evidente em amplicons mais longos, o que indica que tanto a fragmentação quanto a modificação química são marcadamente reduzidas pelo uso de fixadores sem reticulação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar uma chave aprovada pela FDA para material FFPN em material fixo sem reticulação, adicionando uma etapa simples de pós-fixação no procedimento pré-analítico. A principal vantagem desta técnica é que apenas a seção usada para hibridização in situ de sentido completo é para pós-fixada com formalina, enquanto o bloco restante é fixado no fixador não reticulado e, portanto, pode ser usado para um amplo espectro de análise molecular. Este protocolo é particularmente útil no contexto da medicina personalizada moderna, quando várias análises precisam ser realizadas a partir de tumores relativamente pequenos e o processamento de amostras de tecido para diferentes protocolos não é viável.

Além disso, o uso de um fixador sem reticulação tem a vantagem de preservar as propriedades do tecido, como a criopreservação. Isso evita a necessidade de congelar nitrogênio líquido e manter uma cadeia de resfriamento em um contexto químico. Essas diferenças na qualidade do RNA não são óbvias, de modo que, ao usar ensaios clássicos de controle de qualidade de RNA, como números de integridade de RNA, uma vez que esses ensaios não são totalmente formativos na qualidade do RNA isolado de material fixo e embebido em parafina.