Name: Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando Em Utero Electroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Aprenda a observar neurônios corticais migratórios em cultura de fatias organotípicas de cérebro de mouse embrionário usando eletroporação in utero e microscopia confocal de lapso de tempo.

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Agradecemos Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer por uma excelente assistência técnica, bem como por Victor Tarabykin para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de Assistência Ambiental Animal (Regierungspräsidium Tübingen) e executados de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal e a Diretiva da UE 2010/63 / UE. 1. Em Utero Electroporation <ol><li> Agulhas de microinjecção <ol><li> Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro externo: 1,0 mm, diâmetro interno: 0,58 mm, comprimento: 100 mm) em agulhas de microinjeção usando um extrator de micropipetas com um filamento de caixa (2,5 mm x 2,5 mm) e o seguinte programa: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCIDADE: 20 e DELAY: 140. Determine o valor HEAT para cada filamento individual realizando uma prova RAMP (valor HEAT: RAMP + 25). </li><li> Agulhas de bisel num ângulo de 38 ° e velocidade de rotação intermediária a alta com um microgrinder para obter um tamanho de ponta de 20 a 30 μm para injetar no dia embrionário (E) 13,5 ou mais jovens e 30 a 40 μm para injetar em embriões mais velhosestágios. Para o armazenamento, coloque as agulhas em uma caixa ou placa Petri com argila de modelagem para evitar danos nas dicas. </li></ol></li><li> Solução de DNA de plasmídeo <ol><li> Prepare a construção de DNA de plasmídeo contendo proteína repórter fluorescente ( por exemplo, GFP) usando um kit de preparação maxi sem endotoxina de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Diluir a solução de DNA de plasmídeo até uma concentração final de 1 - 2 μg / μL em tampão Tris-EDTA isento de endotoxina contendo Fast Green a uma concentração final de 0,01%. Solução alíquota e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Solução Bacteriostática de Cloreto de Sódio <ol><li> Prepare a solução de cloreto de sódio bacteriostático adicionando álcool benzílico até uma concentração final de 0,9% na solução de cloreto de sódio isotônico a 0,9%. Solução de filtro estéril imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Solução de Injeção de Carprofen <ol><li> Prepare a solução de injeção de carprofen porAdicionando carprofeno a uma concentração final de 0,5 mg / mL a solução de cloreto de sódio isotônico esterilizado a 0,9%. Armazenar a 4 ° C por até 28 dias. </li></ol></li><li> Anestesia, injeção de DNA e eletroporação <ol><li> Pesar um mouse E14.5 cronometrado por gravidez e colocá-lo em uma câmara de anestesia transparente conectada a um vaporizador e saturada com 5% de isoflurano. Quando o animal estiver inconsciente, transfira-o para uma máscara de anestesia anexada a uma placa de aquecimento de 37 ° C e mantenha-se anestesiado com 1.8 a 2.2% de isoflurano. Nota: Avalie o desenvolvimento da anestesia cirúrgica por perda de pinça e reflexos do pedal (pressão do dedo do pé). </li><li> Para analgesia, injete 100 μL de solução de injeção de carprofen por 10 mg de peso corporal do mouse (5 mg / kg de peso corporal) por via subcutânea. Vire o mouse com as costas voltadas e cubra cuidadosamente os olhos com vaselina para evitar que se sectem. </li><li> Espalhe delicadamente os membros e repare-osPara a placa de aquecimento com fita cirúrgica. Esterilizar o abdômen com etanol a 70% seguido de solução de iodo (7,5 mg / mL) utilizando cotonete de celulose. Repita este procedimento três vezes para garantir uma desinfecção adequada. </li><li> Cubra o abdômen com gaze estéril em que uma incisão foi cortada para poupar um campo (diâmetro: 2 - 2,5 cm) para a incisão abdominal. Molhe a gaze com solução bacteriostática de cloreto de sódio. Cuidado: Reavaliar o desenvolvimento da anestesia cirúrgica pela perda do reflexo do pedal. </li><li> Usando Microps de Micro Adson (serrilhado, comprimento: 12 cm) e tesoura fina (angulado ao lado, comprimento: 9 cm) corte a pele aproximadamente 1,5 cm ao longo da linha média do abdômen. Corte o músculo subjacente ao longo da linea alba. </li><li> Remova um cuerno uterino com fórceps de anel (comprimento: 9 cm, diâmetro externo: 3 mm, diâmetro interno: 2,2 mm) e coloque-o suavemente sobre a gaze úmida. Cuidado: segure o cuerno uterino com fórceps de anel apenas entre embriões eD não perturbe as placentas ou quaisquer vasos de abastecimento. Mantenha o útero úmido o tempo todo com solução bacteriostática de cloreto de sódio. </li><li> Coloque cuidadosamente um embrião com fórceps de anel e localize o ventrículo lateral, que se apresenta como uma sombra em forma de crescente paralela ao seio sagital. O local da injeção situa-se aproximadamente no meio de uma linha entre o olho pigmentado e a confluência dos seios, onde o seio sagital se ramifica para dois seios transversais. Empurre a agulha de microinjeção através da parede uterina e no ventrículo lateral. Nota: Se necessário, a profundidade da injeção pode ser corrigida pela retração da agulha. </li><li> Injetar 1 a 2 μL de solução de DNA no ventrículo lateral com um microinjetor, que é operado com um pedal, usando as seguintes configurações: 25 psi, 10 a 20 ms por pulso e 5 a 10 pulsos. A injeção bem sucedida pode ser monitorada pela solução de DNA colorida, que deve preencher o sistema ventricular. </li><li> Coloque os eletrodos de tipo pinça (diâmetro de 3 mm para E13.5 ou mais novo e 5 mm de diâmetro para E14.5 ou mais) de tal forma que o terminal &quot;positivo&quot; esteja do mesmo lado que o ventrículo injetado e o &quot;negativo&quot; O terminal está no lado oposto do ventrículo injetado abaixo da orelha da cabeça do embrião. </li><li> Humedecer o local de eletroporação com algumas gotas de solução bacteriostática de cloreto de sódio e aplicar 5 pulsos de corrente elétrica (35 V para E13,5 ou mais jovens e 40 V para E14,5 ou mais) com uma duração de 50 ms com intervalos de 950 ms. Nota: Correntes de 60 a 90 mA são geralmente suficientes para uma eletroporação bem-sucedida. As correntes mais baixas não vão efetivamente transfectar neurônios, enquanto correntes mais altas podem levar à morte embrionária. </li><li> Repita o procedimento (ver Etapa 1.5.7 a 1.5.10.) Para cada embrião do cuerno uterino e coloque-o suavemente na cavidade abdominal. </li><li> Remova o chifre uterino do outro lado e repita o procEdure descrito no Passo 1.5.7. Para 1,5.11. </li><li> Feche a cavidade abdominal suturando a camada muscular antes de suturar a pele usando o MicroAdson Forceps, o suporte da agulha Mathieu (carboneto de tungstênio, comprimento: 14 cm) e a sutura cirúrgica não absorvível (3/8 círculo, 13 mm, ponto afilado). Cuidado: tenha cuidado para não capturar o útero ou quaisquer outros órgãos durante a sutura. </li><li> Desinfecte cuidadosamente a sutura da pele com solução de iodo (7,5 mg / mL) e remova suavemente o excesso periocular de vaselina usando cotonetes de celulose. Coloque o mouse sob uma lâmpada infravermelha até que ele acorde. Monitore o mouse com atenção de perto durante os próximos dois dias. Repita o tratamento com analgesia conforme descrito na Etapa 1.5.2 após 12 a 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Cultura Organotypic Slice <ol><li> Laminin Stock Solution <ol><li> Dissolver 1 mg de laminina liofilizada em água estéril para obter uma solução de reserva de laminina de 1 mg / mL. Prepare alíquotas de 50 μL aE armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Solução de estoque de poli-L-lisina <ol><li> Dissolver 50 mg de poli-L-lisina em água estéril para obter uma solução de reserva de poli-L-lisina de 1 mg / mL. Prepare alíquotas de 0,5 mL e armazene a -20 ° C. </li></ol></li><li> Complete a solução de sal equilibrada de Hank (Complete HBSS) <ol><li> Prepare o HBSS completo combinando 50 mL de solução de HBSS 10x, 1,25 mL de tampão HEPES 1 M (pH 7,4), 15 mL de solução de D-glicose 1 M, 5 mL de solução de cloreto de cálcio 100 mM, 5 mL de sulfato de magnésio 100 mM Solução e 2 mL de solução de hidrogenocarbonato de sódio 1 M. Adicione água estéril até 0,5 L, filtro estéril e armazene a 4 ° C. </li></ol></li><li> Slice Culture Medium <ol><li> Combine 35 mL de Águia Média Basal (BME), 12,9 mL de HBSS completo (ver secção 2.3.1.), 1,35 mL de D-glucose em 1 M, 0,25 mL de L-glutamina 200 mM e 0,5 mL de penicilina-estreptomicina para Obter 50 mL de cultura de fatiamédio. Filtro estéril e adicione soro de cavalo a uma concentração final de 5%. Armazenar a 4 ° C por até 4 semanas. </li></ol></li><li> Solução de Agarose de baixo ponto de fusão (LMP) <ol><li> Prepare 3% de solução de agarose de LMP dissolvendo 1,5 g de agarose de LMP em 50 mL de HBSS completo por aquecimento em um forno de microondas durante 1 a 2 minutos com potência intermediária. Nota: Monitorar o calor cuidadosamente para evitar o excesso durante a ebulição. </li><li> Coloque a solução em banho-maria a 38 ° C até estar pronta para uso. Armazenar a 4 ° C e reutilizar uma vez. </li></ol></li><li> Revestimento de inserções de membrana <ol><li> Adicione uma alíquota da solução-mãe de laminina (ver Etapa 2.1.1.) E uma alíquota de solução de reserva de poli-L-lisina (ver Etapa 2.2.1.) A 6 mL de água estéril para obter solução de revestimento (suficiente para 6 inserções) . </li><li> Coloque as inserções de membrana em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de água estéril no fundo de cada poço. Adicione 1 mL de solução de revestimento(Ver Passo 2.6.1.) Em cima de cada membrana e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Nota: use apenas inserções com membranas opticamente limpas, como a membrana de politetrafluoroetileno (PTFE). </li><li> Lave as membranas três vezes com 1 mL de água estéril e seque. Use membranas revestidas no mesmo dia ou guarde em uma placa limpa de 6 poços a 4 ° C por até quatro semanas. </li></ol></li><li> Dissecção e Incorporação de Cérebro <ol><li> Dois dias após a eletroporação, coloque o mouse em uma câmara transparente conectada a um vaporizador e saturada com 5% de isoflurano. Quando o animal está inconsciente, remova-o da câmara e sacrifique-o pela luxação cervical. </li><li> Remova o útero que contém os embriões e coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm com HBSS completo gelado. Nota: A partir deste momento, mantenha todas as soluções, embriões e cérebros no gelo. </li><li> Use um estereomicroscópio, pinça com ponta fina (reta,11 cm) e um par de tesouras de mola Vannas Tübingen (angulado, comprimento: 9,5 cm) para separar cada embrião do útero e transferi-lo para outro prato de Petri contendo HBSS completo gelado. </li><li> Faça uma incisão ao nível do tronco cerebral e corte ao longo da linha medial sagital. Retire a pele e a cartilagem cobrindo o cérebro. Então, corte o tronco cerebral logo atrás dos hemisférios e remova o cérebro do crânio. Transfira o cérebro com uma espátula de microcuadrinha (185 mm x 5 mm) para uma placa de 12 poços contendo HBSS completa gelada. Recolher todos os cérebros da ninhada na placa de 12 poços. </li><li> Use um estereomicroscópio fluorescente para exibir os cérebros na placa de 12 poços para brilho de fluorescência, bem como o tamanho da região eletroporada. Selecione 2 a 4 cérebros com sinais fluorescentes brilhantes no córtex somatossensorial presumido para posterior processamento. </li><li> Despeje 3% de solução de agarose LMP mantida a 38 ° C em um molde de encaixe descartável descartável. RemoçãoE cérebro da placa de 12 poços com uma espátula de microcuadrinha e drenar cuidadosamente excesso de HBSS completo ao redor do cérebro usando papel de seda fino. </li><li> Coloque o cérebro suavemente na solução de agarose, empurre-o para o fundo do molde e ajuste cuidadosamente sua posição usando uma agulha de calibre 20. Para seções coronais, oriente o cérebro com as lâmpadas olfativas apontando para cima. Mantenha o molde sobre gelo até que a solução de agarose seja solidificada e continue com o corte do cérebro. </li></ol></li><li> Vibratome Seção e Cultura de fatia <ol><li> Remova o bloco de agarose do molde e coloque-o sobre a tampa de uma placa de Petri estéril. Cortar o excesso de agarose com uma lâmina de barbear limpa deixando aproximadamente 2 a 3 mm abaixo das lâmpadas olfativas e 1 mm de agarose nos outros lados. Corrija o bloqueio de agarose aparado com as lâmpadas olfativas apontando para baixo em um estágio de amostra usando cola de cianoacrilato. Nota: esterilize instrumentos e equipamentos com 70% de etanoAntes da seção. </li><li> Transfira o estágio da amostra para a câmara de corte de um microtome de lâmina vibratória contendo HBSS completo gelado e posicione o cérebro com o lado dorsal em direção à lâmina. Corte fatias cerebrais de 250 μm de espessura contendo a região eletroporada com uma amplitude baixa a moderada de 0,9 mm e uma velocidade de corte muito lenta de 0,09-0,12 mm / s. Geralmente, 4 a 6 fatias com sinal fluorescente brilhante são obtidas de cada cérebro eletroporado com sucesso. </li><li> Com uma espátula de microcuadre dobrada e uma pinça de pontas finas, transfira cuidadosamente as fatias de cérebro com a agarose circundante para uma placa de 6 poços contendo HBSS completo gelada. Cuidado: tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral, apenas tocando na borda de agarose em torno das seções com a pinça durante a transferência. </li><li> Processe todos os cérebros selecionados conforme descrito nas Etapas 2.8.1. Para 2.8.3. </li><li> Humedecer as inserções de membrana com 100 μL de HBSS completo antes de colocar o cérebro slGelifica as membranas para facilitar o posicionamento das fatias. Podem ser colocadas até 5 fatias em 1 inserção de membrana. </li><li> Transfira com cuidado as fatias para as membranas usando uma espátula de microcuadrinha dobrada e fórceps de ponta fina. Puxe suavemente uma fatia sobre a espátula, tocando apenas o rebordo de agarose com a pinça e empurre suavemente a fatia da espátula para dentro da membrana. Posicione a fatia usando fórceps e continue a transferir as fatias restantes. Remova o excesso de HBSS completo com uma pipeta. Nota: Não se sobrepõem as fatias entre si. </li><li> Com a ajuda das pinças, coloque cuidadosamente as inserções de membrana com as fatias em uma placa de 6 poços contendo 1,8 mL de meio de cultura de fatia (ver Etapa 2.4.1) e incuba a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono até o lapso de tempo Imagem. </li></ol></li></ol> 3. Time-Lapse Imaging <ol><li> Configuração do microscópio <ol><li> Defina uma câmara climática colocada no palco de umMicroscópio confocal invertido a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Use um detector híbrido para reduzir a intensidade do laser e melhorar a viabilidade celular. Para uma análise detalhada, use uma distância de trabalho extra-longa com objetivo 40X seco com uma abertura numérica de 0,6 ou superior. Nota: Todos os componentes do microscópio precisam ser pré-aquecidos a 37 ° C por 2 a 3 h antes da imagem para fornecer um foco estável durante o processo de imagem. </li></ol></li><li> Imagem de fatia <ol><li> Selecione uma fatia de cérebro para imagem a partir da placa de 6 poços contendo as inserções de membrana usando um microscópio de fluorescência invertido. Cuidado: Evite o tempo prolongado de exposição à luz ultravioleta, pois isso pode causar fotodiodo celular. Nota: Selecione uma fatia com neurônios simples brilhantes na SVZ superior, migrando radialmente para a superfície do pia da fatia. Processos finos fluorescentes de células gliais radiais que abrangem todo o CP indicam um andaime radial glato intacto, que é usadoD por neurônios corticais que migram radialmente. </li><li> Transfira a inserção da membrana com a fatia, que foi selecionada para imagens de lapso de tempo, em um prato de fundo de vidro de 50 mm de diâmetro contendo 2 ml de meio de cultura de fatia com a ajuda da pinça. Coloque o prato na câmara climática do microscópio confocal. </li><li> Defina a resolução para 512 em 512 pixels e aumente a velocidade de varredura de 400 Hz para 700 Hz para aumentar a taxa de quadros de cerca de 1,4 a cerca de 2,5 quadros por segundo, respectivamente. Não utilize mais de duas vezes a média. Defina uma pilha z através da região eletroporada (geralmente 400-100 μm) com um tamanho de passo de 1,5 μm. Coletivamente, essas configurações permitem uma resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo o fotodamato baixo durante a aquisição. Comece a série de lapso de tempo pegando uma empilha em z de cada 30 min. Nota: A exposição prolongada da fatia à luz laser irá induzir a fotodinâmica reduzindo a viabilidade das células. Ajustar o expTempo de exposição à luz laser em conformidade. </li><li> Analise as séries de lapso de tempo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) ou equivalente. </li></ol></li></ol>

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<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A migração radial é um processo chave no desenvolvimento do neocórtex. As mutações em genes que afetam diferentes etapas deste processo podem causar malformações corticais graves, incluindo hepatite lissencefálica e heterotopia de matéria branca 1 , 2 . Recentemente, mostramos que Bcl11a, que é expressa em jovens neurônios de projeção cortical migratória, desempenha um papel na migração radial. Utilizamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratór...

O neocórtex é o principal site de funções cognitivas, emocionais e sensório-motoras. É composto de seis camadas horizontais orientadas em paralelo à superfície do cérebro. Durante o desenvolvimento, as células progenitoras na parede lateral do telencefalo dorsal dão origem a neurônios de projeção que migram radialmente para a superfície do pial e adquirem uma identidade neuronal específica do tipo de camada. Depois de serem geradas nas zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ), esses neurônios se tornam transitoriamente multipolar e diminuem sua migração. Após uma curta permanência na zona intermediária (IZ), eles mudam para uma morfologia bipolar, se prende ao andaime radial e continuam a migração orientada radialmente para a placa cortical (CP). Ao atingir o objetivo final, os neurônios de projeção se separam dos processos de glial radiais e adquirem identidade específica da camada. Mutações em genes que afetam diferentes etapas da migração neuronal podem causar malformação cortical grave, como lissencHematopia de IFF ou de matéria branca 1 , 2 . A eletroporação in utero é uma técnica rápida e poderosa para transfectar células progenitoras neurais no cérebro em desenvolvimento de embriões de roedores 3 , 4 . Com esta técnica, é possível derrubar e / ou sobre-expressar genes de interesse para estudar suas funções no desenvolvimento de neurônios. Este método ajudou especificamente a descrever os detalhes morfológicos e a caracterizar os mecanismos moleculares do processo de migração radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Os neurônios de migração radial sofrem alterações dinâmicas na forma celular, velocidade de migração, bem como direção migratória, que requerem observação direta e contínua ao longo do tempo. Cultivo de fatias organotípicasA imagem confocal re e time-lapse de cérebros eletroporados permite observar diretamente os neurônios migratórios ao longo do tempo. Usando essa abordagem combinada, é possível analisar características distintas de neurônios migratórios que não podem ser investigados em seções de tecido fixo de cérebros eletroporados. Recentemente, aplicamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratórios em culturas de fatia de cérebros eletroporados para estudar o papel do fator de transcrição CLL / linfoma 11a (Bcl11a) durante o desenvolvimento cortical 10 . Bcl11a é expressa em jovens neurônios corticais migratórios e utilizamos um alelo Bcl11a condicional condicional ( Bcl11a flox ) 11 para estudar suas funções. A eletroporação da recombinase Cre juntamente com a proteína fluorescente verde (GFP) em progenitores corticais dos cérebros BCL11a flox / flox nos permitiu criar uma situação de mutante de mosaico, na qual apenas algumas células são mutadas em umaDe outra forma, tipo selvagem. Desta forma, foi possível estudar as funções autônomas celulares de Bcl11a no nível de célula única. Descobrimos que os neurônios mutantes Bcl11a exibem velocidade reduzida, mudanças em seus perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação aleatórias durante a migração 10 . No protocolo delineado, descrevemos um fluxo de trabalho para a eletroporação bem sucedida e preparação de cultura de fatia 12 de cérebros de mouse, bem como imagens confocais de lapso de tempo de culturas de fatia cortical.

<table><tbody><tr><td>isoflurano</td><td>Abbott Laboratories</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>sutura cirúrgica não absorvível</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 círculo, 13 mm, ponta cônica</td></tr><tr><td>Micro Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td>serrilhado, comprimento: 12 cm</td></tr><tr><td>tesoura fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td>inclinado para o lado, comprimento: 9 cm</td></tr><tr><td>Suporte de Agulha Mathieu</td><td>Ferramentas</td> de Ciência Fina <td>12510-14</td><td>carboneto de tungstênio, comprimento: pinça</td></tr><tr><td>de ponta fina</td> de 14 cm <td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11370-40</td><td>reta, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; bingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>inclinado para cima, 9,5 cm</td></tr><tr><td>pinça de anel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3mm, ID, 2,2 mm, comprimento: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>soro de cavalo</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26050088</tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidro borossilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>sistema de anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>câmara de anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>recipiente de filtro fluosorber</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de lâmina vibratória</td> de 16520100 <td></td><td></td> de agarose de baixo ponto de fusão Leica VT1200 S <td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo de fluorescência</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Microscópio de cultura de tecidos de fluorescência invertida Leica M125 Leica DM IL LED <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr><tr><td>detector híbrido</td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>objetiva, 40x/0,60 NA</td><td>Sistema</td> de controle de temperatura para microscópio <td>Leica 11506201</td><td></td></tr> Life <tr><td></td><td>Imaging Services</td><td>Cube, Brick & Inserção</td> de cultura de células em caixa <td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td>usa ângulo de 38&deg; para chanfrar</td></tr><tr><td>o microinjetor</td><td>Parker Hannifin&nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofeno</td><td>Pfizer Saúde Animal</td><td>NDC 61106-8507</td><td>Molde de emdedding Rimadyl</td></tr><tr><td></td><td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>kit maxi de plasmídeo livre de endotoxinas</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>verde rápido</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magensium</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>eletroporador de onda quadrada</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>pinças com elétrodos de disco de platina de 5 mm</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>filamento de caixa</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td> Espátula de microcolher de <td>2,5 mm x 2,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>231-0191</td> Prato com fundo de vidro <td>de 185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>, 50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário usando<em&gt; em utero</em&gt; electroporação

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

A eletroporação in utero é uma abordagem rápida e poderosa para estudar o processo de migração radial no córtex cerebral do desenvolvimento de embriões de ratos. Ele ajudou a descrever os diferentes passos da migração radial e caracterizar os mecanismos moleculares que controlam esse processo. Para analisar de forma direta e dinâmica os neurônios migratórios, eles devem ser rastreados ao longo do tempo. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que combina in utero eletroporação com cultura de fatias organotípicas e imagens confocais temporizadas, o que permite um exame direto e análise dinâmica de neurônios corticais de migração radial. Além disso, é possível caracterizar detalhadamente neurônios migratórios, como velocidade de migração, perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação radial. O método pode ser facilmente adaptado para realizar análises funcionais de genes de interesse em neurônios corticais de migração radial por perda e ganho de função, bem como experiências de resgate. Espaço de tempoA imagem dos neurônios migratórios é uma técnica de última geração que, uma vez estabelecida, é uma ferramenta potente para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral em modelos de ratos de transtornos de migração neuronal.

Anteriormente, mostrámos que a eliminação genética de BCL11A por electroporação em útero prejudica a migração radial da camada superior de neurónios de projecção final-nascido 10. A eletroporação de um vector de plasmídeo de DNA contendo Cre-IRES-GFP eliminou eficientemente Bcl11a em cérebros Bcl11a flox / flox condicionais 11 . Quando analisamos os céreos eletroporados E14.5 três dias...

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

O objetivo geral deste procedimento é observar diretamente neurônios em migração radial em culturas de fatias organotípicas preparadas a partir de cérebros embrionários eletroporados, utilizando microscopia confocal com lapso de tempo. Este método pode auxiliar no estudo de aspectos-chave do desenvolvimento do neocórtex. Ele permite a investigação dos mecanismos moleculares envolvidos na polarização neuronal e na migração radial dos neurônios até sua posição final dentro do cérebro.A principal vantagem dessa técnica é que as propriedades dinâmicas dos neurônios migratórios podem ser analisadas, incluindo perfis de velocidade, velocidade média de migração e alterações na direção migratória. Comece posicionando um camundongo grávido devidamente anestesiado em posição supina sobre uma placa aquecida. Verifique a ausência do reflexo plantar.Em seguida, cubra cuidadosamente os olhos com vaselina para evitar que sequem. Depois, estenda suavemente os membros e fixe-os à placa de aquecimento com fita cirúrgica. Esterilize o abdômen esfregando com etanol 70%, seguido de solução de iodo, e então coloque uma gaze estéril, na qual foi feito um corte para a incisão abdominal, sobre o abdômen.Um

time-lapse-confocal-imaging-migrating-neurons-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://dx.doi.org/10.3791/55886-v'&gt; Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Este vídeo demonstra a microscopia confocal de lapso de tempo para observar a migração radial do neurônio cortical da zona subventricular para a placa cortical por meio de andaimes gliais radiais em fatias de cérebro embrionário de...

Imagem de lapso de tempo da migração radial de neurônios corticais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a observar neurônios corticais migratórios em cultura de fatias organotípicas de cérebro de mouse embrionário usando eletroporação in utero e microscopia confocal de lapso de tempo.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando Em Utero Electroporação (Vídeo) | JoVE Journal

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando

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