Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando Em Utero Electroporação

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

O objetivo geral deste procedimento é observar diretamente os neurônios que migram radialmente em cultura de fatias organotípicas preparadas a partir de cérebro embrionário eletroporado por microscopia confocal de lapso de tempo. Este método pode ajudar a estudar os principais aspectos do desenvolvimento do neocórtex. Permite a investigação dos mecanismos moleculares envolvidos na polarização dos neurônios e na migração radial dos neurônios para sua posição final no cérebro.

A principal vantagem desta técnica é que as propriedades dinâmicas dos neurônios migratórios podem ser analisadas, incluindo perfis de velocidade, velocidade média de migração, bem como mudanças de direção migratória. Comece colocando uma rata grávida devidamente anestesiada em decúbito dorsal em uma placa de aquecimento. Verifique a ausência do reflexo pedal.

E então, cubra cuidadosamente os olhos com vaselina para evitar que sequem. Em seguida, espalhe suavemente os membros e fixe-os na placa de aquecimento com fita cirúrgica. Esterilize o abdômen esfregando com etanol a 70% seguido de solução de iodo e, em seguida, coloque gaze estéril, na qual foi feito um corte para a incisão abdominal, sobre o abdômen.

Umedeça a gaze com solução bacteriostática de cloreto de sódio. Após reavaliar o desenvolvimento da anestesia cirúrgica, por perda do reflexo podal, use uma pinça micro Adson serrilhada e uma tesoura fina angular para cortar a pele aproximadamente 1,5 centímetros ao longo da linha média do abdômen. Em seguida, corte o músculo subjacente ao longo da linha alba.

Segure o corno uterino entre os embriões com uma pinça de anel e coloque-o suavemente na gaze umedecida sem perturbar as placentas ou os vasos de suprimento. Em seguida, posicione cuidadosamente um embrião para dar uma visão clara do ventrículo lateral, que se apresenta como uma sombra em forma de meia-lua paralela ao seio sagital. O local da injeção fica no meio de uma linha entre o olho pigmentado e a confluência dos seios da face, onde o seio sagital se ramifica para dois seios de transferência.

Uma vez identificada, empurre a agulha de microinjeção através da parede uterina e no ventrículo lateral. Em seguida, use um microinjetor operado com um pedal para injetar um a dois microlitros de solução de DNA com cinco a 10 pulsos. A injeção bem-sucedida pode ser monitorada pela solução de DNA colorido que deve preencher o sistema ventricular.

Em seguida, coloque eletrodos do tipo pinça de forma que o terminal positivo fique do mesmo lado do ventrículo injetado e o terminal negativo fique do lado oposto do ventrículo injetado abaixo da orelha da cabeça do embrião. Umedeça o local da eletroporação com algumas gotas de solução bacteriostática de cloreto de sódio e aplique cinco pulsos de corrente elétrica com duração de 50 milissegundos com intervalos de 950 milissegundos. Bolhas no eletrodo negativo indicam corrente elétrica.

60 a 90 miliamperes geralmente são suficientes para uma eletroporação bem-sucedida. Correntes mais baixas não transfectam neurônios com eficiência, enquanto correntes mais altas podem levar à morte embrionária. Depois de repetir o procedimento para cada embrião do primeiro corno uterino, coloque-o suavemente de volta na cavidade abdominal.

Após suturar a camada muscular e a pele, desinfete cuidadosamente com solução de iodo e remova suavemente a vaselina dos olhos usando cotonetes de celulose. Coloque o mouse sob uma lâmpada infravermelha até que ele acorde. Depois de sacrificar a fêmea grávida usando um método aprovado, remova o útero que contém os embriões e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros com HBSS completo gelado.

Deste ponto em diante, mantenha todas as soluções, embriões e cérebros no gelo. Ao trabalhar sob um estereomicroscópio, use uma pinça de ponta fina e uma tesoura de mola Vannas Tubingen para separar cada embrião do útero. Transfira os embriões para outra placa de Petri contendo HBSS completo gelado.

Faça uma incisão ao nível do tronco encefálico e corte ao longo da linha média sagital. Retire a pele e a cartilagem que cobrem o cérebro. Em seguida, corte o tronco cerebral logo atrás dos hemisférios e remova o cérebro do crânio.

Transfira o cérebro com uma micro colher de espátula para um prato de 12 poços contendo HBSS completo gelado. Colete todos os cérebros da cama na placa de 12 poços. Em seguida, use um estereomicroscópio fluorescente para rastrear os cérebros na placa de 12 poços quanto ao brilho da florescência, bem como o tamanho da região eletroporada.

Selecione de dois a quatro cérebros com sinais fluorescentes brilhantes e o córtex somatossensorial presuntivo para processamento posterior. Em seguida, despeje a solução de agarose derretida de 3% de baixo ponto de fusão em um molde de incorporação descartável removível. Use uma espátula de micro colher para remover o cérebro da placa de 12 poços e drene cuidadosamente o excesso de HBSS completo ao redor do cérebro usando papel de seda fino.

Coloque o cérebro suavemente na solução de agarose. Em seguida, use uma agulha de calibre 20 para empurrá-lo para o fundo do molde e ajuste cuidadosamente sua posição. Para cortes coronais, oriente o cérebro com os bulbos olfatórios apontando para cima.

Mantenha o molde no gelo até que a solução de agarose esteja solidificada e, em seguida, prossiga para seccionar o cérebro. Use uma lâmina de barbear limpa para aparar o excesso de agarose ao redor do cérebro, deixando aproximadamente um milímetro de agarose em todos os lados, exceto nos bulbos olfatórios, onde dois a três milímetros de agarose devem ser deixados. Depois de aplicar uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato em uma amostra, fixe o bloco de agarose aparado com os bulbos olfatórios apontando para baixo.

Transfira o estágio da amostra para a câmara de corte de um micrótomo de lâmina vibratória contendo HBSS completo gelado e posicione o cérebro com o lado dorsal voltado para a lâmina. Corte fatias de cérebro de 250 mícrons de espessura contendo a região eletroporada com uma amplitude baixa a moderada e uma velocidade de corte muito lenta. Normalmente, quatro a seis fatias com sinal fluorescente brilhante são obtidas de cada cérebro eletroporado com sucesso.

Segure a borda de agarose de uma seção com uma pinça de ponta fina e puxe a fatia para uma micro espátula de colher dobrada. Desta forma, transfira cuidadosamente as fatias de cérebro para uma placa de seis poços contendo HBSS completo gelado. Umedeça as inserções de membrana revestidas com laminina com 100 microlitros de HBSS completo.

Em seguida, transfira cuidadosamente as fatias para as membranas usando a espátula de microcolher dobrada e uma pinça. Empurre suavemente a fatia da espátula para a membrana e posicione com uma pinça. Continue a transferir as fatias restantes.

Até cinco fatias podem ser colocadas em uma inserção de membrana. Remova o excesso de HBSS completo com uma pipeta. Em seguida, com a ajuda de uma pinça, coloque cuidadosamente as inserções da membrana com as fatias em uma placa de seis poços contendo 1,8 mililitros de meio de cultura fatiado.

Selecione uma fatia de cérebro para imagem visualizando as fatias através de um microscópio invertido. Escolha uma fatia com neurônios únicos brilhantes na SVZ superior migrando radialmente em direção à superfície da pilha da fatia. A presença de processos fluorescentes finos de células gliais radiais que abrangem toda a placa conjugada indica um andaime glial radial intacto que é usado pela migração de neurônios conjugados.

Transfira o inserto da membrana com uma fatia selecionada para um prato com fundo de vidro de 50 milímetros de diâmetro contendo dois mililitros de meio de cultura de fatias. Coloque o prato na câmara climática do microscópio confocal. Defina a resolução para 512 por 512 pixels.

Aumente a velocidade de varredura de 400 hertz para 700 hertz para aumentar a taxa de quadros de cerca de 1,4 para cerca de 2,5 quadros por segundo. Use no máximo duas vezes a média. Defina uma pilha Z através da região eletroporada com o tamanho do passo de 1,5 mícrons.

Comece a série de lapso de tempo fazendo uma pilha Z a cada 30 minutos. As configurações descritas permitem resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo os danos da foto baixos durante a aquisição. Este filme mostra neurônios corticais E16.5 migrando das zonas subventricais ventriculares para a placa cortical.

No Bcl11a floxed transgênico condicional após eletroporação do plasmídeo de controle IRES-GFP no dia embrionário 14.5. O filme é composto por 108 quadros a uma taxa de cinco quadros por segundo. A barra de escala representa 100 mícrons.

A eletroporação de um vetor de plasmídeo de DNA contendo Cre-IRES-GFP afetou a migração de neurônios corticais em cérebros com Bcl11a condicional. Como visto aqui, muito poucos neurônios passam da zona intermediária para alcançar a placa cortical. Este filme mostra a polarização dos neurônios corticais de um controle marcado com GFP à esquerda em comparação com os neurônios de um mutante Bcl11a à direita.

Esses traços animados de controle representativo em neurônios mutantes Bcl11a foram obtidos a partir de séries de lapso de tempo de culturas de fatias E16.5 com resolução de intervalo de uma hora. Novamente, os dados do cérebro de controle são mostrados à esquerda e os dados do cérebro eletroporado Cre-IRES-GFP são mostrados à direita. Como visto nesta coleção de traços representativos de culturas de fatias de controle e mutantes Bcl11a, os neurônios mutantes Bcl11a freqüentemente passam por fases repetitivas de velocidade de migração reduzida e orientação alterada aleatoriamente, conforme marcado pelas pontas de seta vermelhas.

Os perfis de velocidade podem ser calculados a partir de traços de neurônios migratórios. Como visto aqui, uma proporção maior de neurônios mutantes Bcl11a tem velocidades de migração mais lentas em comparação com os controles. O ângulo de desvio pode ser calculado a partir dos dados de rastreamento.

Como visto neste histograma, os neurônios mutantes Bcl11a representados pelas barras pretas exibem maiores ângulos de desvio em comparação com os controles. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em menos de duas horas cada para a eletroporação in utero e a preparação da cultura organotípica de fatias cerebrais. Este procedimento pode ser facilmente adaptado para realizar análises fracionárias de genes de interesse em neurônios corticais migratórios radialmente por ganho e perda de função, bem como experimentos vasculares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como observar diretamente os neurônios que migram radialmente em cultura de fatias organotípicas preparadas a partir de cérebros embrionários eletroporados por microscopia confocal de lapso de tempo.