Name: Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando Em Utero Electroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Aprenda a observar neurônios corticais migratórios em cultura de fatias organotípicas de cérebro de mouse embrionário usando eletroporação in utero e microscopia confocal de lapso de tempo.

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Agradecemos Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer por uma excelente assistência técnica, bem como por Victor Tarabykin para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de Assistência Ambiental Animal (Regierungspräsidium Tübingen) e executados de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal e a Diretiva da UE 2010/63 / UE. 1. Em Utero Electroporation <ol><li> Agulhas de microinjecção <ol><li> Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro externo: 1,0 mm, diâmetro interno: 0,58 mm, comprimento: 100 mm) em agulhas de microinjeção usando um extrator de micropipetas com um filamento de caixa (2,5 mm x 2,5 mm) e o seguinte programa: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCIDADE: 20 e DELAY: 140. Determine o valor HEAT para cada filamento individual realizando uma prova RAMP (valor HEAT: RAMP + 25). </li><li> Agulhas de bisel num ângulo de 38 ° e velocidade de rotação intermediária a alta com um microgrinder para obter um tamanho de ponta de 20 a 30 μm para injetar no dia embrionário (E) 13,5 ou mais jovens e 30 a 40 μm para injetar em embriões mais velhosestágios. Para o armazenamento, coloque as agulhas em uma caixa ou placa Petri com argila de modelagem para evitar danos nas dicas. </li></ol></li><li> Solução de DNA de plasmídeo <ol><li> Prepare a construção de DNA de plasmídeo contendo proteína repórter fluorescente ( por exemplo, GFP) usando um kit de preparação maxi sem endotoxina de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Diluir a solução de DNA de plasmídeo até uma concentração final de 1 - 2 μg / μL em tampão Tris-EDTA isento de endotoxina contendo Fast Green a uma concentração final de 0,01%. Solução alíquota e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Solução Bacteriostática de Cloreto de Sódio <ol><li> Prepare a solução de cloreto de sódio bacteriostático adicionando álcool benzílico até uma concentração final de 0,9% na solução de cloreto de sódio isotônico a 0,9%. Solução de filtro estéril imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Solução de Injeção de Carprofen <ol><li> Prepare a solução de injeção de carprofen porAdicionando carprofeno a uma concentração final de 0,5 mg / mL a solução de cloreto de sódio isotônico esterilizado a 0,9%. Armazenar a 4 ° C por até 28 dias. </li></ol></li><li> Anestesia, injeção de DNA e eletroporação <ol><li> Pesar um mouse E14.5 cronometrado por gravidez e colocá-lo em uma câmara de anestesia transparente conectada a um vaporizador e saturada com 5% de isoflurano. Quando o animal estiver inconsciente, transfira-o para uma máscara de anestesia anexada a uma placa de aquecimento de 37 ° C e mantenha-se anestesiado com 1.8 a 2.2% de isoflurano. Nota: Avalie o desenvolvimento da anestesia cirúrgica por perda de pinça e reflexos do pedal (pressão do dedo do pé). </li><li> Para analgesia, injete 100 μL de solução de injeção de carprofen por 10 mg de peso corporal do mouse (5 mg / kg de peso corporal) por via subcutânea. Vire o mouse com as costas voltadas e cubra cuidadosamente os olhos com vaselina para evitar que se sectem. </li><li> Espalhe delicadamente os membros e repare-osPara a placa de aquecimento com fita cirúrgica. Esterilizar o abdômen com etanol a 70% seguido de solução de iodo (7,5 mg / mL) utilizando cotonete de celulose. Repita este procedimento três vezes para garantir uma desinfecção adequada. </li><li> Cubra o abdômen com gaze estéril em que uma incisão foi cortada para poupar um campo (diâmetro: 2 - 2,5 cm) para a incisão abdominal. Molhe a gaze com solução bacteriostática de cloreto de sódio. Cuidado: Reavaliar o desenvolvimento da anestesia cirúrgica pela perda do reflexo do pedal. </li><li> Usando Microps de Micro Adson (serrilhado, comprimento: 12 cm) e tesoura fina (angulado ao lado, comprimento: 9 cm) corte a pele aproximadamente 1,5 cm ao longo da linha média do abdômen. Corte o músculo subjacente ao longo da linea alba. </li><li> Remova um cuerno uterino com fórceps de anel (comprimento: 9 cm, diâmetro externo: 3 mm, diâmetro interno: 2,2 mm) e coloque-o suavemente sobre a gaze úmida. Cuidado: segure o cuerno uterino com fórceps de anel apenas entre embriões eD não perturbe as placentas ou quaisquer vasos de abastecimento. Mantenha o útero úmido o tempo todo com solução bacteriostática de cloreto de sódio. </li><li> Coloque cuidadosamente um embrião com fórceps de anel e localize o ventrículo lateral, que se apresenta como uma sombra em forma de crescente paralela ao seio sagital. O local da injeção situa-se aproximadamente no meio de uma linha entre o olho pigmentado e a confluência dos seios, onde o seio sagital se ramifica para dois seios transversais. Empurre a agulha de microinjeção através da parede uterina e no ventrículo lateral. Nota: Se necessário, a profundidade da injeção pode ser corrigida pela retração da agulha. </li><li> Injetar 1 a 2 μL de solução de DNA no ventrículo lateral com um microinjetor, que é operado com um pedal, usando as seguintes configurações: 25 psi, 10 a 20 ms por pulso e 5 a 10 pulsos. A injeção bem sucedida pode ser monitorada pela solução de DNA colorida, que deve preencher o sistema ventricular. </li><li> Coloque os eletrodos de tipo pinça (diâmetro de 3 mm para E13.5 ou mais novo e 5 mm de diâmetro para E14.5 ou mais) de tal forma que o terminal &quot;positivo&quot; esteja do mesmo lado que o ventrículo injetado e o &quot;negativo&quot; O terminal está no lado oposto do ventrículo injetado abaixo da orelha da cabeça do embrião. </li><li> Humedecer o local de eletroporação com algumas gotas de solução bacteriostática de cloreto de sódio e aplicar 5 pulsos de corrente elétrica (35 V para E13,5 ou mais jovens e 40 V para E14,5 ou mais) com uma duração de 50 ms com intervalos de 950 ms. Nota: Correntes de 60 a 90 mA são geralmente suficientes para uma eletroporação bem-sucedida. As correntes mais baixas não vão efetivamente transfectar neurônios, enquanto correntes mais altas podem levar à morte embrionária. </li><li> Repita o procedimento (ver Etapa 1.5.7 a 1.5.10.) Para cada embrião do cuerno uterino e coloque-o suavemente na cavidade abdominal. </li><li> Remova o chifre uterino do outro lado e repita o procEdure descrito no Passo 1.5.7. Para 1,5.11. </li><li> Feche a cavidade abdominal suturando a camada muscular antes de suturar a pele usando o MicroAdson Forceps, o suporte da agulha Mathieu (carboneto de tungstênio, comprimento: 14 cm) e a sutura cirúrgica não absorvível (3/8 círculo, 13 mm, ponto afilado). Cuidado: tenha cuidado para não capturar o útero ou quaisquer outros órgãos durante a sutura. </li><li> Desinfecte cuidadosamente a sutura da pele com solução de iodo (7,5 mg / mL) e remova suavemente o excesso periocular de vaselina usando cotonetes de celulose. Coloque o mouse sob uma lâmpada infravermelha até que ele acorde. Monitore o mouse com atenção de perto durante os próximos dois dias. Repita o tratamento com analgesia conforme descrito na Etapa 1.5.2 após 12 a 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Cultura Organotypic Slice <ol><li> Laminin Stock Solution <ol><li> Dissolver 1 mg de laminina liofilizada em água estéril para obter uma solução de reserva de laminina de 1 mg / mL. Prepare alíquotas de 50 μL aE armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Solução de estoque de poli-L-lisina <ol><li> Dissolver 50 mg de poli-L-lisina em água estéril para obter uma solução de reserva de poli-L-lisina de 1 mg / mL. Prepare alíquotas de 0,5 mL e armazene a -20 ° C. </li></ol></li><li> Complete a solução de sal equilibrada de Hank (Complete HBSS) <ol><li> Prepare o HBSS completo combinando 50 mL de solução de HBSS 10x, 1,25 mL de tampão HEPES 1 M (pH 7,4), 15 mL de solução de D-glicose 1 M, 5 mL de solução de cloreto de cálcio 100 mM, 5 mL de sulfato de magnésio 100 mM Solução e 2 mL de solução de hidrogenocarbonato de sódio 1 M. Adicione água estéril até 0,5 L, filtro estéril e armazene a 4 ° C. </li></ol></li><li> Slice Culture Medium <ol><li> Combine 35 mL de Águia Média Basal (BME), 12,9 mL de HBSS completo (ver secção 2.3.1.), 1,35 mL de D-glucose em 1 M, 0,25 mL de L-glutamina 200 mM e 0,5 mL de penicilina-estreptomicina para Obter 50 mL de cultura de fatiamédio. Filtro estéril e adicione soro de cavalo a uma concentração final de 5%. Armazenar a 4 ° C por até 4 semanas. </li></ol></li><li> Solução de Agarose de baixo ponto de fusão (LMP) <ol><li> Prepare 3% de solução de agarose de LMP dissolvendo 1,5 g de agarose de LMP em 50 mL de HBSS completo por aquecimento em um forno de microondas durante 1 a 2 minutos com potência intermediária. Nota: Monitorar o calor cuidadosamente para evitar o excesso durante a ebulição. </li><li> Coloque a solução em banho-maria a 38 ° C até estar pronta para uso. Armazenar a 4 ° C e reutilizar uma vez. </li></ol></li><li> Revestimento de inserções de membrana <ol><li> Adicione uma alíquota da solução-mãe de laminina (ver Etapa 2.1.1.) E uma alíquota de solução de reserva de poli-L-lisina (ver Etapa 2.2.1.) A 6 mL de água estéril para obter solução de revestimento (suficiente para 6 inserções) . </li><li> Coloque as inserções de membrana em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de água estéril no fundo de cada poço. Adicione 1 mL de solução de revestimento(Ver Passo 2.6.1.) Em cima de cada membrana e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Nota: use apenas inserções com membranas opticamente limpas, como a membrana de politetrafluoroetileno (PTFE). </li><li> Lave as membranas três vezes com 1 mL de água estéril e seque. Use membranas revestidas no mesmo dia ou guarde em uma placa limpa de 6 poços a 4 ° C por até quatro semanas. </li></ol></li><li> Dissecção e Incorporação de Cérebro <ol><li> Dois dias após a eletroporação, coloque o mouse em uma câmara transparente conectada a um vaporizador e saturada com 5% de isoflurano. Quando o animal está inconsciente, remova-o da câmara e sacrifique-o pela luxação cervical. </li><li> Remova o útero que contém os embriões e coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm com HBSS completo gelado. Nota: A partir deste momento, mantenha todas as soluções, embriões e cérebros no gelo. </li><li> Use um estereomicroscópio, pinça com ponta fina (reta,11 cm) e um par de tesouras de mola Vannas Tübingen (angulado, comprimento: 9,5 cm) para separar cada embrião do útero e transferi-lo para outro prato de Petri contendo HBSS completo gelado. </li><li> Faça uma incisão ao nível do tronco cerebral e corte ao longo da linha medial sagital. Retire a pele e a cartilagem cobrindo o cérebro. Então, corte o tronco cerebral logo atrás dos hemisférios e remova o cérebro do crânio. Transfira o cérebro com uma espátula de microcuadrinha (185 mm x 5 mm) para uma placa de 12 poços contendo HBSS completa gelada. Recolher todos os cérebros da ninhada na placa de 12 poços. </li><li> Use um estereomicroscópio fluorescente para exibir os cérebros na placa de 12 poços para brilho de fluorescência, bem como o tamanho da região eletroporada. Selecione 2 a 4 cérebros com sinais fluorescentes brilhantes no córtex somatossensorial presumido para posterior processamento. </li><li> Despeje 3% de solução de agarose LMP mantida a 38 ° C em um molde de encaixe descartável descartável. RemoçãoE cérebro da placa de 12 poços com uma espátula de microcuadrinha e drenar cuidadosamente excesso de HBSS completo ao redor do cérebro usando papel de seda fino. </li><li> Coloque o cérebro suavemente na solução de agarose, empurre-o para o fundo do molde e ajuste cuidadosamente sua posição usando uma agulha de calibre 20. Para seções coronais, oriente o cérebro com as lâmpadas olfativas apontando para cima. Mantenha o molde sobre gelo até que a solução de agarose seja solidificada e continue com o corte do cérebro. </li></ol></li><li> Vibratome Seção e Cultura de fatia <ol><li> Remova o bloco de agarose do molde e coloque-o sobre a tampa de uma placa de Petri estéril. Cortar o excesso de agarose com uma lâmina de barbear limpa deixando aproximadamente 2 a 3 mm abaixo das lâmpadas olfativas e 1 mm de agarose nos outros lados. Corrija o bloqueio de agarose aparado com as lâmpadas olfativas apontando para baixo em um estágio de amostra usando cola de cianoacrilato. Nota: esterilize instrumentos e equipamentos com 70% de etanoAntes da seção. </li><li> Transfira o estágio da amostra para a câmara de corte de um microtome de lâmina vibratória contendo HBSS completo gelado e posicione o cérebro com o lado dorsal em direção à lâmina. Corte fatias cerebrais de 250 μm de espessura contendo a região eletroporada com uma amplitude baixa a moderada de 0,9 mm e uma velocidade de corte muito lenta de 0,09-0,12 mm / s. Geralmente, 4 a 6 fatias com sinal fluorescente brilhante são obtidas de cada cérebro eletroporado com sucesso. </li><li> Com uma espátula de microcuadre dobrada e uma pinça de pontas finas, transfira cuidadosamente as fatias de cérebro com a agarose circundante para uma placa de 6 poços contendo HBSS completo gelada. Cuidado: tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral, apenas tocando na borda de agarose em torno das seções com a pinça durante a transferência. </li><li> Processe todos os cérebros selecionados conforme descrito nas Etapas 2.8.1. Para 2.8.3. </li><li> Humedecer as inserções de membrana com 100 μL de HBSS completo antes de colocar o cérebro slGelifica as membranas para facilitar o posicionamento das fatias. Podem ser colocadas até 5 fatias em 1 inserção de membrana. </li><li> Transfira com cuidado as fatias para as membranas usando uma espátula de microcuadrinha dobrada e fórceps de ponta fina. Puxe suavemente uma fatia sobre a espátula, tocando apenas o rebordo de agarose com a pinça e empurre suavemente a fatia da espátula para dentro da membrana. Posicione a fatia usando fórceps e continue a transferir as fatias restantes. Remova o excesso de HBSS completo com uma pipeta. Nota: Não se sobrepõem as fatias entre si. </li><li> Com a ajuda das pinças, coloque cuidadosamente as inserções de membrana com as fatias em uma placa de 6 poços contendo 1,8 mL de meio de cultura de fatia (ver Etapa 2.4.1) e incuba a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono até o lapso de tempo Imagem. </li></ol></li></ol> 3. Time-Lapse Imaging <ol><li> Configuração do microscópio <ol><li> Defina uma câmara climática colocada no palco de umMicroscópio confocal invertido a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Use um detector híbrido para reduzir a intensidade do laser e melhorar a viabilidade celular. Para uma análise detalhada, use uma distância de trabalho extra-longa com objetivo 40X seco com uma abertura numérica de 0,6 ou superior. Nota: Todos os componentes do microscópio precisam ser pré-aquecidos a 37 ° C por 2 a 3 h antes da imagem para fornecer um foco estável durante o processo de imagem. </li></ol></li><li> Imagem de fatia <ol><li> Selecione uma fatia de cérebro para imagem a partir da placa de 6 poços contendo as inserções de membrana usando um microscópio de fluorescência invertido. Cuidado: Evite o tempo prolongado de exposição à luz ultravioleta, pois isso pode causar fotodiodo celular. Nota: Selecione uma fatia com neurônios simples brilhantes na SVZ superior, migrando radialmente para a superfície do pia da fatia. Processos finos fluorescentes de células gliais radiais que abrangem todo o CP indicam um andaime radial glato intacto, que é usadoD por neurônios corticais que migram radialmente. </li><li> Transfira a inserção da membrana com a fatia, que foi selecionada para imagens de lapso de tempo, em um prato de fundo de vidro de 50 mm de diâmetro contendo 2 ml de meio de cultura de fatia com a ajuda da pinça. Coloque o prato na câmara climática do microscópio confocal. </li><li> Defina a resolução para 512 em 512 pixels e aumente a velocidade de varredura de 400 Hz para 700 Hz para aumentar a taxa de quadros de cerca de 1,4 a cerca de 2,5 quadros por segundo, respectivamente. Não utilize mais de duas vezes a média. Defina uma pilha z através da região eletroporada (geralmente 400-100 μm) com um tamanho de passo de 1,5 μm. Coletivamente, essas configurações permitem uma resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo o fotodamato baixo durante a aquisição. Comece a série de lapso de tempo pegando uma empilha em z de cada 30 min. Nota: A exposição prolongada da fatia à luz laser irá induzir a fotodinâmica reduzindo a viabilidade das células. Ajustar o expTempo de exposição à luz laser em conformidade. </li><li> Analise as séries de lapso de tempo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) ou equivalente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J. J., Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multipolar+stage+and+disruptions+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The multipolar stage and disruptions in neuronal migration.</a> Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+mechanisms+of+neuronal+migration+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation.</a> Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).</li>
<li>Wiegreffe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+%28Ctip1%29+Controls+Migration+of+Cortical+Projection+Neurons+through+Regulation+of+Sema3c%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c.</a> Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).</li>
<li>John, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+is+required+for+neuronal+morphogenesis+and+sensory+circuit+formation+in+dorsal+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development.</a> Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), pl9(2002).</li>
<li>Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+of+neocortical+projection+neuron+specification%2C+development+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> J Vis Exp. (90), e51518(2014).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+organotypic+slice+culture+of+mouse+hippocampal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).</li>
<li>Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dose-dependent+cortical+neuronal+migration+and+neurite+extension+defects+in+Lis1+and+Ndel1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice.</a> J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).</li>
<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).</li>
<li>Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+analyzing+neuronal+progenitor+development+and+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).</li>
<li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A migração radial é um processo chave no desenvolvimento do neocórtex. As mutações em genes que afetam diferentes etapas deste processo podem causar malformações corticais graves, incluindo hepatite lissencefálica e heterotopia de matéria branca 1 , 2 . Recentemente, mostramos que Bcl11a, que é expressa em jovens neurônios de projeção cortical migratória, desempenha um papel na migração radial. Utilizamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratór...

O neocórtex é o principal site de funções cognitivas, emocionais e sensório-motoras. É composto de seis camadas horizontais orientadas em paralelo à superfície do cérebro. Durante o desenvolvimento, as células progenitoras na parede lateral do telencefalo dorsal dão origem a neurônios de projeção que migram radialmente para a superfície do pial e adquirem uma identidade neuronal específica do tipo de camada. Depois de serem geradas nas zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ), esses neurônios se tornam transitoriamente multipolar e diminuem sua migração. Após uma curta permanência na zona intermediária (IZ), eles mudam para uma morfologia bipolar, se prende ao andaime radial e continuam a migração orientada radialmente para a placa cortical (CP). Ao atingir o objetivo final, os neurônios de projeção se separam dos processos de glial radiais e adquirem identidade específica da camada. Mutações em genes que afetam diferentes etapas da migração neuronal podem causar malformação cortical grave, como lissencHematopia de IFF ou de matéria branca 1 , 2 . A eletroporação in utero é uma técnica rápida e poderosa para transfectar células progenitoras neurais no cérebro em desenvolvimento de embriões de roedores 3 , 4 . Com esta técnica, é possível derrubar e / ou sobre-expressar genes de interesse para estudar suas funções no desenvolvimento de neurônios. Este método ajudou especificamente a descrever os detalhes morfológicos e a caracterizar os mecanismos moleculares do processo de migração radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Os neurônios de migração radial sofrem alterações dinâmicas na forma celular, velocidade de migração, bem como direção migratória, que requerem observação direta e contínua ao longo do tempo. Cultivo de fatias organotípicasA imagem confocal re e time-lapse de cérebros eletroporados permite observar diretamente os neurônios migratórios ao longo do tempo. Usando essa abordagem combinada, é possível analisar características distintas de neurônios migratórios que não podem ser investigados em seções de tecido fixo de cérebros eletroporados. Recentemente, aplicamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratórios em culturas de fatia de cérebros eletroporados para estudar o papel do fator de transcrição CLL / linfoma 11a (Bcl11a) durante o desenvolvimento cortical 10 . Bcl11a é expressa em jovens neurônios corticais migratórios e utilizamos um alelo Bcl11a condicional condicional ( Bcl11a flox ) 11 para estudar suas funções. A eletroporação da recombinase Cre juntamente com a proteína fluorescente verde (GFP) em progenitores corticais dos cérebros BCL11a flox / flox nos permitiu criar uma situação de mutante de mosaico, na qual apenas algumas células são mutadas em umaDe outra forma, tipo selvagem. Desta forma, foi possível estudar as funções autônomas celulares de Bcl11a no nível de célula única. Descobrimos que os neurônios mutantes Bcl11a exibem velocidade reduzida, mudanças em seus perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação aleatórias durante a migração 10 . No protocolo delineado, descrevemos um fluxo de trabalho para a eletroporação bem sucedida e preparação de cultura de fatia 12 de cérebros de mouse, bem como imagens confocais de lapso de tempo de culturas de fatia cortical.

<table><tbody><tr><td>isoflurano</td><td>Abbott Laboratories</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>sutura cirúrgica não absorvível</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 círculo, 13 mm, ponta cônica</td></tr><tr><td>Micro Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td>serrilhado, comprimento: 12 cm</td></tr><tr><td>tesoura fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td>inclinado para o lado, comprimento: 9 cm</td></tr><tr><td>Suporte de Agulha Mathieu</td><td>Ferramentas</td> de Ciência Fina <td>12510-14</td><td>carboneto de tungstênio, comprimento: pinça</td></tr><tr><td>de ponta fina</td> de 14 cm <td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11370-40</td><td>reta, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; bingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>inclinado para cima, 9,5 cm</td></tr><tr><td>pinça de anel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3mm, ID, 2,2 mm, comprimento: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>soro de cavalo</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26050088</tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidro borossilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>sistema de anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>câmara de anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>recipiente de filtro fluosorber</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de lâmina vibratória</td> de 16520100 <td></td><td></td> de agarose de baixo ponto de fusão Leica VT1200 S <td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo de fluorescência</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Microscópio de cultura de tecidos de fluorescência invertida Leica M125 Leica DM IL LED <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr><tr><td>detector híbrido</td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>objetiva, 40x/0,60 NA</td><td>Sistema</td> de controle de temperatura para microscópio <td>Leica 11506201</td><td></td></tr> Life <tr><td></td><td>Imaging Services</td><td>Cube, Brick & Inserção</td> de cultura de células em caixa <td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td>usa ângulo de 38&deg; para chanfrar</td></tr><tr><td>o microinjetor</td><td>Parker Hannifin&nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofeno</td><td>Pfizer Saúde Animal</td><td>NDC 61106-8507</td><td>Molde de emdedding Rimadyl</td></tr><tr><td></td><td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>kit maxi de plasmídeo livre de endotoxinas</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>verde rápido</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magensium</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>eletroporador de onda quadrada</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>pinças com elétrodos de disco de platina de 5 mm</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>filamento de caixa</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td> Espátula de microcolher de <td>2,5 mm x 2,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>231-0191</td> Prato com fundo de vidro <td>de 185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>, 50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário usando<em&gt; em utero</em&gt; electroporação

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

A eletroporação in utero é uma abordagem rápida e poderosa para estudar o processo de migração radial no córtex cerebral do desenvolvimento de embriões de ratos. Ele ajudou a descrever os diferentes passos da migração radial e caracterizar os mecanismos moleculares que controlam esse processo. Para analisar de forma direta e dinâmica os neurônios migratórios, eles devem ser rastreados ao longo do tempo. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que combina in utero eletroporação com cultura de fatias organotípicas e imagens confocais temporizadas, o que permite um exame direto e análise dinâmica de neurônios corticais de migração radial. Além disso, é possível caracterizar detalhadamente neurônios migratórios, como velocidade de migração, perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação radial. O método pode ser facilmente adaptado para realizar análises funcionais de genes de interesse em neurônios corticais de migração radial por perda e ganho de função, bem como experiências de resgate. Espaço de tempoA imagem dos neurônios migratórios é uma técnica de última geração que, uma vez estabelecida, é uma ferramenta potente para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral em modelos de ratos de transtornos de migração neuronal.

Anteriormente, mostrámos que a eliminação genética de BCL11A por electroporação em útero prejudica a migração radial da camada superior de neurónios de projecção final-nascido 10. A eletroporação de um vector de plasmídeo de DNA contendo Cre-IRES-GFP eliminou eficientemente Bcl11a em cérebros Bcl11a flox / flox condicionais 11 . Quando analisamos os céreos eletroporados E14.5 três dias...

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

O objetivo geral deste procedimento é observar diretamente neurônios em migração radial em culturas de fatias organotípicas preparadas a partir de cérebros embrionários eletroporados, utilizando microscopia confocal com lapso de tempo. Este método pode auxiliar no estudo de aspectos-chave do desenvolvimento do neocórtex. Ele permite a investigação dos mecanismos moleculares envolvidos na polarização neuronal e na migração radial dos neurônios até sua posição final dentro do cérebro.A principal vantagem dessa técnica é que as propriedades dinâmicas dos neurônios migratórios podem ser analisadas, incluindo perfis de velocidade, velocidade média de migração e alterações na direção migratória. Comece posicionando um camundongo grávido devidamente anestesiado em posição supina sobre uma placa aquecida. Verifique a ausência do reflexo plantar.Em seguida, cubra cuidadosamente os olhos com vaselina para evitar que sequem. Depois, estenda suavemente os membros e fixe-os à placa de aquecimento com fita cirúrgica. Esterilize o abdômen esfregando com etanol 70%, seguido de solução de iodo, e então coloque uma gaze estéril, na qual foi feito um corte para a incisão abdominal, sobre o abdômen.Umedeça a gaze com solução de cloreto de sódio bacteriostático. Após reavaliar o desenvolvimento da anestesia cirúrgica pela perda do reflexo plantar, utilize pin&ccedil;as micro Adson serrilhadas e tesoura fina angulada para cortar a pele aproximadamente 1,5 cent&iacute;metro ao longo da linha m&eacute;dia do abd&ocirc;men. Em seguida, corte o m&uacute;sculo subjacente ao longo da linha alba.Segure o corno uterino entre os embriões com pin&ccedil;as de anel e coloque-o suavemente sobre a gaze umedecida sem perturbar as placentas ou os vasos sangu&iacute;neos. Em seguida, posicione cuidadosamente um embri&atilde;o para obter uma vis&atilde;o clara do ventr&iacute;culo lateral, que se apresenta como uma sombra com formato de crescente paralela ao seio sagital. O local de inje&ccedil;&atilde;o situa-se no meio de uma linha entre o olho pigmentado e a conflu&ecirc;ncia dos seios, onde o seio sagital se ramifica em dois seios transversos.Uma vez identificado, empurre a agulha de microinjeção através da parede uterina e até o ventrículo lateral. Em seguida, utilize um microinjetor operado com um pedal para injetar um a dois microlitros de solução de DNA com cinco a 10 pulsos. A injeção bem-sucedida pode ser monitorada pela solução colorida de DNA, que deve preencher o sistema ventricular.Em seguida, posicione eletrodos do tipo pinça de modo que o terminal positivo fique do mesmo lado do ventrículo injetado e o terminal negativo do lado oposto ao ventrículo injetado, abaixo da orelha da cabeça do embrião. Umedeça o local da eletroporação com algumas gotas de solução bacteriostática de cloreto de sódio e aplique cinco pulsos de corrente elétrica com duração de 50 milissegundos e intervalos de 950 milissegundos. A formação de bolhas no eletrodo negativo indica a passagem de corrente elétrica.De 60 a 90 miliamperes geralmente são suficientes para uma eletroporação bem-sucedida. Correntes mais baixas não transfectarão os neurônios de forma eficiente, enquanto correntes mais altas podem levar à morte embrionária. Após repetir o procedimento para cada embrião do primeiro corno uterino, coloque-o suavemente de volta na cavidade abdominal.Após suturar a camada muscular e a pele, desinfete cuidadosamente com solução de iodo e remova suavemente a vaselina dos olhos usando cotonetes de celulose. Coloque o camundongo sob uma lâmpada de infravermelho até que ele acorde. Após eutanasiar a fêmea grávida utilizando um método aprovado, remova o útero contendo os embriões e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros com HBSS completo gelado.A partir deste momento, mantenha todas as soluções, embriões e cérebros em gelo. Enquanto trabalha sob um microscópio estereoscópico, use pinças de ponta fina e uma tesoura de mola Vannas Tubingen para separar cada embrião do útero. Transfira os embriões para outro recipiente de Petri contendo HBSS completo gelado.Realize uma incisão ao nível do tronco encefálico e corte ao longo da linha média sagital. Retire a pele e a cartilagem que recobrem o cérebro. Em seguida, corte o tronco encefálico logo atrás dos hemisférios e remova o cérebro do crânio.Transfira o cérebro com uma espátula microespátula para uma placa de 12 poços contendo HBSS completo gelado. Colete todos os cérebros da ninhada na placa de 12 poços. Em seguida, utilize um estereomicroscópio fluorescente para analisar os cérebros na placa de 12 poços quanto à intensidade da fluorescência, bem como ao tamanho da região eletroporada.Selecione dois a quatro cérebros com sinais fluorescentes intensos e a córtex somatossensorial presumida para processamento adicional. Em seguida, despeje uma solução fundida de agarose de ponto de fusão baixa a 3% em um molde descartável removível. Use uma espátula microespátula para remover o cérebro da placa de 12 poços e drenar cuidadosamente o excesso de HBSS completo ao redor do cérebro usando papel-toalha fino.Coloque delicadamente o cérebro na solução de agarose. Em seguida, use uma agulha de 20 gauge para empurrá-lo até o fundo do molde e ajuste cuidadosamente sua posição. Para seções coronais, oriente o cérebro com os bulbos olfativos voltados para cima.Mantenha o molde em gelo até que a solução de agarose esteja solidificada e, em seguida, prossiga para o corte do cérebro. Use uma lâmina de barbear limpa para remover o excesso de agarose ao redor do cérebro, deixando aproximadamente um milímetro de agarose em todos os lados, exceto nos bulbos olfativos, onde devem ser deixados dois a três milímetros de agarose. Após aplicar uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato em um espécime, fixe o bloco de agarose aparado com os bulbos olfativos voltados para baixo.Transfira a platina do espécime para a câmara de corte de um micrótomo de lâmina vibratória contendo HBSS completo gelado e posicione o cérebro com seu lado dorsal voltado para a lâmina. Corte fatias cerebrais de 250 mícrons de espessura contendo a região eletroporada com uma amplitude baixa a moderada e uma velocidade de corte muito lenta. Normalmente, obtêm-se quatro a seis fatias com sinal fluorescente intenso de cada cérebro com eletroporação bem-sucedida.Segure a borda de agarose de uma seção com pin&ccedil;as de ponta fina e puxe a fatia para uma esp&aacute;tula microc&ocirc;nica curvada. Dessa forma, transfira cuidadosamente as fatias cerebrais para uma placa de seis po&ccedil;os contendo HBSS completo gelado. Umede&ccedil;a os insertos de membrana revestidos com laminina com 100 microlitros de HBSS completo.Em seguida, transfira cuidadosamente as fatias para as membranas utilizando a espátula microcônica curvada e pinça. Empurre suavemente a fatia da espátula para a membrana, depois posicione-a com a pinça. Continue transferindo as fatias restantes.Até cinco fatias podem ser colocadas em um inserto de membrana. Remova o HBSS completo em excesso com uma pipeta. Em seguida, com a ajuda de pinças, coloque cuidadosamente os insertos de membrana com as fatias em uma placa de seis poços contendo 1,8 mililitro de meio de cultura para fatias.Selecione uma fatia de cérebro para imagem ao visualizar as fatias por meio de um microscópio invertido. Escolha uma fatia com neurônios individuais brilhantes na zona ventricular subventricular superior migrando radialmente em direção à superfície da pilha da fatia. A presença de finos processos fluorescentes de células gliais radiais que percorrem toda a placa conjugada indica um suporte de células gliais radiais intacto, que é utilizado por neurônios conjugados em migração.Transfira o inserto de membrana com um corte selecionado para um recipiente de vidro com fundo de 50 milímetros de diâmetro contendo dois mililitros de meio de cultura de cortes. Coloque o recipiente na câmara climática do microscópio confocal. Defina a resolução para 512 por 512 pixels.Aumente a velocidade de varredura de 400 hertz para 700 hertz para elevar a taxa de quadros de aproximadamente 1,4 para cerca de 2,5 quadros por segundo. Utilize no máximo duas vezes a média. Defina uma pilha Z através da região eletroporada com um tamanho de passo de 1,5 micrômetros.Inicie a série de imagens em intervalos regulares adquirindo uma pilha Z a cada 30 minutos. As configurações descritas permitem uma resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo baixo o dano fotônico durante a aquisição. Este filme mostra neurônios corticais de E16,5 migrando das zonas subventricular ventricular até a placa cortical.No camundongo transgênico condicional com Bcl11a floxado após eletroporação do plasmídeo controle IRES-GFP no dia 14,5 de desenvolvimento embrionário. O vídeo é composto por 108 quadros na taxa de cinco quadros por segundo. A barra de escala representa 100 mícrons.A eletroporação de um vetor plasmídeo de DNA contendo Cre-IRES-GFP afetou a migração de neurônios corticais em cérebros condicionais com Bcl11a floxado. Como visto aqui, pouquíssimos neurônios migram além da zona intermediária para alcançar a placa cortical. Este vídeo mostra a polarização de neurônios corticais de um controle marcado com GFP à esquerda em comparação com neurônios de um mutante Bcl11a à direita.Esses tra&ccedil;os animados representativos do controle em neur&ocirc;nios mutantes de Bcl11a foram obtidos a partir de s&eacute;ries de imagens temporais de culturas de fatias de E16,5 com resolu&ccedil;&atilde;o de uma hora. Novamente, os dados do c&eacute;rebro controle s&atilde;o mostrados &agrave; esquerda e os dados do c&eacute;rebro eletroporado com Cre-IRES-GFP s&atilde;o mostrados &agrave; direita. Como visto nesta cole&ccedil;&atilde;o de tra&ccedil;os representativos de culturas de fatias controle e mutantes de Bcl11a, os neur&ocirc;nios mutantes de Bcl11a frequentemente passam por fases repetitivas de redu&ccedil;&atilde;o da velocidade de migra&ccedil;&atilde;o e mudan&ccedil;a aleat&oacute;ria de orienta&ccedil;&atilde;o, conforme indicado pelas cabe&ccedil;as de seta vermelhas.Os perfis de velocidade podem ser calculados a partir de rastros de neurônios migratórios. Como visto aqui, uma proporção maior de neurônios mutantes de Bcl11a apresenta velocidades de migração mais lentas em comparação com os controles. O ângulo de desvio pode ser calculado a partir dos dados dos rastros.Como visto neste histograma, os neurônios mutantes de Bcl11a representados pelas barras pretas exibem maiores ângulos de desvio em comparação com os controles. Após dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas cada para a eletroporação intra-útero e para a preparação de culturas de fatias cerebrais organotípicas. Este procedimento pode facilmente ser adaptado para realizar análise fracional de genes de interesse em neurônios corticais migratórios radiais por ganho e perda de função, bem como experimentos vasculares.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como observar diretamente neurônios em migração radial em culturas de fatias organotípicas preparadas a partir de cérebros embrionários eletroporados por meio de microscopia confocal com lapso de tempo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Aprenda a observar neurônios corticais migratórios em cultura de fatias organotípicas de cérebro de mouse embrionário usando eletroporação in utero e microscopia confocal de lapso de tempo.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando Em Utero Electroporação (Vídeo) | JoVE Journal

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando

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