Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela RIP-Tag; RIP-tva modelo murino
16 de outubro de 2017
Apresentamos um protocolo para demonstrar um sistema de transferência de gene somática romance utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato para estudar a função dos genes em metástase. Os retrovírus aviária são entregues intracardiacally para garantir a transferência de genes em lesões pré-malignas, não-invasivas de células β do pâncreas em ratos adultos.
O objetivo geral deste procedimento é identificar e caracterizar fatores metastáticos por transferência de genes para o novo RIP-Tag; Modelo de mouse RIP-tva. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase do câncer, como identificar os drivers e os novos alvos terapêuticos. A principal vantagem deste modelo de câncer em camundongos é identificar fatores metastáticos por transferência de genes somáticos para legiões precursoras de células beta pancreáticas
.Comece colhendo um prato de 15 centímetros de células DF1 produtoras de vírus por camundongo a ser infectado. Primeiro, colete o meio dos pratos confluentes de 15 centímetros. Em seguida, remova os detritos celulares por centrifugação de baixa velocidade em uma centrífuga pré-resfriada por 10 minutos a 1650 vezes G e quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira o sobrenadante viral para tubos de ultracentrífuga polialômeros. Gire em uma ultracentrífuga por 1,5 horas a 9540 vezes G e quatro graus Celsius. Remova o máximo possível de sobrenadante dos tubos da ultracentrífuga.
Em seguida, adicione PBS ao tubo de ultracentrífuga para fazer a suspensão viral final de 100 microlitros por prato de 15 centímetros. Cubra os tubos com filme de laboratório e ressuspenda o pellet viral invisível por vórtice por dois minutos em velocidade média. Em seguida, balance os tubos da ultracentrífuga a quatro graus Celsius por uma hora ou durante a noite.
Após a incubação, transferir a suspensão viral para um tubo de microcentrífuga e proceder à titulação do vírus. Inicie o procedimento de titulação garantindo que as células DF1 assentadas em placas de cultura de tecidos de 12 poços tenham atingido 30% de confluência. Uma placa de doze poços é necessária para cada determinação de título viral.
Comece uma diluição em série de dez vezes dos sobrenadantes virais misturando primeiro cinco microlitros de sobrenadante viral com 495 microlitros de meio de crescimento em um tubo de microcentrífuga para fazer uma diluição de dez para a segunda. Vórtice brevemente por alguns segundos. Em seguida, transfira 40 microlitros da diluição dez para a segunda para 360 microlitros de meio de crescimento em um tubo de microcentrífuga para a diluição dez para a terceira.
Vórtice brevemente por alguns segundos. Continue este processo para diluir para dez elevado a quarto e dez elevado a quinto. Em seguida, alíquota de 2,25 mililitros de meio de crescimento em cada um dos cinco tubos de poliestireno de seis mililitros.
E rotule-os de dez elevado ao sexto, dez elevado ao sétimo, dez elevado ao oitavo, dez elevado ao nono e dez elevado ao décimo, respectivamente. Misturar 0,25 mililitros da diluição de dez à quinta com 2,25 mililitros de meio de crescimento no tubo de poliestireno de seis mililitros para a diluição de dez à sexta. Vórtice brevemente por alguns segundos.
Repita o procedimento para dez até o sétimo, dez até o oitavo, dez até o nono e dez até o décimo diluições. Em seguida, remova o meio de cultura original das células DF1 nas placas de 12 poços. E adicione um mililitro de vírus diluído em cada poço em duplicata.
Deixe as células crescerem a 37 graus Celsius e 5 CO2 por pelo menos sete dias. Comece o procedimento de infecção anestesiando primeiro um camundongo RIP-Tag RIP-tva de sete semanas de idade. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
Raspe o cabelo da cavidade torácica do mouse RIP-Tag RIP-tva, posicione o mouse de costas com o peito voltado para cima em um papel de bancada de laboratório absorvente em cima de um aquecedor seguro para aconchego. Faça uma pinça no dedo do pé para verificar se o animal não responde e para confirmar o efeito anestésico completo. Estenda os membros dianteiros e prenda-os com fita adesiva.
Marque o peito do rato para injeção. Marque a localização a meio caminho entre a fúrcula esternal e o topo do processo xifóide e ligeiramente à esquerda anatomicamente do esterno. Em seguida, esfregue a parede torácica anterior com um esfoliante de iodopovidona ou clorexidina, seguido por um álcool isopropílico a 70% ou uma esponja de gaze embebida em etanol a 70%.
Aspire 50 microlitros de ar em uma seringa estéril de insulina de calibre 28,5 para criar espaço entre o êmbolo e o menisco de uma seringa de 500 microlitros. Elabore 100 microlitros de vírus. O espaço aéreo sem nenhum líquido na parede é crucial para ver o pulso cardíaco.
Mantenha a agulha na posição vertical, segure a pele do rato esticada com uma mão e insira a agulha no local marcado. Quando um pulso vermelho brilhante de sangue aparecer na seringa, pare de avançar a agulha e fixe a profundidade da agulha no mouse com uma mão. Use a outra mão para empurrar cuidadosa e lentamente o êmbolo para fornecer a suspensão viral por um período de cerca de 60 segundos.
Administre de 10 a 20 microlitros sempre que um pulso vermelho brilhante de sangue aparecer na seringa. A entrada contínua de sangue oxigenado vermelho no cubo transparente da agulha indica o posicionamento adequado da agulha no ventrículo esquerdo. Após o último empurrão do saque para entregar a suspensão viral e antes de ver o próximo pulso vermelho de sangue, retraia rapidamente a agulha para fora da cavidade torácica.
Aplique uma leve pressão sobre o local da injeção por pelo menos um minuto para reduzir o sangramento. Em seguida, mova cuidadosamente o mouse para uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor até que esteja totalmente consciente. Camundongos RIP-Tag RIP-tva foram infectados com o retrovírus RCASBP-Bcl-xL indicado às sete semanas de idade e sacrificados às 16 semanas de idade.
Esta fotografia mostra a coloração representativa da sinaptofisina de tumores neuroendócrinos pancreáticos metastáticos em linfonodos pancreáticos. Aqui, os camundongos RIP-Tag RIP-tva foram infectados com o RCASBP-RHAM B. Esta fotografia mostra a coloração representativa da sinaptofisina de tumores neuroendócrinos pancreáticos metastáticos nos linfonodos pancreáticos. Aqui, a coloração da sinaptofisina é observada no fígado após a injeção do vírus RCASBP-RHAMM B.
É importante lembrar que o título de mais de dez a oito unidades infecciosas por mililitro é necessário para a infecção in vivo de células TVA em proliferação em camundongos RIP-Tag RIP-tva e RCASBP retro viral rector pode fornecer CDNA até 2,5 quilobases. Após o desenvolvimento deste modelo de camundongo, ele abriu caminho para uma descoberta de mudança de paradigma de que o BCL-xL realmente promove metástase de câncer independente de sua função antiapoptótica.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para um novo sistema de transferência gênica somática utilizando o modelo de camundongo RIP-Tag; RIP-tva para investigar funções gênicas na metástase. O método envolve a administração intracardíaca de retrovírus aviários para direcionar lesões pré-malignas em células β pancreáticas em camundongos adultos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Terapia Genética
Contexto
- Compreender a metástase do câncer é fundamental para desenvolver terapias eficazes.
- O modelo de camundongo RIP-Tag; RIP-tva permite a transferência gênica direcionada.
- Retrovírus aviários podem ser usados para entrega gênica eficiente.
- Essa abordagem foca em lesões precursoras de células β pancreáticas.
Objetivo do Estudo
- Identificar e caracterizar fatores metastáticos por meio da transferência gênica.
- Explorar alvos terapêuticos potenciais no tratamento do câncer.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos que impulsionam a metástase.
Métodos Utilizados
- Coleta de células DF1 para produção de vírus.
- Coleta e centrifugação do meio de cultura celular.
- Administração intracardíaca de retrovírus para atingir lesões-alvo.
- Caracterização da função gênica em processos metastáticos.
Resultados Principais
- Transferência gênica bem-sucedida em lesões de células β pancreáticas.
- Identificação de fatores-chave envolvidos na metástase.
- Novos alvos terapêuticos potenciais para o tratamento do câncer.
- Validação do modelo RIP-Tag; RIP-tva para pesquisa em câncer.
Conclusões
- O protocolo demonstra um método eficaz para estudar metástase.
- As descobertas podem levar a avanços nas terapias contra o câncer.
- O modelo RIP-Tag; RIP-tva é uma ferramenta valiosa para pesquisas futuras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a identificação sistemática de genes que impulsionam a metástase em um modelo bem definido de tumor neuroendócrino pancreático, abordando uma lacuna crítica na validação pré-clínica de alvos. Ao permitir a transferência gênica somática em lesões premalignas, ele apoia a desmistificação mecanicista de alvos terapêuticos candidatos antes de estudos in vivo dispendiosos. A penetrância tumoral de 100% do modelo e seus estágios de progressão definidos fornecem uma plataforma reprodutível para avaliar a função gênica na metástase, informando diretamente decisões de confiança no alvo e triagem de portfólio na descoberta de fármacos oncológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao testar se genes específicos promovem ou suprimem metástase in vivo.
- Valor Operacional: Utiliza transferência gênica somática para contornar limitações da linhagem germinativa, permitindo testes rápidos de múltiplos candidatos na mesma base genética.
- Valor Preditivo: Identifica fatores que promovem metástase independentemente da apoptose, como demonstrado com BCL-xL, revelando mecanismos não canônicos que podem ser ignorados em ensaios padrão.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera linhagens celulares isogênicas metastáticas e não metastáticas a partir do mesmo contexto tumoral, permitindo comparação controlada da função gênica na invasão e colonização.
- Valor Operacional: Vetores retrovirais aviários alcançam infecção de alta eficiência em células que expressam TVA, favorecendo a produção escalável de linhagens celulares modificadas para ensaios posteriores.
- Prontidão para Ensaios: Títulos virais >1x10^8 UI/mL garantem infecção in vivo consistente, fornecendo um parâmetro quantitativo para reprodutibilidade experimental entre estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Caracteriza fatores metastáticos em um modelo que recapitula as fases da tumorigênese humana, da hiperplasia ao carcinoma invasivo, aumentando a relevância translacional.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal da metástase para órgãos como fígado e linfonodos por meio de imunohistoquímica, apoiando a validação histopatológica dos efeitos gênicos.
- Mitigação de Riscos: Identifica genes que induzem metástase sem exigir a formação do tumor primário, direcionando recursos para reguladores autênticos da metástase.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a geração de hipóteses sobre alvos até a validação pré-clínica, permitindo especificamente a validação funcional de genes associados à metástase identificados por meio de campanhas de triagem ou de abordagens ômicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir estudos de ganho ou perda de função em vias metastáticas dentro de um modelo tumoral definido.
- Triagem: Gera linhagens celulares padronizadas e geneticamente modificadas que podem ser utilizadas em ensaios de invasão, migração ou colonização para priorizar alvos identificados em triagens primárias.
- Análises: Fornece leituras quantitativas da carga metastática por meio da incidência tumoral em órgãos e pontuação histopatológica, permitindo comparações estatísticas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a função gênica com a progressão metastática em um sítio orgânico clinicamente relevante, apoiando o alinhamento de biomarcadores para validação posterior.
- Reutilização Empresarial: O modelo RIP-Tag;RIP-tva e o sistema retroviral baseado em DF1 podem ser reutilizados em múltiplos projetos, reduzindo os custos de re-desenvolvimento em estudos de metástase.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar a função metastática de genes dos seus efeitos no crescimento do tumor primário ou na apoptose.
- Valor Operacional: Padroniza a entrega gênica por injeção intracardíaca com títulos virais definidos, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios e reduzindo a variabilidade em ensaios de metástase.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar ou não ao distinguir verdadeiros promotores da metástase de alterações passageiras, evitando investimentos em falsos positivos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na atividade comprovada de promoção ou supressão da metástase, melhorando a eficiência do capital em pipelines oncológicos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia de camundongo, manipulação viral e protocolos de nível 2 de biossegurança para uso de retrovírus aviário.
- Depende de equipamento de ultracentrifugação para concentração viral e determinação de título por meio de ensaios de infecção em células DF1.
- Necessita padronização do título viral (>1x10^8 UI/mL) e do volume de injeção (100 µL) entre experimentos para garantir direcionamento consistente das lesões.
- Limitado a modelos que expressam TVA; adaptação a outros sistemas exige a geração de linhagens correspondentes positivas para o receptor.
- A avaliação de metástases depende de histologia terminal, exigindo suporte especializado em patologia para detecção de lesões em órgãos como fígado e linfonodos.
