Análise do elevado-throughput de comportamento Locomotor no ensaio de ilha de Drosophila
5 de novembro de 2017
O ensaio da ilha é um ensaio relativamente novo e econômico que pode ser usado para avaliar o comportamento locomotor básico de Drosophila melanogaster. Este manuscrito descreve algoritmos para processamento automático de dados e quantificação objetiva dos dados de ensaio de ilha, dificultando a ensaiar uma leitura sensível, elevado-throughput para telas grandes de genéticas ou farmacológicas.
O objetivo geral do ensaio de ilha é avaliar o comportamento locomotor básico de Drosophila melanogaster por meio de processamento automático de dados e quantificação objetiva. Este método pode ser utilizado para identificar reguladores-chave do comportamento locomotor, como genes implicados em distúrbios de movimento. Pode ser usado também para testar medicamentos que possam reverter tais defeitos.
A principal vantagem desta técnica é que permite a quantificação de alto rendimento do comportamento locomotor de Drosophila, tornando-a adequada para triagens em larga escala. Decidimos desenvolver esta metodologia para poder analisar um grande número de modelos de doenças. Precisávamos de uma análise automatizada de dados de imagem para tornar isso viável.
A demonstração visual deste método é muito útil. Várias etapas do processamento beta são cruciais e podem ser difíceis para novos usuários, especialmente aqueles não familiarizados com os pacotes de software em uso. Primeiro, prepare um mínimo de três frascos por condição experimental como réplicas biológicas.
Cada arquivo deve conter aproximadamente 15 moscas do mesmo sexo e idade semelhante. Importante: as moscas devem ter asas intactas. Crie as pastas para armazenar os experimentos.
Gere esses em uma estrutura de diretórios definida pelas condições e réplicas. Por exemplo, se o experimento tiver dois genótipos com cinco réplicas cada, crie uma pasta principal com a data do experimento e, dentro dessa pasta, crie uma subpasta para cada genótipo. Em seguida, dentro das pastas de genótipo, crie subpastas para cada réplica.
Em seguida, monte o aparelho de teste. Adicione água fria com uma pequena quantidade de sabão à bandeja do banho e posicione a plataforma no centro da bandeja, caso ainda não esteja fixada no banho. Cubra a bandeja e a plataforma com uma caixa transparente.
Para iluminar a plataforma, posicione uma lâmpada fria, como LEDs comuns de 12 volts, acima dela. Posicione também uma webcam conectada a um computador diretamente acima da plataforma. No computador, abra o software de gravação de imagens.
No sistema de menu, selecione a webcam apropriada como o dispositivo de captura. Coloque uma mosca morta na ilha para ajustar as configurações de vídeo. Ajuste o brilho, o contraste e a cor no software para que a mosca morta apareça preta sobre um fundo branco.
Em seguida, ajuste a configuração do filme com intervalo de tempo para salvar os filmes como arquivos AVI. Depois, navegue até o diretório onde os dados devem ser salvos e defina o nome do filme. Salve essas alterações.
Para a compressão dos dados de imagem, escolha o código Intel IYUV. Defina a velocidade de gravação como um quadro a cada 0,1 segundos e ajuste a taxa de reprodução correspondente para 10 imagens por segundo. Por fim, acesse as configurações avançadas e selecione Criar uma imagem bmp para cada quadro capturado.
Em seguida, navegue até o mesmo diretório que você escolheu para hospedar os arquivos AVI e pressione OK. Antes de iniciar, certifique-se de que a ilha esteja vazia e limpa. Então, inicie a gravação na interface de imagens com lapso de tempo do software de gravação de imagens.
Pegue um frasco contendo moscas e bata nele duas ou três vezes para derrubar todas as moscas para o fundo. Em seguida, remova rapidamente a tampa do frasco e bata vigorosamente para transferir as moscas para a plataforma. Elas devem atingir a plataforma mais ou menos ao mesmo tempo.
Dê às moscas até 30 segundos para saírem da plataforma, depois interrompa a gravação. Se necessário, remova manualmente quaisquer moscas restantes da plataforma. Antes de prosseguir para o próximo experimento, certifique-se de redefinir o diretório onde o próximo conjunto de dados será armazenado.
A primeira tarefa é produzir pilhas e projeções das séries de imagens coletadas. No Fiji, abra o Drosophila Island Assay. Na nova janela, insira o identificador da primeira série temporal de imagens.
Em seguida, selecione apenas o submacro criar pilha e projeção. Clique em OK e direcione o computador para a pasta que contém todas as subpastas com os experimentos individuais do ensaio de ilha. Após o processamento dos dados, dois novos arquivos aparecerão em cada subpasta experimental individual.
A próxima tarefa é definir a localização exata da plataforma nas imagens. Abra a interface gráfica e selecione a caixa de seleção definir plataforma. Em seguida, escolha o diretório onde as subpastas experimentais estão armazenadas.
A imagem de projeção e duas janelas serão abertas. Na primeira imagem, desenhe um polígono sobre a plataforma da ilha utilizando a ferramenta de seleção de polígono. Não inclua a linha de borda no perímetro da plataforma nesta seleção.
Adicione a seleção à janela do gerenciador de ROI clicando em adicionar na janela do gerenciador de ROI. Após adicionar a seleção ao gerenciador de ROI, ela aparecerá como um conjunto de valores. Em seguida, clique em ok na janela definir a plataforma.
O software avançará para a próxima imagem de projeção armazenada na pasta. Continue aplicando a mesma ROI para a plataforma na próxima imagem de projeção selecionando a ROI armazenada no gerenciador de ROI e confirmando essa ROI na janela definir a plataforma. Antes de prosseguir para a próxima imagem de projeção, certifique-se de que a plataforma não se moveu durante o experimento.
Se a posição da plataforma tiver mudado, clique com o botão esquerdo no centro da seleção e arraste-a para a posição desejada. Se a caixa de seleção não corresponder à plataforma, clique com o botão esquerdo fora da seleção e delimite uma nova seleção para a plataforma utilizando a ferramenta de polígono. Adicione esta nova seleção ao gerenciador de ROI.
Em seguida, verifique a nova seleção clicando em OK na janela de definição da plataforma e continue o procedimento até que todas as imagens tenham plataformas devidamente definidas. A última tarefa antes de processar os dados é definir o tamanho mínimo para uma mosca. Isso é explicado no protocolo textual.
Para quantificar as moscas que escapam da plataforma, primeiro, defina o tamanho mínimo da mosca. Em seguida, indique o número máximo de moscas em um arquivo dentro da série experimental. Inicie a função de análise e, ao receber a solicitação, selecione o diretório principal do experimento.
Após executar a macro, observe que um novo arquivo de resultados e uma nova pilha de imagens apareceram em cada pasta. Abra esses arquivos para garantir que o procedimento tenha funcionado corretamente. Inicie o pacote de software R ou RStudio e abra o script de análise do ensaio de ilhas para processar todos os experimentos simultaneamente.
O script deve ser editado corretamente para que a análise seja bem-sucedida. Na linha 16 do script, insira o caminho para o diretório principal que contém os experimentos a serem analisados. Insira o caminho para a pasta onde os arquivos de saída da análise devem ser armazenados na linha 19.
Este último deve ser um local diferente do diretório que contém os dados de imagem a serem analisados. Agora, execute o script a partir da barra de ferramentas e prossiga com a análise dos resultados. O script Island Assay analysis exporta um gráfico de linhas para cada condição experimental.
O gráfico mostra a porcentagem de moscas mantidas na plataforma ao longo do tempo para cada replicata daquela condição. O gráfico de linhas exportado, resposta de fuga: todas as condições, resume a média e o erro padrão da média da resposta de fuga em voo para as primeiras 12 condições experimentais presentes na pasta principal. A área sob a curva para cada replicata experimental é calculada para determinar se as condições experimentais diferem significativamente entre si.
A área sob a curva e o valor mediano para cada condição experimental são exportados como um gráfico. Dependendo do número de condições presentes na pasta principal, o script realizará um teste T de Welch não pareado bicaudal para duas condições ou uma anova com duas correções principais para mais de duas condições. Todos os dados numéricos calculados pelo script Análise do ensaio de ilhas também são exportados e salvos como arquivos csv ou txt na pasta de saída de dados.
A ataxia-telangiectasia é uma desordem autossômica recessiva do movimento causada por mutações no gene ATM. A doença é caracterizada pelo início precoce de ataxia cerebelar. O efeito do silenciamento ubiquo do ortólogo de ATM em moscas foi examinado no ensaio de Ilha e comparado aos controles.
No geral, o silenciamento ubíquo do ortólogo de ATM em moscas, Tefu, reduziu significativamente o desempenho locomotor no Ensaio da Ilha em comparação com os controles de fundo genético. A análise manual dos dados gravados do Ensaio da Ilha forneceu o mesmo resultado da análise automatizada. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como realizar o Ensaio da Ilha, como executar a macro do Ensaio da Ilha em Drosophila e como operar o script de análise do Ensaio da Ilha.
Ao tentar executar este protocolo, é importante lembrar que a qualidade da segmentação de imagem está correlacionada com a qualidade dos vídeos. Quanto melhor o contraste, mais suave será a análise. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para que pesquisadores explorem a capacidade locomotora em Drosophila com alto rendimento.
Após utilizar este ensaio, outros ensaios, como aqueles que testam geotaxia negativa, podem ser utilizados para investigar mais a fundo defeitos locomotores.
Visão Geral
O Ensaio de Ilha é um método novo para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila melanogaster por meio de processamento automatizado de dados. Esta técnica permite triagem em alta produtividade para estudos genéticos e farmacológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Triagem Genética
Contexto
- O Ensaio da Ilha avalia o comportamento locomotor básico em moscas-das-frutas.
- Identifica reguladores-chave dos distúrbios do movimento.
- Este método auxilia triagens em larga escala de modelos de doenças.
- A análise automatizada de imagens aumenta a eficiência no processamento de dados.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio de alto rendimento para análise do comportamento locomotor.
- Facilitar a identificação de fatores genéticos que afetam o movimento.
- Testar agentes farmacológicos que possam corrigir defeitos locomotores.
Métodos Utilizados
- Preparação das condições experimentais com repetições biológicas.
- Montagem do equipamento de gravação com iluminação e câmera apropriadas.
- Captura e processamento automatizados de imagens utilizando software específico.
- Quantificação do comportamento das moscas com base em parâmetros definidos.
Resultados Principais
- Implementação bem-sucedida do ensaio de ilha para análise locomotora.
- Geração de dados quantificáveis para telas genéticas em larga escala.
- Identificação de candidatos potenciais a fármacos para distúrbios do movimento.
- Estabelecimento de uma metodologia reprodutível para estudos futuros.
Conclusões
- O ensaio de ilha fornece uma estrutura confiável para o estudo do comportamento locomotor.
- O processamento automatizado aumenta a eficiência da coleta de dados.
- Este método é adequado para triagens genéticas e farmacológicas de alto rendimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de ilha permite a quantificação automatizada e de alto rendimento do comportamento locomotor de Drosophila, abordando um gargalo crítico na validação de alvos de distúrbios do movimento. Ao converter a análise manual de vídeos em dados objetivos e reprodutíveis, ele viabiliza a triagem em larga escala de moduladores genéticos e farmacológicos da função locomotora. Isso posiciona o ensaio como uma ferramenta mecanisticamente informativa e economicamente eficiente para reduzir riscos em programas de descoberta em estágios iniciais na área de neurologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da resposta locomotora de fuga como indicador funcional dos efeitos da inativação gênica ou de tratamentos farmacológicos.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da medição automatizada e objetiva do comportamento de moscas em diferentes condições genéticas, reduzindo o viés do observador na triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Gera métricas de área sob a curva e resposta mediana de fuga que facilitam a análise comparativa e a priorização de alvos com fenótipos locomotores significativos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera dados padronizados e com resolução temporal do locomoção, permitindo avaliação confiável de compostos em telas em larga escala para identificação de modificadores de distúrbios do movimento.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade do ensaio por meio de pipelines automatizados de processamento de imagens (Fiji e R) que minimizam a variabilidade técnica entre réplicas e lotes experimentais.
- Escalabilidade: Compatível com fluxos de trabalho de alto rendimento devido à baixa custo da montagem (webcam, iluminação com LED) e compatibilidade com software de código aberto, possibilitando ampla adoção em laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta modelos genéticos de Drosophila (por exemplo, redução do ortólogo ATM) aos mecanismos de distúrbios do movimento humano por meio de fenótipos locomotores conservados.
- Redução de Riscos Mecanística: Fornece leituras comportamentais quantitativas que ajudam a distinguir déficits motores gerais de defeitos específicos de coordenação ou resistência, aumentando a confiança no alvo.
- Alinhamento Pré-clínico: Permite análises de resposta à dose e de curso temporal de agentes farmacológicos, possibilitando avaliação precoce da eficácia em sistemas relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de ilha insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores, oferecendo uma ponte de fenotipagem comportamental entre triagem genética e acompanhamento mecanicista em programas de neurologia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a validação de alvos ao associar perturbações genéticas (por exemplo, silenciamento de ATM) a déficits locomotores quantificáveis, permitindo a investigação de alvos orientada por hipóteses.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da quantificação automatizada da fuga de moscas na plataforma ao longo do tempo, gerando leituras fenotípicas dependentes de dose e tempo, adequadas para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análises: Exporta valores de área sob a curva e medianas com saídas estatísticas (teste t de Welch ou ANOVA), permitindo comparação entre condições e seleção de alvos positivos em campanhas de triagem.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à triagem fenotípica em modelos de doenças ao demonstrar defeitos locomotores conservados em modelos de Drosophila de ataxia humana, apoiando a continuidade mecanicista.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável e padronizada para avaliação locomotora que pode ser aplicada em múltiplos alvos, genótipos e triagens de compostos sem necessidade de revalidação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de uma quantificação objetiva e de alta resolução do comportamento.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio do processamento automatizado de dados, minimizando o esforço manual e a variabilidade entre usuários em telas de grande escala.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de avançar/interromper ao fornecer dados fenotípicos quantitativos precoces que reduzem o risco de falhas em estágios avançados do desenvolvimento de neuroterapêuticos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e compostos com base em dados estatisticamente robustos de resposta locomotora, melhorando a eficiência do capital em portfólios de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige familiaridade com o Fiji e R/RStudio para execução de macro e análise baseada em scripts, exigindo treinamento básico em bioinformática ou análise de imagens.
- Depende de condições de imagem consistentes (iluminação, contraste, estabilidade da plataforma) para garantir a segmentação precisa das moscas e quantificação confiável entre experimentos.
- Necessita de preparo padronizado das moscas (asas intactas, idade, sexo, densidade) para minimizar a variabilidade biológica e assegurar a reprodutibilidade do ensaio.
- Envolve etapas manuais de configuração (definição da região de interesse da plataforma, limite mínimo de tamanho da mosca) que devem ser rigorosamente aplicadas para manter a integridade dos dados entre lotes.
- Limita-se à análise de comportamento plano 2D; não captura voo vertical nem sequências motoras complexas, exigindo ensaios complementares para um perfil comportamental completo.
