Name: Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a realizar injeções subretinianas assistidas por tomografia de coerência óptica de alta resolução em camundongos. Este método minimamente invasivo permite monitoramento em tempo real da entrega de vetores e avaliação da vitalidade dos fotorreceptores para terapia gênica da retina.

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Este material é baseado em trabalho suportado, em parte, pelo departamento de assuntos de veteranos (VA), Veterans Health Administration, escritório de pesquisa e desenvolvimento (biomédica de laboratório de pesquisa e desenvolvimento) (VA mérito Grant 1I01BX000669). JMS é empregado, em parte, como pessoal médico-cientista, Oftalmologia, por VA porque; MCB é empregado, em parte, pela VA porque. O estudo foi realizado em e apoiado em parte, os veteranos administração Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Conteúdo não representam a opinião do departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Também apoiou, em grande parte, pelo NIH/NEI R01 conceder EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (centro de infraestrutura de visão de UB, PI: M abate, diretor - Biophotonics módulo: JMS), uma concessão irrestrita para a departamento de Oftalmologia/Universidade Búfalo de investigação para evitar cegueira (Nova Iorque, NY) e uma bolsa da Fundação Oishei (Buffalo, NY). Reconhecemos o dom da linha deP347S de hC1 transgénica RHOe o mouse do exon 1 RHO nocaute do Dr. Janis Lem (centro médico de Tufts Nova Inglaterra, Boston, MA) e o dom do modelo no estado heterozigoto transgene NHR-E sobre o rato exon 2 RHO nocaute segundo plano de DRS G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).

<ol><li>Regus-Leidig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+knockdown+of+Piccolino+disrupts+presynaptic+ribbon+morphology+in+mouse+photoreceptor+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses.</a> Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).</li>
<li>Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+gene+therapy+in+dominant+retinitis+pigmentosa+and+cone-rod+dystrophy+mouse+models+caused+by+GCAP1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations.</a> Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).</li>
<li>Seo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+gene+therapy+of+mice+with+Bardet-Beidl+Syndrome+Type-1%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).</li>
<li>Molday, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RD3+gene+delivery+restores+guanylate+cyclase+localization+and+rescues+photoreceptors+in+the+RD3+mouse+model+of+Leber+congenital+amaurosis+12%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12.</a> Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).</li>
<li>Pang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+in+mouse+models+of+recessive+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration.</a> Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21993172">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies.</a> Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).</li>
<li>Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+and+validated+injection+method+for+accessing+the+subretinal+space+via+a+transcleral+posterior+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach.</a> J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).</li>
<li>Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for ocular angiogenesis.</a> Clinical Science. 104, 561-575 (2003).</li>
<li>Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23489150">Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy.</a> Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).</li>
<li>Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+noninvasive+in+vivo.assessment+of+adeno-associated+virus-mediated+retinal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).</li>
<li>Ruggeri, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17389515">In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).</li>
<li>Berger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoS One. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+mouse+retinal+layers+using+automated+segmentation+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+images%5BTitle%5D)+AND+%22TVST%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images.</a> TVST. 4 (4), 9(2015).</li>
<li>Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+caspase-12+to+preserve+vision+in+mice+with+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).</li>
<li>Berger, A., al,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSOne%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).</li>
<li>Sarra, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042698901002309">Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus.</a> Vision Res. 42, 541-549 (2002).</li>
<li>Yan, Q. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).</li>
<li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).</li>
<li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+subretinal+injections+in+rodents+to+deliver+retinal+pigment+epithelium+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension.</a> J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).</li>
<li>Butler, M. C., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+real-time%2C+in+vivo+mouse+retinal+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+into+the+rat+retina+by+clinical+fluorescence+photography%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography.</a> Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).</li>
<li>Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thickness+measurement+obtained+with+spectral+domain+optical+coherence+tomography+assisted+optical+biopsy+accurately+correlates+with+ex+vivo+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology.</a> PLoS One. 9 (10), 111203(2014).</li>
<li>Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+carrying+the+dominant+rhodopsin+mutation+P347S%3A+evidence+for+defective+vectorial+transport+of+rhodopsin+to+the+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).</li>
<li>Brill, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2248236/">A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).</li>
<li>Olsson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+a+rhodopsin+mutation+%28Pro23His%29%3A+a+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Neuron. 9, 815-830 (1992).</li>
<li>Humphries, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+induced+in+mice+by+targeted+disruption+of+the+rhodopsin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene.</a> Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).</li>
<li>Hruby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13155497">Clinical examination of the vitreous body.</a> Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).</li>
<li>Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell-based+toxicity+screen+of+potentially+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).</li>
<li>Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injections+in+rodent+eyes%3A+effects+on+electrophysiology+and+histology+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina.</a> Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).</li>
<li>Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+brief%3A+subretinal+injection+and+electroporation+into+adult+mouse+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes.</a> Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).</li>
<li>Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottlenecks+in+development+of+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Vision Res. 48, 453-469 (2008).</li>
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Relações comerciais: MCB: nenhum; JMS: nenhum. A imagem do sistema (RIS)23 utilizado neste estudo da retina é um dispositivo inovador de uso substancial a qualquer grupo buscando a realização de estudos de entrega de terapia de gene em ratos, roedores ou pequenos animais. Embora os autores não tenham nenhum conflito para declarar com relação a este dispositivo, neste momento, da Universidade de Buffalo - SUNY e a administração de veteranos têm direitos de propriedade intelectual e pode tentar comercializar este instrumento no futuro.

HR-SD-OCT fornece um método simples para a caracterização de potenciais modelos animais de doença humana para determinar sua utilidade na terapêutica potencial de teste. A capacidade de rapidamente e confiantemente caracterizam um potencial modelo animal de doença humana é fundamental para o processo de descoberta de drogas terapêuticas (por exemplo, terapia de substituição genética, terapia de gene "knockdown" ribozima ou shRNA, terapia genética combinada). HR-SD-OCT fornece um método simples, rápido e não-inva...

Os investigadores estão a desenvolver terapias do gene para uma variedade de doenças degenerativas da retina e da retina com esperanças de traduzir novas terapêuticas em tratamentos para doenças humanas1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no domínio do tempo ou a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) tem sido usada para investigar os aspectos da degeneração da retina exterior em modelos do rato específico de doença12,13,14 . HR-SD-OCT não, no entanto, foi extensivamente usado no contexto da otimização de avaliação dos modelos de rato para determinar a taxa e a uniformidade espacial da degeneração da retina, ou no contexto da avaliação pré-clínica do gene com base terapêutica, por exemplo, a Avalie a extensão espacial do vetor entrega8,15,16, toxicidade ou resgate. Uma vez que um modelo do rato é caracterizado inteiramente, os dados de HR-SD-OCT podem servir como um recurso informativo e confiável para medir o impacto da terapêutica de exercer o resgate ou toxicidade em modelos do rato de degeneração da retina17. Muitos grupos estão usando injeção subretinal como um método de entrega de vetor devido a sua eficiência no transducing fotorreceptores e células do epitélio (RPE) pigmento da retina. No entanto, esta continua a ser um método difícil de dominar, dado que normalmente é feito por cirurgia mão livre da superfície da córnea e muitas vezes é repleta de catarata, sangramento e não intencionais destacamentos retinal ocorrem simplesmente por manipulação de posterior vítreo. Muitos grupos ainda tentam injeções subretinal cegamente e entregam o vírus usando injeções manuais com diâmetro relativamente grande aço inoxidável agulhas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alguns usos óptico tomografia de coerência (OCT) para confirmar a entrega adequada de vetor para a retina8,17, de imagem 20 , 22. algumas melhorias no método recentemente têm sido descritas usando agulhas de microescala, impulsionadas por um micromanipulador22.
Apresentamos uma abordagem integrada que auxilia no posicionamento da agulha, e as injeções são facilitadas por um oftalmoscópio estéreo dirigido personalizado projetado no laboratório especificamente para visualização dentro do olho pequeno do rato17, 23. o uso de vidro puxado micro agulhas em conjunto com o micromanipulador estereotáxica fornecem melhor controle de colocação da agulha com nenhum corte cirúrgico para baixo necessária (ou seja, através da conjuntiva e do tecido conjuntivo) antes de injeção. O uso da pressão regulada injector micro ajuda entregar volumes de injeção consistente, e a injeção pode ser feita com muito maior estabilidade, precisão e muito mais lenta do que injeções manuais realizadas por uma seringa à mão, diminuindo assim o ocorrência de injeção de bolha no olho. A agulha menor ajuda a evitar vazamentos após a retirada da agulha, porque o caminho é auto-selante. Para avaliar a extensão da injeção/entrega, muitos grupos de investigação dependem de encontrar e avaliar a extensão de areal da expressão de proteínas (EGFP) fluorescência verde reforçada na retina (construção de expressão entregada pelo vetor) na extremidade experimental ponto (eutanásia) para confirmar o sucesso injeções11,19,20,24. Esta abordagem (não utilizando OCT) para verificar o sucesso cirúrgico desperdiça uma quantidade enorme de recursos em tempo de procedimento cirúrgico e animais, uma vez que todos os animais com falhas cirúrgicas (desconhecidos) precisam ser mantida, seguido com medidas repetitivas até colheita de eutanásia e olho (quando EGFP é medido). Confirmação do local da injeção na retina pode ser melhorada usando HR-SD-OCT para demonstrar que a injeção está localizada entre as camadas corretas da retina (ou seja, o espaço subretinal). HR-SD-OCT também pode ser usado para delinear imediatamente tentativas (falhas cirúrgicas) para identificar as variáveis relevantes em tempo real cirúrgico para aperfeiçoar a abordagem. Nós achamos que HR-SD-OCT fornece inúmeras vantagens no gene pré-clínicos estudos de terapia, permitindo rápida avaliação quantitativa da degeneração da retina exterior, permitindo a identificação/abate de animais de estudo que não cumpram critérios experimentais ( por exemplo, injeção subretinal incorreta) e para direcionar o follow-up de imagem para a região do olho, onde o vetor foi entregue (onde é mais provável efeito pré-clínicos), bem como controlar as regiões onde o vetor não foi entregue. Desde o seu desenvolvimento, o uso de SD-out tem continuado a ser aceito e utilizado pelos pesquisadores de Oftalmologia e agora é considerada o padrão de imagem da retina em estudos científicos da retina no rato ou roedor modelos13,25. HR-SD-OCT e seus recursos de software foram utilizados em maneiras originais de integrada para promover o objetivo da terapia bem sucedida gene quantitativa em modelos do rato em cada etapa do processo, incluindo a seleção de modelo animal, caracterização de degeneração no escolhido modelos de doença, entrega terapêutica, mapeamento de vetor entrega e avaliação de toxicidade/eficácia. O uso de HR SD-out permite a descoberta de medicamentos mais eficiente em todos os níveis do processo. Aqui descrevemos essas abordagens que são usadas em nosso programa de descoberta de drogas de RNA.

<table><tbody><tr><td>C57BL6 (J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>N129R-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2HRho 1T/1T</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Envisu R-2200 Instrumento de Tomografia de Coerência Ocular (OCT)</td><td>Bioptigen</td><td>90-R2200-U1-120.&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Imagem de Retina (RIS)</td> <td>Microscópio interno</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Extrator de micropipeta flamejante/marrom</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>p-97</td><td></td></tr><tr><td>MMN-33 micro manipulador&nbsp;</td><td>Narishige USA</td><td>MMN-33</td><td></td></tr><tr><td>PLI-100&nbsp; micro injetor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1736</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Micropipeta (Rotativo)</td> <td>Interno</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Armazenamento Receptáculo</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubos capilares de vidro borossilicato 1,5-1,8 X 100mm,&nbsp;</td><td>Aparelho Harvard</td><td>30-0053</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Terc-amílico</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>240486-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução Oftálmica de Sulfato de Atropina, USP 1%</td> <td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-215-05</td><td></td></tr><tr><td>Goniovisc</td><td>BioVision Limited</td><td>NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>Solução Oftálmica de Cloridrato de Ciclopentolato, USP&nbsp; 2%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-097-10</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de sulfato de gentamicina USP, 0,1%</td> <td>Perigo</td><td>NDC 45802-046-35</td><td></td></tr><tr><td>Systane Ultra</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>9006619-1013</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de tetracaína</td><td>Bausch and Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>Solução oftálmica, USP 0,5%</td> <td>Bausch e Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Preparações de vírus</td><td>ViGene / UNC</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Nanobastões de ouro</td><td>NANOPARTz</td><td>D12M-850-1.75</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de fluoresceína AK-FLUOR 25%</td> <td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-250-20</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Milton</td><td>18-825</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas 30 gauge</td><td>Beckton Dickenson&nbsp; &nbsp;</td><td>W11604</td><td></td></tr><tr><td>Seringas</td><td>Beckton Dickenson&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Pacote de software Bioptigen</td> Solução oftálmica de cloridrato de proparacaína <td>Bioptigen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>, USP 0,5%</td> <td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-263-12</td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfurador de orelha</td><td>Nat' l band</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CL 100 Fonte de luz</td><td>Welch Allyn</td><td>CL100</td><td></td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td>Jackson Welding Supply</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria aquecido</td><td>Neslab</td><td>RTE-140</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>In House</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Tapete de aquecimento</td><td>Cincinnatti Sub Zero</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para mouse de argila</td><td>Plast.i.clay American Art Clay Co.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>MedLine&nbsp;</td><td>NDC53329-938-06</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de Ponta de Algodão</td><td>American Health Service</td><td>Ctag</td><td></td></tr><tr><td>EtOH 70%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Luvas Nitrilo</td><td>VWR</td><td>89038-272</td><td></td></tr><tr><td>Diagnosys ERG Color Dome instrumento</td><td>Diagnosys Inc.</td><td>D125</td><td></td></tr><tr><td>Lentes</td><td>de</td> contato <td>Internamente N/A</td><td></td></tr><tr><td>Diagnosys Software Diagnosys</td><td>Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.1 software</td><td>OriginLab Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Eléctrodos de referência</td><td>Electrodo de</td><td>rosca F Ocuscience (DTL) 24"</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografia de coerência óptica mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT é utilizado para monitorar a progressão da degeneração fotorreceptoras em modelos do rato ao vivo, avaliar a entrega de agentes terapêuticos para o espaço subretinal e para avaliar a toxicidade e eficácia na vivo. HR-SD-OCT usa perto de luz infravermelha (800-880 nm) e tem ótica especificamente projetada para a única ótica do olho do rato com resolução axial mícron-sub-2. Modelos de rato transgénico da degeneração retiniana externa (fotorreceptor) e controles foram fotografados para avaliar a progressão da doença. Microagulhas puxado de vidro foram usadas para entregar sub retiniana injeções de vírus adeno-associado (AAV) ou nanopartículas (NP) através de uma abordagem trans-escleral e trans-coroide. Cuidado de posicionamento da agulha no espaço subretinal foi necessário antes uma injeção de pressão calibrado, que proporciona o fluido para o espaço da retina sub. Tempo real de cirurgia subretinal realizou-se na nossa imagem sistema (RIS) da retina. HR-SD-OCT demonstrou progressiva degeneração retinal uniforme devido a expressão de uma tóxica mutante humana mutante rodopsina (P347S) transgene (RHOP347S) em ratos. HR-SD-OCT permite a quantificação rigorosa de todas as camadas da retina. Medidas de comprimento (OSL) espessura e fotorreceptoras do segmento externo camada nuclear externa (ONL) correlacionam-se com vitalidade fotoreceptor, degeneração ou resgate. O sistema de entrega RIS permite a visualização em tempo real de injeções subretinal em neonatal (~ P10-14) ou ratos adultos e HR-SD-OCT imediatamente determina o sucesso de entrega e mapeia a extensão de areal. HR-SD-OCT é uma ferramenta poderosa que pode avaliar o sucesso da cirurgia subretinal em camundongos, além da vitalidade dos FOTORRECEPTORES em vivode medição. HR-SD-OCT também pode ser usado para identificar o uniformes coortes animais para avaliar o grau de degeneração da retina, toxicidade e resgate terapêutico em estudos de pesquisa de terapia de gene pré-clínicos.

Avaliar a presença, a taxa e a uniformidade da degeneração da retina exterior do modelo Medições de Oni foram gravadas desde o OPL para o ELM, definindo os limites da Oni usando a ferramenta paquímetro fornecida no software do instrumento. O objetivo era mapear a progressão da degeneração da retina exterior em um modelo do rato de adRP parcialmente humanizado. Imagens comparáveis de um rato C57BL/6(J) de controle e um mWT hC1/hC1 / / / modelo de mouse mWT, expressando ...

Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

O objetivo geral deste procedimento de injeção subretinal é entregar um vetor para a retina de forma minimamente invasiva e reprodutível que seja observável em tempo real. Olá, este método pode ser usado para responder a perguntas-chave em pesquisas de terapia genética sobre eficácia de parto vetorial e toxicidade de agentes terapêuticos. Algumas vantagens desta técnica incluem danos mínimos à retina e outras estruturas oculares, mapeamento preciso do local de injeção e rigorosas medições quantitativas in vivo que permitem inferência estatística sólida.Para injeção transgênica intraocular, primeiro coloque um rato anestesiado no estágio de visualização de um microscópio do sistema de imagem da retina e coloque as pontas de uma íris estéril e cega fórceps nas posições sete e dez horas da pálpebra enquanto empurra as fórceps abertas e para baixo para induzir suavemente proptose. Use os fórceps para persuadir as pálpebras sob o globo ocular e direcione a ponta da agulha para cerca de um a 1,5 milímetros abaixo da borda do limbus córnea. Em seguida, aplique uma gota de solução pbs estéril no olho e cubra o olho com um deslizamento de tampa estéril.Conduza cuidadosamente a agulha no olh

ultrahigh-resolution-mouse-optical-coherence-tomography-to-aid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra uma técnica de imagem in vivo para detectar e quantificar a inflamação ocular em um modelo de camundongo com uveíte pós-infecciosa. A técnica, conhecida como tomografia de coerência óptica (OCT), gera imagens transversais de alta resolução do olho para avaliar a progressão da doença.

Tomografia de coerência óptica para avaliação de uveíte em modelo de camundongo

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55865/ coerência-óptica-tomografia-imagem-de-camundongo-células-ganglionares-de-retina-em-vivo'&gt;Jagodzinska, J., et. al., Tomografia de Coerência Óptica: Imagem de células ganglionares da retina de camundongos In Vivo. J. Vis. exp. (2017)  Neste vídeo, demonstramos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para obter imagens das camadas da retina e avaliar as mudanças estruturais em um modelo...

Imagem in vivo da retina de camundongo usando tomografia de coerência óptica

A injeção sub-retiniana é uma técnica cirúrgica para entrega gênica eficaz ao epitélio pigmentar da retina no olho do camundongo.  Aqui descrevemos um método fácil e replicável para injeção sub-retiniana de vetores virais no epitélio pigmentar da retina em camundongos experimentais.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

Este manuscrito descreve um protocolo para a imagem no vivo da retina do rato com a tomografia de coerência óptica de domínio espectral de alta resolução (SD-OCT). Centra-se em células ganglionares da retina (RGC) na região de peripapillary, com vários digitalização e quantificar as abordagens descritas.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Este protocolo descreve técnicas como de alta resolução de imagem como tomografia de coerência óptica de domínio espectral e digitalização laser Oftalmoscopia pode ser utilizado em pequenos roedores, usando um sistema de plataforma de imagem oftálmica, para obter informações sobre espessura da retina e microglial celular distribuição, respectivamente.

Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Um protocolo detalhado para a avaliação de leituras visuais e estruturais em roedores por coerência óptica tomografia computadorizada e optocinético resposta é apresentado. Os resultados fornecem informações valiosas para investigação oftalmológica, bem como neurológica.

Usando a tomografia de coerência óptica e resposta Optokinetic como estrutural e funcional sistema Visual leituras em camundongos e ratos

Aqui, descrevemos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.

Avaliações estruturais in vivo de doenças oculares em modelos de roedores utilizando tomografia de coerência óptica

Aqui, descrevemos uma técnica de imagem in vivo usando tomografia de coerência óptica para facilitar o diagnóstico e a medição quantitativa da retinopatia em camundongos.

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

O presente protocolo descreve os passos para o alinhamento in vivo de imagens de fibrografia por tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongos com o objetivo de verificar a morfologia do feixe axonal de células ganglionares da retina observada nas imagens in vivo.

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

As injeções sub-retinianas são uma técnica indispensável para o desenvolvimento pré-clínico de terapêuticas para doenças fotorreceptoras e EPR. Descrevemos uma técnica de injeção sub-retiniana transescleral otimizada em camundongos que melhora as taxas de sucesso intraoperatório e minimiza os danos à retina.

Técnica de injeção sub-retiniana transescleral minimamente invasiva otimizada em camundongo

Aprenda a realizar injeções subretinianas assistidas por tomografia de coerência óptica de alta resolução em camundongos. Este método minimamente invasivo permite monitoramento em tempo real da entrega de vetores e avaliação da vitalidade dos fotorreceptores para terapia gênica da retina.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina (Vídeo) | JoVE Journal

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

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