Estudos do Vírus Influenza A em um Modelo de Infecção de Camundongos

O objetivo geral deste procedimento experimental é avaliar a patogênese, as respostas humorais e a eficácia da proteção induzida por vírus do tipo selvagem Influenza A ou vacinas contra Influenza usando um modelo de infecção em camundongos. Este método pode ajudar a responder às perguntas sobre a biologia dos vírus Influenza A, como patogênese viral, respostas imunológicas e eficácia das vacinas contra Influenza, bem como antivírus. A principal vantagem desta técnica é que o camundongo possui um sistema imunológico semelhante ao dos humanos e estão disponíveis várias cepas que podem ser exploradas para avaliar a base genética das infecções pelo vírus Influenza A.

Pois este método pode fornecer informações sobre a eficácia de novas vacinas contra a gripe, pode ser aplicado também a sistemas mais antigos, como a avaliação de possíveis tratamentos antivirais, incluindo o tratamento de anticorpos ou medicamentos. Depois de criar e marcar camundongos C57B6 de seis a oito semanas de idade em condições livres de patógenos e preparar diluições do vírus Influenza A ou IAV em condições assépticas. Use uma balança para pesar os ratos e registrar o peso.

Depois que um camundongo for anestesiado e a profundidade da anestesia for verificada de acordo com o protocolo de texto, coloque-o em decúbito dorsal. Insira uma ponta de pipeta contendo 30 microlitros do inóculo do vírus na narina e lentamente, mas constantemente, ejete a solução. Para avaliar a morbidade e mortalidade, infecte três a quatro grupos de camundongos fêmeas com 10 cochilos cheios de PR8 tipo selvagem, conforme descrito no protocolo de texto.

Monitore e pese os camundongos nos próximos 14 dias, aproximadamente ao mesmo tempo, para minimizar as variações de peso devido à ingestão de alimentos. Após a eutanásia dos animais que sobreviveram à infecção viral e cálculo da dose letal viral de 50% do camundongo ou MLD50 de acordo com o protocolo de texto. Infectar camundongos fêmeas de seis a oito semanas de idade com doses virais de 10 a 10 até a quarta unidade formadora fluorescente ou FFU do tipo selvagem PR8.

Nos dias dois e quatro, coletar os pulmões e a mucosa nasal do camundongo para avaliação. Depois de sacrificar os animais, coloque-o em decúbito dorsal e use etanol a 70% para desinfetar o pelo do tórax. Use uma tesoura para cortar a pele da base do abdômen até o esterno.

Em seguida, com uma tesoura, faça cortes de um centímetro da base da incisão até as partes laterais do mouse. Remova a pele de toda a parte superior do camundongo até a base do abdômen, onde foi feita a primeira incisão. Em seguida, use a tesoura para cortar a cabeça e coloque-a em uma placa de Petri estéril seca.

Use uma tesoura para cortar as junções entre a maxila e a mandíbula e descarte a mandíbula. Em seguida, com a tesoura, faça dois cortes nas extremidades dos arcos zigomáticos e remova-os. Use uma pinça de dissecação para remover os olhos.

Em seguida, com a pinça de dissecção, segure o crânio e use um bisturi para cortar o crânio ao longo da sutura sagital. Levante as duas metades do crânio com o cérebro para ver a mucosa nasal. Usando o bisturi, corte a parte do crânio com o cérebro e descarte-a.

Coloque o restante do crânio com a mucosa nasal em um tubo estéril. Armazene o tubo no gelo se as amostras forem processadas no mesmo dia ou congele rapidamente no gelo seco se as amostras forem processadas posteriormente. Para evitar a contaminação das amostras, use desinfetante de dióxido de cloro, para limpar e desinfetar as ferramentas de dissecação entre cada tecido recuperado e entre cada dissecação animal.

Em seguida, para coletar os pulmões, coloque o animal em decúbito dorsal e use uma tesoura para cortar a plura. Começando na base da caixa torácica, use uma tesoura para cortar as costelas um centímetro em ambos os lados do esterno até a parte superior das costelas. Faça uma seção transversal com a tesoura entre as duas incisões na parte superior da caixa torácica e remova o local do peito.

Segure os pulmões com a pinça, faça um corte no final da traqueia logo antes dos pulmões e coloque os pulmões em um tubo estéril. Coloque os pulmões ou a mucosa nasal em um homogeneizador estéril e adicione um mililitro de meio de infecção pelo frio. Homogeneizar a amostra movendo o pilão para cima e para baixo durante cerca de um minuto à temperatura ambiente até que os pulmões estejam completamente dissolvidos.

Colocar a amostra homogeneizada num tubo estéril. Centrifugar as amostras a 300 x G durante cinco a 10 minutos à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante num novo tubo estéril e rejeitar o pellet.

Armazenar o sobrenadante a quatro graus Celsius se a titulação viral for realizada no mesmo dia. No dia anterior à titulação, semear placas de 96 poços com células epiteliais MDCK em meio de cultura de tecidos para que atinjam aproximadamente 80 a 90% de confluência. Incube as células em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite.

Para preparar de uma a 10 diluições das amostras homogeneizadas de pulmão ou mucosa nasal, adicione 90 microlitros de meio de infecção a cada um dos poços de uma placa de 96 poços. Adicionar 10 microlitros do sobrenadante de uma das amostras homogeneizadas aos poços A1, A2 e A3, para avaliar o título viral de cada amostra e triplicar. Em seguida, adicionar 10 microlitros de outro sobrenadante das amostras homogeneizadas aos poços, A4, A5 e A6. Depois de adicionar o sobrenadante de amostra à linha A, use uma pipeta multicanal para misturar pipetando para cima e para baixo.

Transfira 10 microlitros da linha A para a linha B e misture bem. Troque as pontas entre as diluições e repita a transferência da linha B para a linha C e continue de maneira semelhante até chegar à última linha, H. Usando um adaptador multicanal aspirador a vácuo, remova o meio de cultura de tecidos das células MDCK nas placas de 96 poços e use 100 microlitros por poço de 1x PBS para lavar as células duas vezes. Começando com as diluições mais altas e passando para as diluições mais baixas, transfira 50 microlitros por poço do sobrenadante diluído em série das amostras homogeneizadas para a placa de 96 poços de células MDCK, transferindo as diluições mais altas da linha H para a linha A de células.

Coloque a placa de 96 poços em uma plataforma de balanço por uma hora em temperatura ambiente para permitir a absorção viral. Em seguida, usando um adaptador multicanal aspirador a vácuo, remova o inóculo e adicione 100 microlitros por poço de meio pós-infecção. Incube as células infectadas por oito horas em uma incubadora de 33 graus Celsius ou 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Prossiga para a fixação, coloração, imagem e cálculo do título viral conforme descrito no protocolo de texto. Neste experimento, os camundongos foram infectados com diferentes doses de PR8 tipo selvagem. O peso corporal e a sobrevivência de cinco camundongos por grupo foram medidos até 14 dias após a infecção.

Os camundongos imunizados com FFU mais alto do tipo selvagem PR8, perderam peso de forma mais rápida e severa e todos morreram como resultado. O MLD50 do tipo selvagem PR8 neste experimento, calculado com o método de junco e muench, foi de 1,5 x 10 para a segunda FFU. Para analisar as respostas humorais induzidas contra a infecção IV, 14 dias após a imunização, os camundongos foram sangrados para analisar a presença de anticorpos contra proteínas virais totais e a presença de anticorpos neutralizantes direcionados à proteína HA viral, usando uma inibição de hemoaglutinação ou HAI e um ensaio de microneutralização viral ou VN.

Como visto aqui, os resultados do ensaio indicam que os soros de camundongos imunizados com uma dose mais alta de vírus Influenza vivo atenuado PR8 ou LAIV tiveram títulos de anticorpos mais altos contra proteínas PR8 totais do que os soros de camundongos imunizados com uma dose mais baixa. Usando os ensaios HAI e VN, os soros de camundongos com a maior quantidade de PR8 LAIV tiveram um título mais alto de anticorpos neutralizantes, enquanto o soro de um camundongo imunizado com a dose mais baixa teve o menor título de anticorpos neutralizantes contra PR8. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar camundongos com vírus Influenza A, como avaliar por sua patogênese, respostas humorais e imunes e bio-replicação no trato respiratório superior e inferior.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do vírus Influenza A explorarem a patogenicidade, imunogenicidade e eficácia de proteção de vacinas vivas de anticorpos, usando um modelo de infecção em camundongos.