Name: Indução e diagnóstico de tumores em Drosophila Epitelio do disco imaginal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a induzir tumores em discos imaginais de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e classificar os estágios de desenvolvimento tumoral. Este método oferece uma abordagem genética simples para modelagem do câncer.

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Agradecemos a J. Vaughen pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e The Takeda Science Foundation Research Grant to YT

1. Fly Crosses e Clone Induction <ol><li> Remova todas as moscas no frasco 12 h antes de coletar moscas virgens. </li><li> Anestesiar as moscas dentro do recipiente através da injecção de gás de CO2 e voa lugar numa almofada de mosca de CO 2. </li><li> Transfira 10 - 20 fêmeas virgens e 10 machos da almofada de mosca CO 2 para um frasco fresco e incubar durante 1 dia a 25 ° C. </li><li> Transfira essas moscas para um frasco fresco e incube durante 12 h a 25 ° C. NOTA: Descarte o primeiro frasco para injectáveis, pois as fêmeas virgens não colocam ovos suficientes no primeiro dia. </li><li> Para as linhas Enhancer-GAL4, remova as moscas adultas e incuba o frasco para injectáveis ​​a 25 ° C até a dissecção. </li><li> Para indução de clones de mosaico por flip-out-GAL4, remova as moscas adultas e incuba o frasco para 2-4 dias a 25 ° C. O tempo de incubação antes do choque térmico depende do propósito experimental. Um choque térmico 2 dias após a deposição de ovos (AED) gera clones de mosaico em um segundo imaturoInstado imaginal epitélio. Um choque térmico após 3 ou 4 dias AED gera clones de mosaico em epitélio imaginal diferenciado de início a médio e terceiro instar. NOTA: É importante examinar o efeito do tempo de choque térmico alterado em fenótipos tumorigênicos. </li><li> Para a indução de clones de mosaico por flip-out-GAL4, choque calor o frasco por imersão em um banho de água a 37 ° C durante 10 a 45 minutos seguido de incubação durante 2 a 3 dias a 25 ° C. NOTA: A informação do tempo de choque térmico, tempo e tempo de incubação em cada experiência é mostrada nas legendas da figura. </li></ol> 2. Dissecção de Larvas <ol><li> Colecione larvas errantes do terceiro estádio com uma vara de madeira ou fórceps sem corte, goteje-os por marcadores fluorescentes apropriados ( por exemplo , EGFP) sob um microscópio estereoscópico de fluorescência e coloque-os em uma placa de dissecação com PBS (solução salina tamponada com fosfato). </li><li> Lave as larvas em PBS por pipetagem com pipetas de transferência de plástico de 2 mL. </li><li>Aperte o centro da larva com uma pinça e rasgue o corpo pela metade com a outra pinça. </li><li> Aperte o gancho da boca da metade anterior com uma pinça e empurre a boca em direção ao corpo com as outras fórceps para virar o corpo para dentro. </li><li> Remova materiais desnecessários, como glândulas salivares ou corpos gordurosos com fórceps. </li></ol> 3. Fixação e coloração de anticorpos <ol><li> Transfira a metade anterior dissecada do corpo larval (incluindo os discos de asa imaginal) para um tubo de plástico de 1,5 mL e conserte em 1 mL de Solução Fix (4% de Formaldeído em PBS) durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com rotação suave. CUIDADO: O formaldeído é tóxico e possui potencial carcinogênico. Use luvas de proteção e roupas para evitar contato com a pele. NOTA: Nesta parte, todas as etapas ocorrem em um nutator à temperatura ambiente no escuro, salvo indicação em contrário. </li><li> Remova a solução Fix e descarte. Lave os tecidos com 1 mL de PBT (0,3% de TritEm X-100 em PBS) três vezes por 15 min cada. </li><li> Remova o PBT e adicione 1 mL de PBTG (0,2% de albumina de soro bovino e 5% de soro de cabra normal em PBT) para bloquear e introduzir 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova o PBTG e adicione a solução primária de anticorpos adequadamente diluída com PBTG (ver Tabela de Materiais ) e nocaute durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova a solução primária de anticorpos e lave os tecidos com 1 mL de PBT três vezes por 15 minutos cada. </li><li> Remova PBT e adicione solução de anticorpo secundário adequadamente diluída com PBTG (1: 400). Nutate durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova a solução secundária de anticorpos e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada. </li><li> Para manchar a F-actina, remova PBT e adicione a solução de Phalloidin adequadamente diluída em PBS (1:40). Em seguida, mata por 20 min. Remova a solução de Faloidina e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada. </li><li> Para contra-endurecer DNA nuclear, remova PBT e adicione solução DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole) (0,5 μg / mL de DAPI em PBS). Em seguida, entenda 10 min. CUIDADO: DAPI possui potencial carcinogênico. Use luvas de proteção e roupas para evitar contato com a pele. </li><li> Remova a solução DAPI e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada. </li><li> Lavar uma vez em 1 mL de PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remova PBS e adicione 500 μL de 100% de glicerol como meio de pré-montagem. </li></ol> 4. Montagem em lâminas de microscópio <ol><li> Coloque os tecidos coloridos em um slide de microscópio usando uma pipeta de transferência de plástico de 2 mL. </li><li> Transfira os tecidos para gotas de meio de montagem em outro slide de microscópio com fórceps. </li><li> Mantenha o fim do tecido dissecado com uma pinça e retire os discos antenais do cérebro e do olho com as outras fórceps. NOTA: Mantenha os cérebros dissecados para colocá-los perto dos discos imaginários da asa. Os cérebros atuam como uma plataforma que impede o lamínula de esmagar os discos imaginais da asa. </li><li> Para isolar os discos imaginais da asa, mantenha pressionada a extremidade do tecido dissecado com uma pinça e raspe suavemente a parede do corpo e rasgue os discos com as outras fórceps. NOTA: Se é difícil encontrar discos imaginais da asa, descasque a traquea do lado posterior ao anterior. Os discos imaginários da asa mantêm a traquéia. </li><li> Cubra suavemente os discos imaginais com uma lamínula e selar com esmalte de unhas; Armazenar a 4 ° C. </li></ol> 5. Microscopia confocal <ol><li> Para adquirir imagens confocais usando um microscópio confocal, configure os parâmetros de aquisição de imagem, incluindo a amplitude de onda de emissão, a intensidade do laser, o ganho, o deslocamento, a velocidade de digitalização e o tamanho da imagem 24 . NOTA: Para obter um procedimento detalhado de configurações de aquisição de imagem, consulte o manual de instruções fornecido por cada fabricante de microscópio. </li><li> Para capturar um único coSeções nfocais de um disco imaginal inteiro da asa, use uma lente objetiva 20X. </li><li> Adquira imagens tridimensionais por varredura de pilha z em tamanho de passo de 0,5 - 1,0 μm usando lentes 40X ou 60X. NOTA: Para analisar fenótipos celulares em alta resolução, o tamanho da imagem deve ser maior do que 512 x 512 pixels. </li></ol> 6. Análise de imagens usando ImageJ <ol><li> Use Fiji, um software ImageJ de código aberto focado na análise de imagens biológicas (https://fiji.sc/) 25 , para adquirir e analisar imagens confocadas de pilhas z. </li><li> Para adquirir seções verticais, abra as imagens da pilha z no ImageJ e selecione o item de menu &quot;Imagem / Pilhas / Reslice&quot;. NOTA: Ou o eixo XZ ou o eixo YZ podem ser selecionados no menu Reslice. A seção vertical pode ser obtida também em uma direção arbitrária, desenhando uma linha reta ou retângulo na imagem da pilha z. </li></ol> 7. Diagnóstico de fenótipos neoplásicos <ol><li> Abra a verticalSeções (eixo XZ ou YZ) obtidas a partir de um conjunto de imagens de pilhas z e analisam fenótipos morfológicos e coloração de anticorpos. </li><li> Para o diagnóstico de fenótipos tumorais, concentre-se principalmente nos seguintes três pontos: (1) se uma massa celular, incluindo clones knockdown, se desvia da camada epitelial principal, (2) se a localização subcelular de proteínas juncionais é alterada nesta massa celular , E (3) se o diâmetro desta massa celular for maior do que 4 células. </li><li> Categorize os fenótipos tumorais de acordo com o fluxograma descrito na Figura 1 . </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O sistema GAL4-UAS é uma das ferramentas genéticas mais poderosas para a expressão de genes direcionados em Drosophila 26 e facilita grandemente a indução e análise de células tumorais in vivo 4 . Este sistema permite a geração de clones que suportam os genes supressores de tumores ou a superexpressão de oncogenes no tecido epitelial de tipo selvagem, uma situação altamente semelhante aos estágios iniciais do câncer humano onde as células pro-tumorais tra...

Os tecidos epiteliais são sistemas altamente organizados que possuem a habilidade homeostática notável para manter sua organização através do desenvolvimento e do turnover celular. Este robusto sistema de auto-organização, no entanto, é progressivamente interrompido durante o desenvolvimento do tumor. No início do desenvolvimento do tumor, as células mutantes individuais decorrentes da ativação do oncogene ou da inativação do gene supressor de tumor emergem dentro de uma camada epitelial. Quando esta &quot;célula pro-tumoral&quot; transformada evade um ambiente supressivo, interrompe a organização epitelial e começa a proliferação descontrolada, a tumorigênese ocorre 1 . Durante as últimas décadas, os avanços tecnológicos notáveis ​​em genética e biologia molecular fizeram progressos notáveis ​​na pesquisa do câncer. Em particular, estudos recentes utilizando ferramentas de análise de mosaico genetico em Drosophila melanogaster , como o recombinante mitótico recombinante FLP-FRT (flipase recombinase / flippase recombinase)Os sistemas 2 e flip-out-GAL4-UAS (seqüência de ativação upstream) 3 contribuíram grandemente para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos na formação e metástase dos tumores 4 , 5 , 6 . Estudos de um grupo de genes de supressores de tumores Drosophila conservados, larvas gigantes letais ( lgl ), discos grandes ( dlg ) e rabiscos ( scrib ), evidenciaram a relação crítica entre perda de organização epitelial e desenvolvimento tumoral, pois esses genes desempenham papéis fundamentais Na regulação da polaridade das células basais apical e da proliferação celular nos tecidos epiteliais 7 . Enquanto os discos imaginários de Drosophila são normalmente epitélios monocamadas, mutações homozigóticas em qualquer um desses três genes fazem com que as células perdam estrutura e polaridade, não conseguem diferenciarRentiate, overproliferate e, finalmente, formam massas amorfas multicamadas que se fundem com tecidos adjacentes 7 . Da mesma forma, a interrupção desses genes em mamíferos está envolvida no desenvolvimento de tumores malignos 8 , 9 . Os fenótipos neoplásicos exibidos pelos tecidos mutantes levaram à classificação desses três genes como genes supressores tumorais neoplásicos (nTSGs) 7 , 8 preservados. No entanto, quando as células mutantes nTSG homozigóticas são geradas esporadicamente no desenvolvimento de discos imaginais de tipo selvagem usando a recombinação mitótica mediada por FLP-FRT, as células mutantes são eliminadas do tecido através da apoptose dependente da quinase N-terminal N-terminal (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusão 15 </suP&gt; , 16 , ou engulfment e fagocitose por vizinhos 17 . Neste epitelio de mosaico genetico, a apoptose é principalmente detectada em células mutantes nTSG localizadas no limite do clone, sugerindo que as células normais adjacentes desencadeiam a apoptose de células mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Estudos recentes em células de mamíferos confirmaram que esta eliminação dependente da competição celular das células pro-tumorais é um mecanismo de autodefesa epitelial conservado evolutivamente contra o câncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Um estudo recente em discos imagólicos de Drosophila , no entanto, mostrou que os clones de nTSG-knockdown em mosaico induzem tumores neoplásicos em especificaçõesRegiões ic de discos ideais de asa 16 . A formação inicial do tumor sempre foi encontrada na região periférica da &quot;dobradiça&quot; e nunca observada na região central da &quot;bolsa&quot; do epitélio do disco de asa, sugerindo que o potencial tumorigênico das células nTSG-knockdown depende do ambiente local. A região da bolsa central funciona como uma &quot;mancha fria do tumor&quot; onde as células pró-tumorais não apresentam crescimento excessivo displásico, enquanto que a região da dobradiça periférica se comporta como um &quot;ponto crítico do tumor&quot; 16 . Nas regiões da bolsa &quot;coldspot&quot;, as células nTSG-knockdown se delaminam do lado basal e sofrem apoptose. Em contraste, as células de dobradiça &quot;hotspot&quot; possuem uma rede de estruturas citoesqueléticas robustas em seus lados basais, as células de nTSG-knockdown se delaminam do lado apical do epitélio e iniciam o crescimento excessivo tumorigênico 16 . Portanto, a análise de fenótipos tumorais em discos imaginários exige consi cuidadoDerrame da susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a formação de tumor neoplásico nos discos imaginários da asa Drosophila utilizando o sistema GAL4-UAS- RNAi pelo qual as células nTSG-knockdown são geradas em epitélio de disco de asa normal. Embora esses sistemas experimentais sejam úteis para estudar os estágios iniciais do câncer, um método de classificação claro para avaliar os estágios da progressão tumoral no epitélio de disco imaginal não foi claramente descrito anteriormente. Portanto, também propomos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos clonais pro-tumorais induzidos no epitélio do disco de asa em três categorias: hiperplasia (acumulação de um número excessivo de células que aparecem normalmente com aumento da proliferação), displasia (tecido pré-maligno composto de aparência anormal Células) e neoplasia (tumor benigno ou maligno composto de células com aparência anormal e padrão de proliferação anormal).

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solução salina (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>soro de cabra normal</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>meio de montagem, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203</td><td>diluídos em PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti<-span class="font13">atubulina</td><td>Developmental Estudos Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>diluído em PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Sondas moleculares</td><td>A22283</td><td>diluídas em PBS, 1:40</td></tr><tr><td>anticorpo IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 546</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11030</td><td>diluídas em PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombinado com UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombinado com UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombinado com UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>cromossomo X</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>terceiro cromossomo</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td> <td># 24650</td><td>segundo cromossomo</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td> <td># 24651</td><td>terceiro cromossomo</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP armadilha de proteína</td></tr></tbody></table>

indução e diagnóstico de tumores em<em&gt; drosophila</em&gt; epitelio do disco imaginal

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Nos estágios iniciais do câncer, as células mutantes transformadas apresentam anormalidades citológicas, começam o excesso de crescimento descontrolado e interromperam progressivamente a organização do tecido. Drosophila melanogaster emergiu como um sistema modelo experimental popular em biologia do câncer para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Em particular, as ferramentas genéticas para discos imagólicos de Drosophila (desenvolvimento de epitélios em larvas) possibilitam a criação de células pro-tumorais transformadas dentro de um tecido epitelial normal, uma situação semelhante às etapas iniciais do câncer humano. Um estudo recente da tumorigênese em discos imaginários da asa de Drosophila , no entanto, mostrou que a iniciação do tumor depende da citoarquitetura do tecido intrínseco e do microambiente local, sugerindo que é importante considerar a susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos na avaliação de fenótipos tumorais em imaginações Discos. Para facilitar a análise fenotípica do tumor progressiEm discos imaginais, aqui descrevemos um protocolo para experiências genéticas usando o sistema GAL4-UAS para induzir tumores neoplásicos em discos imaginais de asa. Além disso, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos das lesões clonais induzidas em epitélios imaginais, pois um método de classificação claro para discriminar vários estágios de progressão tumoral (como hiperplasia, displasia ou neoplasia) não havia sido descrito anteriormente. Esses métodos podem ser amplamente aplicáveis ​​à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .

Para demonstrar a formação de tumores neoplásicos induzidos experimentalmente por NTSG-knockdown mediado por RNAi em discos imaginais de asa de Drosophila , foram utilizados três drivers GAL4 diferentes para expressar UAS-RNAi para lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, que conduz a expressão forte de UAS no Bolsa de asa e expressão suave nas regiões de dobradiça ( Figura 2 e Figura 3A ...

A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.

Indução e diagnóstico de tumores em<em&gt; Drosophila</em&gt; Epitelio do disco imaginal

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar clones em mosaico tumorogênicos em discos imaginais em desenvolvimento de Drosophila e, em seguida, classificar as lesões clonais em diversos estágios de desenvolvimento tumoral. Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na modelagem do câncer, como, por exemplo, como induzir tumores de forma consistente e como classificar o estágio de progressão.As principais vantagens desta técnica são que a injeção do tumor nos discos imaginais da asa de Drosophila é realizada utilizando genética simples de moscas, e que a classificação das fases de desenvolvimento do tumor constitui um diagnóstico simples. Juntamente com Kenta Morimoto, que demonstrará o procedimento, estará Kimiko Morimoto, uma técnica do meu laboratório. Inicie com a montagem do cruzamento genético.12 horas antes de coletar as virgens para o cruzamento, remova todas as moscas adultas dos frascos contendo pupas maduras. No dia seguinte, monte um cruzamento para gerar prole geneticamente mosaic. Transfira 12 a 20 virgens e 10 machos para um frasco novo e incube por um dia a 25 graus Celsius.Após 24 horas, transfira as moscas para um novo frasco e descarte o primeiro frasco em que elas se reproduziram. Após mais 12 horas, os ovos começarão a estar disponíveis. Em intervalos de 12 horas, transfira os adultos para frascos novos e utilize a prole para o experimento.Após incubar os frascos com ovos por dois a quatro dias a 25 graus Celsius, submeta as larvas a um choque térmico por dez a 45 minutos, utilizando um banho-maria a 37 graus Celsius, para indução de clones mosaicais por flip-out GAL4. O choque térmico no segundo dia de desenvolvimento gerará clones em discos imaturos. O choque térmico no terceiro ou quarto dia de desenvolvimento gerará clones em discos mais avançados.Após a choque térmico, devolva os tubos ao incubador a 25 graus Celsius, até que as larvas de terceiro estádio estejam disponíveis. Para começar, use um palito de madeira ou pinça romba para transferir larvas de terceiro estádio em fase de erradiação para uma placa de Petri com PBS. Em seguida, genotipe-as sob luz fluorescente para identificar os marcadores fluorescentes apropriados para larvas em mosaico.Antes de prosseguir, lave as larvas com PBS. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use dois pares de pinças para prender o centro da larva e rasgar o corpo ao meio. Depois, segure os ganchos bucais, empurrando a boca em direção ao corpo, para virar o corpo do avesso.Em seguida, remova materiais desnecessários, como as glândulas salivares e os corpos gordurosos. As larvas estão agora prontas para fixação e coloração com anticorpos, conforme detalhado no protocolo textual. Transfira as preparações teciduais coradas para uma lâmina de microscópio utilizando uma pipeta plástica de transferência de dois mililitros.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as, transfira larvas individuais para gotas de meio de montagem em uma l&acirc;mina de microsc&oacute;pio. Agora, com pin&ccedil;as, isole os discos imaginais. Comece segurando uma extremidade do tecido dissecado e puxando o c&eacute;rebro e os discos olho-antenal com a outra pin&ccedil;a.Mantenha os cérebros prontos para uso. Agora localize os discos imaginais das asas. Os discos imaginais das asas estão aderidos ao lado lateral do tecido dissecado.Em seguida, segure o tecido com uma pinça e remova suavemente os discos alares. Depois, posicione os cérebros próximos aos discos alares, para protegê-los de serem esmagados pelo lamínula. Agora, cubra delicadamente as estruturas com uma lamínula e selar a lamínula com esmalte para unhas.Armazene a lâmina a quatro graus Celsius. Após utilizar um microscópio confocal para adquirir as imagens em pilha Z confocal, abra-as no ImageJ e use o comando Recortar novamente para criar seções virtuais. Elas podem ser feitas no eixo X-Z, no eixo Y-Z ou em um plano personalizado.Para criar o plano personalizado, desenhe uma linha reta ou retângulo sobre a imagem da pilha Z e siga as instruções para o computador gerar sua seção. Utilize essas seções para diagnosticar o tecido quanto a fenótipos tumorais. Primeiro, identifique as massas celulares que se desviam ou apresentam crescimento para fora da camada epitelial principal.Em seguida, para cada massa, determine se a localização subcelular das proteínas de junção parece normal. Outras considerações incluem o tamanho da massa e quaisquer indicações de aumento da proliferação celular dentro da massa. Assim, o tipo de tumor é identificado.Neste exemplo, quatro clones foram classificados, utilizando seções verticais geradas pelo software de imagem. Dois foram classificados como displasia, porque a proteína DLG marcada estava mal localizada. O clone B possui menos de quatro células de tamanho, e o clone C não se desvia do epitélio.Portanto, nem B nem C foram classificados como neoplasia. Os outros dois clones também apresentaram deslocalização de DLG e formaram massas celulares tumorais fora do epitélio. Como o tamanho desses clones deslocados tumorais era superior a quatro células de diâmetro, esses clones foram classificados como neoplásicos.Utilizando os métodos descritos, o gene LGL foi silenciado nas regiões da bolsa alar e da articulação, por meio de RNAi conduzido por sd-GAL4. Em controles que não possuíam o transgene de RNAi, não houve alterações morfológicas nos discos alares de terceiro instar. Nos silenciamentos, deformações epiteliais e crescimentos excessivos tumorogênicos foram claramente observados em certas partes da articulação.No entanto, não foi observado crescimento displásico excessivo na região da bolsa alar. Isso correlacionou-se inversamente com a expressão de MMP1 nessas regiões: uma proteína que confere capacidade metastática. Para monitorar a progressão do crescimento tumoral induzido pela inibição de LGL, clones esparsos que expressam LGL-RNAi foram gerados em discos alares, conforme descrito.Dois dias após o choque térmico em larvas de segundo instar, alguns clones com genes silenciados na região da articulação mostraram desvio do lado apical da camada epitelial. Quatro dias após a indução pelo choque térmico, lesões displásicas na região da articulação tornaram-se evidentes, sugerindo que os clones com genes LGL silenciados, deslocados do lado apical, proliferam no lúmen. Sete dias após a indução pelo choque térmico, crescimentos excessivos tumorais dominaram as regiões da articulação.Ao utilizar sistemas GAL4 do tipo flip-out, é importante lembrar de analisar o efeito da alteração no tempo de choque térmico sobre os fenótipos clonais, pois o potencial tumorígeno de células de discos imaginais pode depender da fase de desenvolvimento, de eventos de sinalização endógenos ou da diferenciação celular.

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo demonstra a técnica de dissecação usada para isolar discos imaginais de Drosophila larvas na fase instar 3. Métodos para fixar o tecido depois de dizer e remover a asa, perna, olho e os discos são demonstradas diretamente sobre uma lâmina de microscópio para visualização posterior.

Dissecação de discos imaginais de 3 larvas Drosophila Instar

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

Ao corar discos imaginais de Drosophila, muitas vezes é realizada uma dissecção grosseira onde os discos são expostos, mas permanecem presos ao corpo. Uma vez corados, os discos de interesse são isolados e montados. O protocolo de exemplo demonstra um procedimento para dissecção e montagem do disco imaginal da asa.

drosófila Dissecção de disco imaginal de larvas: um método para observar o desenvolvimento de epitélios

Cooperação entre um oncogene ativado como RAS V12 e mutações em genes de polaridade celular como íntima, resultar em crescimento do tumor em Drosophila, onde as células tumorais também exibem comportamentos invasivos. Aqui, um protocolo simples para a indução e observação dos tumores benignos e invasoras é apresentado.

Um protocolo para indução genética e Visualização de tumores benignos e invasoras em Cephalic Complexos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Aqui descrevemos um procedimento para capturar imagens ao vivo da gastrulação de Drosophila. Isso nos permitiu entender melhor a constrição apical envolvida no desenvolvimento inicial e analisar melhor os mecanismos que governam os movimentos celulares durante a modificação da estrutura do tecido.

Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas

Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Descrevemos um protocolo para medir contatos entre células em camadas epiteliais adjacentes em discos imaginários de asas de Drosophila vivos usando uma abordagem baseada em reconstituição GFP.

Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

Aprenda a induzir tumores em discos imaginais de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e classificar os estágios de desenvolvimento tumoral. Este método oferece uma abordagem genética simples para modelagem do câncer.

Indução e diagnóstico de tumores em

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