Name: Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a isolar pericitos tipo I e tipo II de músculos esqueléticos de rato usando FACS. Este método permite separação simultânea sem transgenes específicos, facilitando estudos em biologia vascular e medicina regenerativa.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado por um Fundo-A-Fellow subvenção da Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) eo Cientista Development Grant da American Heart Association (16SDG29320001).

Os ratinhos transgénicos de tipo selvagem e Nestin-GFP foram alojados na instalação animal na Universidade de Minnesota. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Dissecção muscular e isolamento de célula única <ol><li> Euthanize camundongos adultos (6-10 semanas, ambos do sexo masculino e feminino) com tribromoetanol (250 mg / kg, ip) e esterilizar a pele do abdômen com etanol 70%. NOTA: O tribromoetanol foi usado aqui em vez de cetamina para anestesia / eutanásia, já que a ketamina é conhecida por interagir com os receptores NMDA, o que poderia potencialmente ter um impacto no estudo. </li><li> Coloque os ratos na posição supina e use um bisturi para fazer uma incisão horizontal na pele abdominal. Descasque a pele com a mão, puxando em direções opostas para expor os músculos dos membros posteriores. </li><li> ColecionarT os músculos de ambos os membros posteriores usando fórceps e tesoura. Armazená-los em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo. </li><li> Lavar os músculos do membro posterior dissecados em PBS gelado suplementado com P / S a 1% duas vezes e transferi-los para uma placa estéril de 10 cm. </li><li> Cuidadosamente dissecar os nervos, vasos sanguíneos e tecido conjuntivo dos músculos usando pinças e tesoura sob um microscópio de dissecção em 2X ampliação. </li><li> Cortar finamente e picar os músculos em pedaços pequenos (1-2 mm 3 ) usando tesouras estéreis e lâminas. Se necessário, adicionar uma pequena quantidade de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) para garantir que os músculos não são secos. </li><li> Quebrar mecanicamente o tecido por pipetagem para cima e para baixo através de uma pipeta serológica de 10 ml 10 vezes. </li><li> Adicionar a solução de digestão recentemente preparada (DMEM suplementado com colagenase de tipo 2 a 0,2%) à mistura. Incubar a 37 ° C por 2 h com gentlAgitação a 35 revoluções / min. </li><li> Triturar utilizando uma agulha de 18 G para homogeneizar a mistura. Em seguida, centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e depois ressuspender o sedimento em 0,25% de tripsina / EDTA. Incubar a 37 ° C durante 10 min. Repita o passo de centrifugação mais duas vezes. </li><li> Adicionar 10 mL de DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) à solução e centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de lise de células vermelhas do sangue (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM e EDTA 0,1 mM). </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de separação (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM e BSA a 1% em PBS livre de Ca / Mg2 + , pH 7,0). Filtrar a mistura através de um filtro de células de 40 um para obter uma suspensão de célula única. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de separação. </li><li> Conte oNúmero de células com um hemocitômetro e diluir a suspensão de célula única para 5 x 10 6 / mL em tampão de triagem. </li></ol> 2. Coloração e Classificação de Células <ol><li> Preparar os controlos ea amostra conforme descrito na Tabela 1 . Mancha a suspensão de célula única com os respectivos anticorpos em gelo durante 30 min, como descrito na Tabela 1 . </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min e lavar os pellets duas vezes com tampão de separação. </li><li> Adicionar DAPI às soluções de célula única, como indicado na Tabela 1. Utilizar 5 μg / mL de DAPI (concentração final) para o controlo de cor única DAPI e 1 μg / mL de DAPI para o controlo de PDGFRβ-PE-FMO e para a amostra. Manter todos os tubos em gelo durante todo o experimento. </li><li> Ative o classificador e o software. Digitalize e insira um chip de classificação de 100 μm quando solicitado. </li><li> Execute a configuração automática ( ie, alinhamento de chip , calibração de gotículas, calibração de fluxo lateral e calibração de atraso de classificaçãoOn) carregando os grânulos de configuração automática quando solicitado. </li><li> Quando a configuração automática estiver concluída, vá para a guia &quot;Experiência&quot;, clique em &quot;Novo&quot; e selecione o &quot;Modelo em Branco&quot; em &quot;Modelos Públicos&quot;. </li><li> Em &quot;Configurações de medição&quot;, digite &quot;DAPI&quot; para &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; para &quot;FL2&quot; e &quot;PDGFRβ&quot; para &quot;FL3.&quot; Desmarque as caixas de &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li> Marque as caixas para ativar os lasers 405, 488 e 561 e clique em &quot;Criar Experiência Nova&quot;. </li><li> Selecione a opção &quot;Start Compensation Wizard&quot; e siga as instruções do software &quot;Compensation Wizard&quot; para configurar a compensação. <ol><li> Carregar o controle sem cor e clique em &quot;Iniciar&quot;. Clique em &quot;Detector &amp; Threshold Settings&quot; e ajuste o ganho do sensor dos detectores FSC e BSC para colocar a população na escala. </li><li> de AnúnciosApenas os níveis de ganho dos canais de fluorescência FL1-FL3 para colocar as populações negativas no lado esquerdo dos histogramas. Clique no botão &quot;Gravar&quot; para gravar os dados. </li><li> Carregar controles de uma cor um por um quando solicitado. Clique em &quot;Iniciar e Gravar&quot; para gravar os dados. Ajustar os portões para as populações positivas nos histogramas. Clique em &quot;Avançar&quot;. </li><li> Vá para &quot;Calcular matriz&quot; na guia &quot;Compensação&quot; e clique em &quot;Calcular&quot; no painel &quot;Calcular configurações de compensação&quot; para executar a compensação. Clique em &quot;Concluir&quot; para sair do &quot;Assistente de compensação&quot;. </li></ol></li><li> Carregue o controle PDGFRβ-PE-FMO e clique em &quot;Iniciar&quot;. Desenhe um portão de polígono (Portão A) em torno das células de interesse sob o gráfico &quot;Todos os Eventos&quot;. </li><li> Clique duas vezes dentro do portão A para criar um gráfico filho. Altere o eixo Y para DAPI e desenhe uma porta poligonal (Gate B) em torno de células vivas (DAPI low ). Clique duas vezes em iNside Gate B para criar um enredo filho. Mude o eixo X para FSC-H e o eixo Y para FSC-W e desenhe uma porta poligonal (Gate C) em torno dos singlets para eliminar dupletos. </li><li> Clique duas vezes dentro do Gate C para criar um gráfico filho. Mudar o eixo X para Nestin-GFP e o eixo Y para PDGFRβ-PE. Clique no botão &quot;Gravar&quot; para gravar os dados. </li><li> Carregue a amostra e repita os passos 2.11-2.12. Após a gravação, clique em &quot;Pausar&quot; para preservar a amostra. </li><li> Definir os limites de passagem para as células PDGFRβ + e Nestin-GFP + com base no controlo PDGFRβ-PE-FMO. Draw portões para o PDGFRβ + Nestin-GFP - e PDGFRβ + Nestin-GFP + populações. </li><li> Em &quot;Método de classificação&quot;, selecione &quot;Tubos de 2 vias&quot; e atribua as células &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; e &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; aos tubos coletores esquerdo e direitoEspecificamente. Montar os tubos de recolha de 15 mL de tampão de triagem na fase de recolha e clicar no botão &quot;Carregar colecção&quot;. </li><li> Clique no botão &quot;Continuar&quot; para manter a amostra em execução. Clique em &quot;Start Sort&quot; para coletar as células PDGFRβ + Nestin-GFP - (tipo I) e células PDGFRβ + Nestin-GFP + (tipo II pericytes). </li></ol> 3. Análises pós-triagem <ol><li> Centrifugar as células classificadas a 500 xg durante 5 min, ressuspender a pastilha em 1 mL de meio pericito (ver Tabela de Materiais ) e contar a densidade celular utilizando um hemocitómetro. </li><li> Os pericitos tipo I e tipo II de sementes em lamínulas revestidas com poli-D-lisina (PDL) a ~ 1 x 10 4 células / cm2. Crescer em meio pericíto durante 3 dias a 37 ° C com 5% de CO2. </li><li> No dia 3, examinar a morfologia do pericito (sob contraste de fase) e endógena Nestin-GFP expressão utilizando um micro fluorescenteÂmbito (laser de excitação: 488 nm, filtro de excitação: 470/40 nm, e filtro de emissão: 515/30 nm). Tire as imagens com um objetivo de 20X (0,45 NA). </li><li> Substituir o meio pericítico por meio adipogênico (meio basal MSC + suplemento estimulante adipogênico) e miogênico (DMEM + 2% soro de cavalo) para iniciar a diferenciação adipogênica e miogênica, respectivamente, conforme descrito anteriormente 20 . Alterar o meio a cada 2-3 dias. </li><li> Fixar as células no dia 17 (14 dias após a diferenciação adipogénica / miogénica) em paraformaldeído a 4% (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente. NOTA: Cuidado, PFA é um carcinógeno. </li><li> Realizar imunocitoquímica contra perilipina (marcador de adipócito) e S-miosina (marcador de miotubo maduro / miofibra), conforme descrito em publicações anteriores 19 , 20 . <ol><li> Lavar as células fixas 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar tampão de bloqueio (PBSSuplementado com soro de burro a 5%, BSA a 3% e Triton X-100 a 0,3%) e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Incubar as células com anticorpos anti-perilipina (2 μg / mL) e / ou anti-S-miosina (2 μg / mL) a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar as células 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as células com anticorpos anti-coelho anti-coelho (4 μg / mL) e / ou Alexa555 anti-rato (4 μg / mL) de burro Alexa 555 à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar as células 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Monte as células imunocoradas com meio de montagem contendo DAPI (ver tabela de materiais). Examine a expressão de perilipina e S-miosina utilizando um microscópio fluorescente (laser de excitação: 543 nm, excitação de 540/45 nm e emissão de 600/50 nm) e tome imagens sob um objetivo 40X (0,60 NA). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Todos os autores não têm conflito de interesse para divulgar.

Os pericitos são células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas na superfície abluminal dos capilares 21 , 26 . Nos músculos esqueléticos, os pericitos são capazes de diferenciar ao longo das vias adipogénicas e / ou miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudos recentes revelaram duas subpopulações de pericitos, ...

A distrofia muscular é uma desordem músculo-degenerativa que não tem nenhum tratamento eficaz até agora. O desenvolvimento de terapias que promovem a regeneração de tecidos tem sido sempre de grande interesse. A regeneração e reparação dos tecidos após os danos dependem das células estaminais / células progenitoras residentes 1 . As células satélites são células precursoras miogénicas comprometidas que contribuem para a regeneração muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . O seu uso clínico, no entanto, é dificultado pela sua migração limitada e baixa taxa de sobrevivência após a injecção, bem como pela sua diminuição da capacidade de diferenciação após a amplificação in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . Além do satelliTe células, os músculos esqueléticos também contêm muitas outras populações de células com potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tais como as células intersticiais positivas ao receptor de factor de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFRp). Há evidências que demonstram que as células PDGFRβ + derivadas de músculo são capazes de se diferenciar em células miogênicas e melhorar a patologia e a função muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . O PDGFRβ rotula predominantemente os pericitos 21 , que são células perivasculares com pluripotência 22 , 23 . Além de PDGFRβ, muitos outros marcadores, incluindo Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, também são usados ​​para iDentify pericytes 21 . Deve-se notar, no entanto, que nenhum desses marcadores é pericítico-específico [ 21] . Estudos recentes revelaram dois subtipos de pericitos musculares, chamados de tipo I e tipo II, que expressam marcadores moleculares diferentes e exercem funções distintas 19 , 24 , 25 . Bioquimicamente, os pericitos do tipo I são NG2 + Nestin - , enquanto os pericídios do tipo II são NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, os pericitos tipo I podem sofrer diferenciação adipogênica, contribuindo para acúmulo de gordura e / ou fibrose, enquanto que os pericitos de tipo II podem se diferenciar ao longo da via miogênica, contribuindo para a regeneração muscular 19 , 24 , 25 . Estes resultados demonstram que: (1) os pericitos de tipo I podem bE alvo no tratamento de transtornos degenerativos gordos / fibrose, e (2) pericitos de tipo II têm grande potencial terapêutico para a distrofia muscular. Outras investigações e caracterização destas populações requerem um protocolo de isolamento que permita a separação dos pericitos tipo I e tipo II com alto grau de pureza. Atualmente, o isolamento de subpopulações pericíticas depende de camundongos duplamente transgênicos NG2-DsRed e Nestin-GFP 19,24. A disponibilidade de ratinhos NG2-DsRed ea qualidade da maioria dos anticorpos NG2 limitam o uso generalizado deste método. Dado que todos os pericitos NG2 + também expressam PDGFRβ nos músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , hipótese de que NG2 pode ser substituído por PDGFRβ para o isolamento de pericitos e suas subpopulações. Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS queUtiliza a coloração PDGFRβ e o sinal Nestin-GFP. Este método é menos exigente para os investigadores porque: (1) não requer o fundo NG2-DsRed e (2) utiliza anticorpos PDGFRβ comercialmente disponíveis, que são bem caracterizados. Além disso, permite o isolamento simultâneo de pericitos tipo I e tipo II com elevada pureza, permitindo uma investigação mais aprofundada da biologia e potencial terapêutico destas subpopulações de pericitos. Após purificação, estas células podem ser cultivadas em cultura, e as suas morfologias podem ser visualizadas. Este trabalho também mostra que os pericitos tipo I e tipo II isolados usando este método, como os purificados a partir de camundongos duplamente transgênicos, são adipogênicos e miogênicos, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Classificador de Células</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Configuração Automática de Contas</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Perócitos</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Estimulador Adipogênico (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;-PE Anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Perilipin</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo S-Miosina</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-coelho anticorpo& nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-mouse anticorpo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Agulhas</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta sorológica</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de pericitos tipo i e tipo ii de músculos esqueléticos de rato

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericitos são células multipotentes perivasculares que mostram heterogeneidade em diferentes órgãos ou mesmo dentro do mesmo tecido. Nos músculos esqueléticos, há pelo menos duas subpopulações de pericitos (chamadas de tipo I e tipo II), que expressam diferentes marcadores moleculares e possuem distintas capacidades de diferenciação. Utilizando ratinhos duplamente transgénicos NG2-DsRed e Nestin-GFP, os pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) foram isolados com sucesso. Contudo, a disponibilidade destes ratinhos duplamente transgénicos impede o uso generalizado deste método de purificação. Este trabalho descreve um protocolo alternativo que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II a partir de músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza a técnica de triagem de células activada por fluorescência (FACS) e alvos PDGFRβ, em vez de NG2, juntamente com o sinal de Nestin-GFP. Após o isolamento, o tipo I e tyOs pericitos II apresentam morfologias distintas. Adicionalmente, os pericitos de tipo I e de tipo II isolados com este novo método, como os isolados a partir de ratinhos duplamente transgénicos, são adipogénicos e miogénicos, respectivamente. Esses resultados sugerem que este protocolo pode ser utilizado para isolar subpopulações de pericitos dos músculos esqueléticos e, possivelmente, de outros tecidos.

Os parâmetros FACS, incluindo a intensidade do laser e a compensação do canal, são corrigidos com base nos resultados de controles sem cor e controles de cor única. O controlo PDGFRβ-PE-FMO é utilizado para definir o gating para a população de PDGFRβ-PE + ( Figura 1A ). Entre as células PDGFRβ-PE, duas populações que representam as células Nestin-GFP + e Nestin-GFP estão claramente separadas ( Figura 1A ). ...

Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II dos músculos esqueléticos.

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar subpopulações de pericitos a partir de músculos esqueléticos utilizando FACS. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia dos pericitos, como qual é a diferença biológica entre pericitos do tipo I e do tipo II? A principal vantagem deste protocolo é que permite o isolamento simultâneo de pericitos do tipo I e do tipo II sem o uso do transgene NG2 dsRED.As aplicações deste protocolo não se limitam aos músculos esqueléticos. Ele também pode ser usado para isolar pericitos de outros órgãos, como o cérebro. Para começar, obtenha primeiro o tecido desejado de um camundongo transgênico nestina-GFP e, em seguida, lave o tecido duas vezes em PBS frio contendo antibióticos.Em seguida, transfira as amostras para uma placa estéril de 10 centímetros. Depois, utilizando tesouras e lâminas estéreis, corte os músculos em pequenos pedaços de um a dois milímetros cúbicos. Se necessário, adicione uma pequena quantidade de DMEM para evitar que o tecido seque.Pipete o tecido para cima e para baixo através de uma pipeta serológica de 10 milímetros para rompê-lo mecanicamente. Em seguida, adicione solução digestiva fresca, D

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra um método para isolar pericitos cerebrais de um cérebro de camundongo. As células isoladas são cultivadas em meios específicos de pericitos para promover a proliferação de pericitos.

Isolando e cultivando pericitos cerebrais de camundongos

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos (MMEC) forma a parede interna dos capilares musculares e regular a ambos, troca de fluidos/moléculas e migração de células (imunes) entre o tecido muscular e sangue. Isolamento de MMEC murino primário, conforme descrito aqui, permite investigações in vitro abrangentes da unidade"myovascular".

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

Nós otimizamos um protocolo para isolar e purificar pericitos cardíacos murinos para pesquisa básica e investigação de sua biologia e potencial terapêutico.

Isolamento e purificação de Pericytes cardíacos murinos

Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

Para obter perícitos corticais cerebrais de camundongo que atendam às demandas do scRNA-seq, apresentamos um protocolo FACS criticamente otimizado baseado na seleção CD13⁺/CD31⁻. Nossos principais aprimoramentos melhoram significativamente a viabilidade celular e a integridade do RNA, permitindo um perfil transcriptômico confiável.

Isolamento de Perícitos de Tecido Cortical de Camundongos Usando FACS para Sequenciamento de Células Únicas

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda a isolar pericitos tipo I e tipo II de músculos esqueléticos de rato usando FACS. Este método permite separação simultânea sem transgenes específicos, facilitando estudos em biologia vascular e medicina regenerativa.

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

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