Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

O objetivo geral deste experimento é apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose na parede celular vegetal por imagem Raman e análise multivariada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biomassa vegetal, como como os principais componentes químicos se distribuem na parede celular da planta. A principal vantagem dessa técnica é que informações sem trabalho e não destrutivas sobre a amostra podem ser obtidas com o mínimo de preparação da amostra.

Para começar, corte um pequeno bloco de tecido da amostra da planta. Mergulhe o tecido em água deionizada fervente por 30 minutos. Em seguida, transfira-o imediatamente para água deionizada em temperatura ambiente por 30 minutos.

Repita esta etapa até que o tecido afunde no fundo do recipiente, indicando que o ar no tecido foi removido e que o tecido amoleceu. Prepare alíquotas de 20%, 50%, 70% e 90% de PEG e água deionizada, bem como PEG puro. Mantenha as soluções a 65 graus Celsius.

Incube o tecido em uma série de banhos graduados de PEG para deslocar a água e permitir que o PEG se infiltre. Seque em 20% PEG por uma hora, 50% PEG por uma hora e meia, 70% PEG por duas horas, 90% PEG por duas horas e 100% PEG por 10 horas. Em seguida, pré-aqueça uma fita a 65 graus Celsius em um forno.

Despeje o bloco de tecido contendo PEG no e, em seguida, coloque o bloco de tecido na posição desejada usando pinças ou agulhas pré-aquecidas. Resfrie lentamente o e armazene o lenço em temperatura ambiente até o uso. Disseque o bloco PEG contendo o tecido alvo em um pequeno bloco usando uma lâmina de barbear afiada.

Monte o pequeno bloco PEG no micrótomo e corte seções finas do bloco PEG. Em seguida, enxágue as seções com água deionizada em uma classe de relógio 10 vezes para remover o PEG do tecido. Em seguida, mergulhe as seções com tolueno e etanol por seis horas para remover os extrativos.

Prepare o líquido de reação misturando 65 mL de água deionizada, 0,5 mL de ácido acético e 0,6 g de cloreto de sódio em um béquer. Adicione uma seção e 3 mL de líquido de reação a um frasco de 5 mL. Aparafuse a parte superior do frasco.

Em seguida, aqueça o frasco em banho-maria a 75 graus Celsius por duas horas para remover a lignina do tecido. Enxágue a seção com água deionizada em um vidro de relógio 10 vezes. Em seguida, transfira a seção não tratada e deslignificada para uma lâmina de microscópio de vidro.

Desdobre a seção cuidadosamente usando pincéis ou agulhas. Remova a água deionizada extra com papel de seda. Em seguida, mergulhe a seção em óxido de deutério.

Cubra a amostra com uma lamínula de vidro. Sele a lamínula com esmalte para evitar a evaporação do óxido de deutério. Abra o software de operação do instrumento do microscópio Raman confocal.

Ligue o laser e concentre-se no serviço do cristal e do silício com uma objetiva de microscópio de 100x. Clique no botão de calibração para calibrar o instrumento. Mude o instrumento para o modo de microscópio óptico e ligue o microscópio lamp.

Monte a lâmina do microscópio no palco, com a lamínula voltada para a objetiva. Visualize a amostra com a objetiva de microscópio 20x e localize a área de interesse. Mude para a objetiva do microscópio de imersão.

Aplique óleo de imersão na lamínula e, em seguida, concentre-se na superfície da amostra. Em seguida, mude o instrumento para o modo de teste Raman e desligue o microscópio lamp. Escolha uma área de mapeamento usando uma ferramenta retangular.

Altere o tamanho do passo para determinar o número de espectros obtidos. Esteja ciente de que o tamanho do passo deve ser maior que o diâmetro do ponto, calculado pela abertura numérica da objetiva. Tamanhos abaixo disso resultarão em amostragem excessiva.

Defina os parâmetros espectrais ideais para obter a melhor relação sinal-ruído e qualidade espectral, e um tempo de aquisição apropriado, dependendo da adequação da amostra. Geralmente, insira os parâmetros de imagem no software do instrumento usando um comprimento de onda de laser de 532 nanômetros, um filtro de 100% um orifício de 300, uma fenda de 100, um espectrômetro de 1840 centímetros inversos, ranhuras de 1200T, uma objetiva de óleo de 60x e um tempo de aquisição de dois segundos. Salve os dados espectrais antes do processamento de dados e converta-os em um formato universal antes de prosseguir para a análise de dados, conforme descrito no protocolo de texto.

Os espectros Raman originais da parede celular do choupo são mostrados aqui. Dois grandes sinais de ruído, incluindo desvios de linha de base e picos cósmicos, transbordam para os canais junto com os sinais reais. Estes devem ser removidos antes da análise dos dados.

Uma técnica de redução de ruído, como o algoritmo Savitzky-Golay ou o algoritmo wavelet, pode ser aplicada para eliminar esses sinais de ruído. Para imagens de lignina, considere o pico espectral em torno de 1600 centímetros inversos devido à vibração de alongamento simétrico do anel aromático. Para imagens de polissacarídeos, use o pico espectral em torno de 2889 centímetros inversos por causa dos trechos CH e CH2.

No entanto, imagens Raman de celulose e hemicelulose não podem ser geradas diretamente. A deslignificação é um procedimento necessário para expor as características espectrais deles. Geralmente, somos novos nesse método.

Nós lutamos, porque requer treinamento no manuseio e aparência do seccionamento da amostra e na análise de dados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir informações químicas sobre a parede celular da planta usando métodos in-situ. Após este procedimento, outros métodos, como o pré-tratamento químico, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a recalcitrância da parede celular da planta.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a natureza estrutural interna e a topoquímica dentro da parede celular da planta, ele também pode ser aplicado a outras amostras biológicas.