Name: Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem Raman e análise multivariada. Este método não destrutivo permite mapear a composição química da biomassa vegetal com mínima preparação.

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Agradecemos ao Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2016YDF0600803) o apoio financeiro.

1. Preparação da amostra <ol><li> Corte um pequeno bloco de tecido (cerca de 3 mm x 3 mm x 5 mm) da amostra da planta ( por exemplo, uma haste de álamo). </li><li> Mergulhe o tecido em água desionizada fervente durante 30 min. Imediatamente transferi-lo para água desionizada à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Repita este passo até o tecido escorrer no fundo do recipiente, indicando que o ar no tecido foi removido e que o tecido se amaciou. Nota: Para as amostras que afundam no fundo antes desta etapa, geralmente repita este ciclo 3-5 vezes. </li><li> Prepare as alíquotas 20, 50, 70, 90% (v / v) de polietileno glicol (PEG) em água desionizada, bem como PEG puro e mantenha as soluções a 65 ° C. </li><li> Incube o tecido em uma série de banhos graduados de PEG para deslocar a água e permitir que o PEG se infiltre. Nota: Tipicamente, PEG com um peso molecular de 2.000 (PEG2000) é usado para incorporação. <ol><li> Processar o tecido com gPEG radiado num forno de secagem da seguinte forma: (a) 20% de PEG durante 1 h, (b) 50% de PEG durante 1,5 h, (c) 70% de PEG durante 2 h, (d) 90% de PEG durante 2 h e (E) 100% de PEG por 10 h. </li></ol></li><li> Pré-aqueça uma cassete a 65 ° C no forno. Despeje o PEG que contém o bloco na cassete e, em seguida, coloque o bloco de tecido em uma posição desejada usando pinças pré-aquecidas ou agulhas. </li><li> Lixar lentamente a cassete e armazenar o tecido à TA até o uso. </li><li> Disseca o bloco de PEG contendo o tecido alvo em um pequeno bloco (cerca de 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando uma lâmina afiada e montá-lo no microtomo. </li><li> Corte seções finas do bloco PEG (tipicamente 3-10 μm). </li><li> Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes para remover o PEG do tecido. </li><li> Mergulhe as secções com tolueno / etanol (2: 1, v / v) durante 6 h para remover os extrativos. Prepare o líquido de reação misturando 65 mL de água desionizada, 0,5 mL de ácido acético e 0,6 g de chlo de sódioRito em um copo. Adicione uma seção e 3 mL de líquido de reação a um frasco de 5 mL. Aperte o topo do frasco. </li><li> Aqueça o frasco em banho-maria a 75 ° C durante 2 h para remover a lignina do tecido. Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes. </li><li> Transfira a seção não tratada / desligada para uma lâmina de microscópio de vidro. Desdobre a seção com cuidado usando escovas ou agulhas. Remova a água extra desionizada com papel de seda. </li><li> Mergulhe a seção em D 2 O. Cubra a amostra com uma cobertura de vidro. Selar a tampa com esmalte para evitar a evaporação do D 2 O. </li></ol> 2. Aquisição espectral <ol><li> Abra o software de operação do instrumento do microscópio Raman confocal. Ligue o laser (comprimento de onda = 532 nm), foco na superfície do silício cristalino com um objetivo de microscópio 100X e clique no botão de calibração para calibrar o instrumento. </li><li> Mude o instrumentoPara o modo microscópio óptico e acenda a lâmpada do microscópio. Monte o escorredor do microscópio no palco, com a tampa deslizante voltada para o objetivo. </li><li> Veja a amostra com um objetivo de microscópio 20X e localize a área de interesse. Aplique óleo de imersão na lamínula e mude para o objetivo do microscópio de imersão (60X, abertura numérica NA = 1.35). Concentre-se na superfície da amostra. </li><li> Mude o instrumento para o modo de teste Raman e desligue a lâmpada do microscópio. </li><li> Escolha uma área de mapeamento usando uma ferramenta retangular. Altere o tamanho do passo para determinar o número de espectros obtidos. Nota: Esteja ciente do tamanho do passo (geralmente maior do que o diâmetro do ponto calculado pela abertura numérica do objetivo, teoricamente 1,22λ / NA). Tamanhos abaixo disso resultarão em oversampling. </li><li> Defina os parâmetros espectrais ótimos para obter a melhor relação sinal-ruído (SNR) e qualidade espectral em um tempo de aquisição apropriado (geralmente &lt;8 h), depeCom base na adequação da amostra. Em geral, insira os parâmetros de imagem no software do instrumento da seguinte forma: laser (532 nm), filtro (100%), furo (300), fenda (100), espectrômetro (1.840 cm -1 ), sulcos (1200t), objetivo ( Óleo 60X) e tempo de aquisição (2 s). </li><li> Salve os dados espectrales antes do processamento de dados e converta-os em um formato universal ( por exemplo, arquivos TXT). </li></ol> 3. Análise de dados <ol><li> Carregue os dados espectrales (arquivos TXT) no software de análise de dados ( por exemplo, Matlab). Aplique uma técnica de redução de ruído no conjunto de dados para melhorar o SNR ( por exemplo, o algoritmo Savitzsky-Golay ou o algoritmo wavelet) </li><li> Use amostras não tratadas para produzir imagens de lignina e polissacarídeos. Para a imagem de lignina, considere o pico espectral em torno de 1.600 cm -1 devido à vibração de alongamento simétrica do anel aromático. Para imagens de polissacarídeos (incluindo celulose e hemicelulose), use o pico espectral aRodada 2.889 cm -1 por causa dos trechos CH e CH 2 . </li><li> Use amostras deslocadas para gerar imagens de celulose e hemicelulose. Execute a resolução da curva de auto-modelagem (SMCR) nos espectros adquiridos para discriminar os espectros de celulose e hemicelulose e para a imagem de suas distribuições. </li><li> Execute análise de componentes principais (PCA) e análise de agrupamento nos dados adquiridos para distinguir os espectros Raman de camadas de parede celular diferentes. </li></ol>

<ol><li>Gonzalo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Enzymes+Involved+in+Lignin+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation.</a> J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).</li>
<li>Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosatella%2C+AA+%22Ionic+Liquids+in+the+Biorefinery+Concept%3A+Challenges+and+Perspectives%22">Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives</a>. , Wiley. 38-64 (2016).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+tissue+specific+compositions+of+bioenergy+feedstocks+Through+hyperspectral+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%22%5BJournal%5D)">Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging.</a> Bio. 108 (2), 286-295 (2009).</li>
<li>Tolstik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+HCC+tissues+by+Raman+imaging+with+identification+of+fatty+acids+as+potential+lipid+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).</li>
<li>Schrader, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchrader%2C+B+%22Infrared+and+Raman+spectroscopy%3A+methods+and+applications%22">Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications</a>. , John Wiley and Sons. (2008).</li>
<li>Gierlinger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+plant+cell+walls+by+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).</li>
<li>Luca, A. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).</li>
<li>Schlücker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+comparison+of+point%2C+line%2C+and+wide-field+imaging+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies.</a> Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).</li>
<li>Cooper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743998001749">Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications.</a> Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsiau, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003259101000046X">The study of granular agglomeration mechanism.</a> Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+removing+spectral+contaminants+to+improve+analysis+of+Raman+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data.</a> Sci. Rep. 6, 39891(2016).</li>
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<li>Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1267173">Self modeling curve resolution.</a> Technometrics. 13, 617-633 (1971).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automatically+identifying+spectra+of+different+wood+cell+wall+layers+in+Raman+imaging+data+set%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set.</a> Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).</li>
<li>Kudelski, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914008001641">Analytical application of Raman spectroscopy.</a> Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A parede celular da planta é um composto que é organizado em várias camadas, incluindo o canto da célula (CC), a parede secundária (SW, com as camadas S1, S2 e S3) e a lamela intermediária composta (LMC, lamela média mais a primária adjacente Parede), o que dificulta a obtenção de uma superfície plana durante a preparação da amostra. Assim, as amostras de plantas, especialmente a grama, que tem uma estrutura mais complicada do que a madeira, muitas vezes precisam ser solidificadas para permitir a separação fina. O PEG é...

A biomassa vegetal é o recurso renovável mais abundante na Terra; é composta principalmente de lignina, celulose e hemicelulose; e é considerada uma fonte atraente de bioenergia e produtos químicos de base biológica1. Infelizmente, pode resistir à degradação e conferir estabilidade hidrolítica ou robustez estrutural à parede celular da planta. Essa resistência é atribuível à área de superfície acessível, tamanho de partícula de biomassa, grau de polimerização, cristalinidade da celulose e lignina protetora2. Uma compreensão abrangente da natureza estrutural e química da parede celular vegetal é, portanto, significativa do ponto de vista da biologia e química vegetal, bem como da utilização comercial. As análises de química úmida comumente usadas, como cromatografia, espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear, fornecem apenas dados de composição médios da amostra medida. Além disso, esses métodos são invasivos e destroem a estrutura original do tecido vegetal3. 
A técnica de imagem Raman é uma ferramenta poderosa para a visualização não destrutiva de informações químicas espacialmente resolvidas4. Ele usa uma luz laser para causar espalhamento inelástico com um fóton e depende de mudanças na polarizabilidade decorrentes das vibrações moleculares. Nesse caso, a água causa um fraco espalhamento Raman, o que torna essa abordagem adequada para investigações in situ de amostras biológicas5. A aplicação da técnica de imagem Raman à parede celular vegetal pode elucidar a estrutura e composição das paredes celulares vegetais em seu estado nativo, com a resolução na escala da célula única e até mesmo das camadas da parede celular6. Uma análise típica de imagem Raman da parede celular de uma planta geralmente consiste em três etapas: 1) preparação da amostra, 2) aquisição espectral e 3) processamento de dados. 
Embora uma das principais vantagens da imagem Raman seja a capacidade de obter espectros livres de rótulos e não destrutivos com preparação mínima de amostras, o corte físico da amostra ainda é necessário para expor a superfície de interesse. Este processo deve ser realizado com cuidado para obter uma superfície plana, uma vez que a técnica depende da manutenção do foco óptico7. A aquisição espectral requer um equilíbrio entre qualidade de imagem e tempos de aquisição extensos8. O processamento de dados visa extrair efetivamente as informações químicas dos dados de imagem, especialmente para os componentes com estruturas químicas semelhantes, como celulose e hemicelulose. Devido à forte sobreposição espectral, os espectros exatos são difíceis de discernir. Nesse caso, a análise multivariada é uma abordagem direta para descobrir efetivamente as informações estruturais e químicas ocultas9. Este trabalho apresenta um protocolo geral que descreve o uso de imagens Raman para visualizar os principais componentes das paredes celulares vegetais, incluindo lignina, celulose e hemicelulose.

<table><tbody><tr><td>Microtomo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM430</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Raman Confocal</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Xplora</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Shanghai ZHICHENG</td><td>ZXFD-A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando imagem raman e análise multivariada para visualizar lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

A aplicação da imagem de Raman para planta de biomassa está aumentando porque pode oferecer informações espaciais e de composição sobre soluções aquosas. A análise geralmente não requer preparação extensiva de amostras; As informações estruturais e químicas podem ser obtidas sem rotulagem. No entanto, cada imagem Raman contém milhares de espectros; Isso levanta dificuldades ao extrair informações ocultas, especialmente para componentes com estruturas químicas semelhantes. Este trabalho apresenta uma análise multivariada para resolver esta questão. O protocolo estabelece um método geral para visualizar os principais componentes, incluindo lignina, celulose e hemicelulose dentro da parede celular da planta. Neste protocolo, são descritos os procedimentos para preparação de amostras, aquisição espectral e processamento de dados. É altamente dependente da habilidade do operador na preparação da amostra e análise de dados. Ao usar essa abordagem, uma investigação Raman pode ser realizada por um usuário não especialista para adquirirDados de qualidade h e resultados significativos para análise de parede celular vegetal.

A Figura 1 apresenta uma visão geral de um sistema típico de micro-Raman para a imagem de Raman de uma parede celular de planta. Por exemplo, os espectros de Raman originais do álamo ( Populus nigra L.) têm derivações e espigas de linha de base significativas ( Figura 2a ). Depois de executar o método de pré-processamento automático para o conjunto de dados de imagem Raman (APRI), esses dois contaminantes espectrales sã...

Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

O objetivo geral deste experimento é apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose na parede celular vegetal por meio de imagem Raman e análise multivariada. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biomassa vegetal, como a distribuição dos principais componentes químicos na parede celular vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que informações isentas de manipulação e não destrutivas sobre a amostra podem ser obtidas com preparação mínima da amostra.Para começar, corte um pequeno bloco de tecido da amostra vegetal. Mergulhe o tecido em água desionizada fervente por 30 minutos. Em seguida, transfira-o imediatamente para água desionizada à temperatura ambiente por 30 minutos.Repita este passo até que o tecido afunde até o fundo do recipiente, indicando que o ar presente no tecido foi removido e que o tecido amaciou. Prepare alíquotas de 20%, 50%, 70% e 90% de PEG e água deionizada, bem como PEG puro. Mantenha as soluções a 65 graus Celsius.Incube o tecido em uma série de banhos de PEG com concentrações crescentes para deslocar a água e permitir a infiltração do PEG. Seque em 20% PEG por uma hora, 50% PEG por uma hora e

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição dos carboidratos da parede derivadas.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

Um método baseado em microscopia confocal Raman é apresentado que proporciona rótulo sem visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécies.

Label-free In situ Imaging de lignificação na parede celular das plantas

A estrutura da parede celular vegetal e as características químicas são avaliadas para identificar matérias-primas ideais para biocombustíveis e biomateriais. Os métodos padrão têm limitações quando aplicados a grandes conjuntos de dados. Esses métodos de pré-tratamento de alto rendimento, sacarificação enzimática e espectrometria de massa de feixe molecular de pirólise comparam um grande número de amostras de biomassa com tempo e custo experimentais reduzidos.

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora.  Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

BLISS, um protocolo de rotulagem duplo para estudar a dinâmica de lignificação, foi desenvolvido. Usando o monolignol sintético repórteres e uma combinação sequencial de SPAAC e CuAAC opaco clique em reações, abre esta metodologia o caminho para uma análise detalhada dos fatores que regulam a biogênese de Ligninas em planta.

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Este protocolo descreve uma configuração original que combina medições espectrais e fluorescência ao longo da vida para avaliar a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) entre sondas fluorescentes à base de rodamina e polímero de lignina diretamente em seções de plantas espessas.

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