Name: Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a analisar a especificidade de anticorpos contra histonas usando microarrays de peptídeos. Este método permite gerar perfis detalhados de reconhecimento de modificações pós-traducionais em pesquisa de bioquímica de cromatina.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo Van Andel Research Institute e uma bolsa de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (CA181343) para SBR

Os autores não têm nada a revelar.

A confiabilidade de anticorpos em aplicações de pesquisa biomédica é primordial 46 , 47 . Isto é especialmente verdadeiro na bioquímica da cromatina, dada a posição dos anticorpos como ferramentas-chave para a maioria das técnicas desenvolvidas para caracterizar a abundância e distribuição de PTM de histonas. O protocolo apresentado aqui detalha um pipeline otimizado para o projeto, fabricação e uso de microarrays de péptidos para analisar a especificidade de an...

O DNA genômico é embalado elegantemente dentro do núcleo da célula eucariótica com proteínas histonas para formar cromatina. A subunidade de repetição da cromatina é o nucleossoma, que consiste em 147 pares de bases de DNA envolvidos em torno de um núcleo octamerico de proteínas histonas - H2A, H2B, H3 e H4 1 . A cromatina é amplamente organizada em eucromatina vagamente compactada e domínios de heterocromatina bem embalados. O grau de compactação da cromatina regula a medida em que as máquinas de proteínas podem acessar o DNA subjacente para realizar processos fundamentais de DNA, tais como replicação, transcrição e reparo. Os principais reguladores da acessibilidade do genoma no contexto da cromatina são PTMs na cauda não estruturada e nos domínios principais das proteínas das histonas 2 , 3 . Os PTM Histone funcionam diretamente influenciando a estrutura da cromatina 4 e indiretamente através daH o recrutamento de proteínas leitoras e seus complexos macromoleculares associados que possuem atividades de remodelação da cromatina, enzima e andaimes 5 . Estudos sobre a função das histonas PTM nas últimas duas décadas sugerem esmagadoramente que essas marcas desempenham papéis fundamentais na regulação do destino das células, do desenvolvimento organizacional e da iniciação / progressão da doença. Alimentado pelos avanços na tecnologia proteômica baseada em espectrometria de massa, foram descobertas mais de 20 PTM de histonas únicas em mais de 80 resíduos de histonas distintas 6 . Notavelmente, essas modificações geralmente ocorrem em combinações e consistentes com a hipótese do &quot;código histônico&quot;, numerosos estudos sugerem que as proteínas leitoras são direcionadas para regiões discretas de cromatina através do reconhecimento de combinações específicas de histonas PTM 7 , 8 , 9 . Um desafio chave para avançar será atribuir funções ao grDevido a lista de PTM de histonas e para determinar como combinações específicas de PTM de histonas orquestra as funções dinâmicas associadas à cromatina. Os anticorpos são os reagentes lynchpin para a detecção de PTM de histonas. Como tal, mais de 1.000 anticorpos específicos de PTM de histonas foram comercialmente desenvolvidos para uso em pesquisa de bioquímica de cromatina. Com o rápido desenvolvimento da tecnologia de sequenciação de DNA de alto rendimento, esses reagentes estão sendo amplamente utilizados por pesquisadores individuais e iniciativas de &quot;roteiro&quot; de epigenômica em larga escala ( por exemplo , ENCODE e BLUEPRINT) em ChIP-seq (imunoprecipitação de cromatina, juntamente com sequenciação da próxima geração ) Pipelines para gerar mapas espaciais de alta resolução da distribuição de histonas PTM em todo o genoma 10 , 11 . No entanto, estudos recentes mostraram que a especificidade dos anticorpos PTM das histonas pode ser altamente variável e que esses reagentes exibem falta<html> Propriedades avoráveis, como o reconhecimento do epitopo fora do alvo, forte influência positiva e negativa dos PTM vizinhos e dificuldade em discriminar a ordem de modificação sobre um resíduo particular ( por exemplo , mono-, di- ou trimetilisina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16, 17, 18. Portanto, o controle de qualidade rigoroso dos reagentes de anticorpos específicos de PTM de histonas é necessário para interpretar com precisão os dados gerados com esses reagentes valiosos. A tecnologia Microarray permite a interrogação simultânea de milhares de interações macromoleculares em um formato de alto rendimento, reprodutível e miniaturizado. Por esta razão, uma variedade de plataformas de microarray foram criadas para analisar proteína-DNA 19 ,&quot;, 20, proteína-proteína 21 e interações proteína-péptido 22. Na verdade, as microarrays de péptidos de histonas emergiram como uma plataforma de descoberta informativa para pesquisa de bioquímica de cromatina, permitindo o perfil de alto rendimento dos escritores, borrachas e leitores de histonas PTMs 15 , 23 , 24 e também para a análise da especificidade do anticorpo das histonas 17 , 25. Além da sua aplicação na pesquisa de cromatina e epigenética, os arrays de péptidos de histona possuem utilidade potencial como teste diagnóstico / prognóstico para lúpus eritematoso sistêmico e outras doenças autoimunes em que os anticorpos anti- Os autoanticorpos da cromatina são gerados 26 , 27 . Aqui, descrevemos um pipeline integrado que desenvolvemos para projetar, fabricar e queGerando microarrays de péptidos de histona para gerar perfis de especificidade para anticorpos que reconhecem histonas e seus PTMs. O pipeline é facilitado pela ArrayNinja, uma aplicação de software de código aberto e interativa que desenvolvemos recentemente, que integra os estágios de design e análise das experiências de microarrays 28 . ArrayNinja funciona melhor no Google Chrome. Resumidamente, uma impressora de microarray de contato robotizado é usada para depositar uma biblioteca de péptidos de histona conjugados com biotina em posições definidas em lâminas de microscópio de vidro revestidas com estreptavidina. As matrizes podem então ser usadas em um formato de ensaio competitivo e paralelo para interrogar interações anticorpo-epítopo ( Figura 1 ). A biblioteca de péptidos consiste em centenas de péptidos sintéticos únicos que abrigam PTMs (acetilação de lisina, metilação de lisina / arginina e fosforilação de serina / treonina) e em combinações relevantes em grande parte derivadas de conjuntos de dados proteômicos. Métodos para síntese e validação de péptidos<html> São detalhados em outro lugar 23 . Os dados gerados a partir dos nossos atuais esforços de rastreamento de anticorpos de PTM de histonas utilizando esta plataforma de matriz são arquivados em um recurso público da Web, a Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Notavelmente, as microarrays de péptidos de histonas fabricadas com variações deste protocolo também foram utilizadas amplamente para caracterizar a atividade dos domínios de leitor PTM de histona 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e, mais recentemente, para histona de perfil Atividades de gravador e borracha PTM 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Desenho dos desenhos animados do procedimento Stepwise para triagem de anticorpos em um microarray de péptido de histona. Os péptidos de histona biotinilados que abrigam modificações pós-translacionais definidas (círculos vermelho e azul) são co-impressos com biotina-fluoresceína em vidro revestido com estreptavidina. As interações positivas são visualizadas como fluorescência vermelha. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Impressão Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-coated microscópio de vidro slides</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polipropileno 384 placa de poço</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-fluoresceína</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>contato impressora de microarray</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Impressora</td></tr> de <tr><td>Microarray Impressora de microarray de contato</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray Printer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de cera hidrofóbica</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Barreira hidrofóbica PAP Caneta</td></tr><tr><td>de silicone Junta</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de Hibridização</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>ou vaso similar</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-coelho)</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td></tr><tr><td>Cera Impressora</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>ou scanner de microarray equivalente</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Motivo ativo de matriz de peptídeos</td><td></td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Microarrays de peptídeos de código de histona</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>cera</td><td>Royal Oak</td><td>GulfWax</td><td>para impressão de cera</td></tr> Câmara <tr><td>de hibridização de slides de microarray umidificado</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de lavagem de lâminas de microscópio de alto rendimento</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio centrífuga de lâminas</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo de histona biotinilada</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Exemplo de peptídeo. Peptídeos semelhantes com várias modificações estão disponíveis em várias fontes comerciais.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

As modificações pós-translacionais (PTMs) nas proteínas das histonas são amplamente estudadas quanto aos seus papéis na regulação da estrutura da cromatina e da expressão gênica. A produção em massa e a distribuição de anticorpos específicos para as PTM das histonas facilitaram grandemente a pesquisa nessas marcas. Como os anticorpos PTM das histonas são reagentes-chave para muitas aplicações de bioquímica de cromatina, a análise rigorosa da especificidade do anticorpo é necessária para a interpretação precisa dos dados e o progresso contínuo no campo. Este protocolo descreve uma tubagem integrada para o projeto, fabricação e uso de microarrays de péptidos para perfilar a especificidade de anticorpos de histonas. Os aspectos de design e análise deste procedimento são facilitados pelo ArrayNinja, um pacote de software de código aberto e interativo desenvolvido recentemente para simplificar a personalização de formatos de impressão em microarray. Este pipeline foi usado para exibir um grande número de antibióticos de histona PTM, amplamente utilizados e comercializados.S, e os dados gerados a partir dessas experiências estão disponíveis gratuitamente através de um banco de dados de especificações de anticorpos de histona online e em expansão. Além das histonas, a metodologia geral aqui descrita pode ser aplicada amplamente à análise de anticorpos específicos de PTM.

Este protocolo tem sido usado para projetar e fabricar uma plataforma de microarrays de péptidos para a análise da especificidade de anticorpos de PTM das histonas. A matriz consulta uma biblioteca de mais de 300 características peptídicas únicas (20 a 40 resíduos de comprimento) representando muitas das combinações conhecidas de PTMs encontradas nas proteínas histonas núcleo e variante 38 . Este pipeline tem sido um campo de trabalho para a triagem de muitos anti...

Este manuscrito descreve métodos para a aplicação de tecnologia de microarrays de péptidos para o perfil específico de anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-tradução.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

O objetivo deste vídeo é descrever um fluxo integrado para o projeto, fabricação e uso de microarranjos de peptídeos para caracterização das especificidades de anticorpos contra histonas. Anticorpos que reconhecem histonas e suas diversas modificações pós-traducionais são reagentes essenciais na pesquisa em bioquímica da cromatina. Contamos com essas ferramentas para aprofundar nosso entendimento sobre a função das modificações de histonas.Estudos recentes revelam inconsistências no comportamento dos anticorpos contra histonas. Como a escolha do anticorpo é o elemento mais crítico em experimentos de epigenética, são exigidas medidas rigorosas e abrangentes de controle de qualidade para esses reagentes. Aqui, demonstramos um fluxo de trabalho integrado que desenvolvemos para o planejamento, fabricação e análise de microarranjos de peptídeos, com o objetivo de gerar perfis de especificidade para anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-traducionais.O processo é facilitado pelo Array Ninja, um aplicativo interativo de software livre que desenvolvemos, que integra as etapas de planejamento e análise de experimentos com microarranjos. Para começar a projetar o lâmina do arranjo, no título planejar um layout de lâmina, selecione a impressora de microarranjo que será utilizada. Em seguida, digite vazio no campo de placa de carregamento e pressione enter.Defina o diâmetro do ponto em 275 micrômetros e o espaçamento entre pontos em 100 micrômetros. Preencha os demais parâmetros adequadamente para o experimento, garantindo que o layout permita réplicas suficientes. No visualizador de layout resultante, passe o mouse sobre cada característica única de peptídeo na lâmina e insira um identificador de característica na caixa de texto pop-up.Após rotular cada característica única, clique em preencher. Nomeie o layout do lâmina e clique em confirmar sua placa para salvar o layout e gerar um mapa nas localizações físicas de cada característica nas placas de origem. Guiado pelo mapa da placa de origem, carregue um a dois microlitros de cada característica peptídica nos poços designados de uma ou mais placas de 384 poços com volume pequeno, dilua cada característica 10 vezes com tampão de impressão para microarranjo de proteínas 1x, suplementado com 1% de albúmina de soro bovino e cinco microgramas por microlitro de biotina marcada com fluoresceína.Em seguida, centrifugue as placas a 500 x G, em temperatura ambiente, por dois minutos. Depois, esvazie o recipiente de resíduos da impressora de microarranjos. Encha os recipientes do umidificador com solução lavada com água destilada estéril.Insira os parâmetros do lâmina de matriz no software da impressora de microarranjos. Configure o procedimento de lavagem para uma lavagem de um segundo com imersão única, a pós-lavagem para remergulhar os pinos cinco vezes e a umidade para 60%. Em seguida, insira lâminas de vidro revestidas nos platôs de substrato. Carregue os platôs no elevador de platina.Insira as placas de origem nos suportes de placa e carregue os suportes no elevador de placas de origem. Execute o processo de impressão e, em seguida, remova as placas de substrato do instrumento. Bloqueie as lâminas impressas com tampão de bloqueio 1x para microarranjo de proteínas durante 30 minutos sob agitação.Em seguida, lave as lâminas em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,6, à temperatura ambiente, por 10 minutos. Repita a lavagem com um novo lote de PBS. Seque as lâminas por centrifugação durante 30 segundos à temperatura ambiente.Em seguida, pré-aqueça um impressor de cera para microarranjos a 85 graus celsius por 30 minutos, ou até que a cera derreta. Então, insira uma lâmina com o lado impresso voltado para baixo no suporte e alinhe o suporte com o molde do impressor. Coloque o molde em contato com a lâmina e mantenha por dois segundos; em seguida, remova rapidamente a lâmina do suporte e inspecione as bordas de cera para verificar se os arranjos estão adequadamente delimitados.Armazene as lâminas particionadas a quatro graus Celsius, em uma área seca e escura. Para iniciar o procedimento de hibridização, coloque uma lâmina de matriz particionada em um recipiente plástico e cubra a lâmina com tampão de hibridização. Equilibre a lâmina por 30 minutos a quatro graus Celsius, sob agitação em velocidade baixa.Seque a lâmina centrifugando em uma centrífuga para lâminas de microarranjo à temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco microlitros de cada solução de anticorpo contra PTM da histona a pelo menos duas cavidades do arranjo e incube a quatro graus Celsius por uma hora. Após a incubação, remova a solução de anticorpo e lave o arranjo com PBS frio três vezes, por cinco minutos cada, a quatro graus Celsius.Em seguida, incube o arranjo em uma solução de anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente. Por 30 minutos a quatro graus Celsius, na ausência de luz. Lave a lâmina três vezes com PBS frio, como antes.Mergulhe a lâmina em PBS 0,1x à temperatura ambiente para remover o excesso de sal e seque o porta-objetos por meio de uma breve centrifugação à temperatura ambiente. Imagem a lâmina com um escâner de microarranjos com uma resolução de pelo menos 25 mícrons. Para iniciar a análise, utilize um software de processamento de imagens para mesclar os arquivos de canal único provenientes do escâner de microarranjos.Em seguida, abra o Array Ninja e selecione a impressora de microarranjos apropriada na seção do cabeçalho para quantificar imagens. Preencha o nome do mesmo layout de lâmina na caixa de diálogo carregar placa e pressione enter. Carregue o arquivo de imagem mesclada e ajuste o contraste, brilho e ponto médio conforme desejado.Preencha a resolução do escâner de matriz e ajuste as margens superior e laterais para alinhar a grade do layout do lâmina com a imagem. Para analisar um conjunto de poços como réplicas ou realizar outras análises seletivas, preencha as coordenadas dos poços nos campos iPin, jPin e subA e pressione enter. Clique para alternar o zoom e exibir uma imagem ampliada da área sob o cursor.Em seguida, clique em buscar ponto e aguarde a conclusão do processo. Repita a função de busca conforme necessário para centralizar os círculos da grade nos pontos do arranjo. Pontos de referência podem ser selecionados pressionando a tecla R, e pontos que mostram detritos ou morfologia amplamente distinta podem ser desativados pressionando a tecla A enquanto passa o cursor sobre o ponto.Após a seleção dos pontos de referência de fundo e a desativação dos pontos com morfologia de poros ou contaminação, clique em preencher, seguido por enviar para realizar a quantificação. Um gráfico de barras e uma tabela serão exibidos em uma nova página. As especificidades de ligação de dois anticorpos PTM de histonas foram avaliadas utilizando este método.Observou-se que um anticorpo contra uma PTM de histona projetado para direcionar a lisina 9 trimetilada na histona H3 também se ligava a outros três grupos de lisina trimetilados. Observou-se que a sililação de resíduos de lisina vizinhos influenciava positivamente o direcionamento da lisina 9 na H3. Um anticorpo contra uma PTM de histona que direciona a lisina 4 trimetilada na histona H3 foi encontrado para interagir também com a lisina 4 simplesmente metilada e dimetilada na H3. A fosforilação das três alaninas vizinhas à sexta posição foi observada para impactar negativamente a ligação na lisina 4 neste ensaio.Este protocolo tem sido utilizado para triar muitos dos anticorpos contra histonas mais amplamente utilizados e disponíveis comercialmente, e os dados gerados a partir desses experimentos estão livremente acessíveis por meio do banco de dados de especificidade de anticorpos contra histonas. Variações deste protocolo foram descritas anteriormente para a análise de leitores, escritores e apagadores de histonas, adaptando esta plataforma para que sua utilidade além da pesquisa em epigenética possa ser facilmente estendida a qualquer biblioteca de interesse. Várias plataformas de microarranjos de peptídeos de histonas estão disponíveis comercialmente para usuários que não têm acesso ao equipamento especializado necessário para sintetizar peptídeos e fabricar matrizes.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

A triagem de matriz de peptídeos é um ensaio de alto rendimento para identificar locais de interação proteína-proteína. Isso permite mapear várias interações de uma proteína-alvo e pode servir como um método para identificar locais para inibidores que têm como alvo uma proteína. Aqui descrevemos um protocolo para triagem e análise de matrizes de peptídeos.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Métodos para mapear interações proteína-DNA in vivo estão se tornando cruciais para todos os aspectos da pesquisa genômica, mas são trabalhosos, caros e demorados. Aqui, é apresentado um sistema robótico de manuseio de líquidos disponível comercialmente que automatiza a imunoprecipitação da cromatina para mapear interações proteína-DNA in vivo com quantidades limitadas de células.

Automatizando Experiments chip-seq para gerar perfis epigenéticos em 10.000 células HeLa

As matrizes de peptídeos sintetizadas pelo método SPOT podem ser usadas para analisar a especificidade do substrato das proteínas lisina metiltransferases (PKMTs) e para definir o espectro de substrato das PKMTs para entender seu papel biológico. Este protocolo descreve como sintetizar matrizes de peptídeos, metilá-las com PKMTs e analisar os resultados.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

Aqui, apresentamos um protocolo para a purificação dos complexos de peptídeos classe I e CLASSE II da classe I, fornecendo dados de imunopeptidomias de alta qualidade. O protocolo se concentra na preparação da amostra usando anticorpos disponíveis comercialmente.

Imunopeptidomics: Isolamento de Peptídeos MHS de classe I e II associados para análise de espectrometria de massa

Variantes genéticas no Membro da Família Spindlina 4 (SPIN4) humano foram recentemente identificadas em pacientes com crescimento ósseo, um novo distúrbio do desenvolvimento. Um protocolo e novos resultados descrevendo a identificação bioquímica de histonas modificadas no contexto de nucleossomos como substratos de ligação ao SPIN4 são apresentados.

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

Aprenda a analisar a especificidade de anticorpos contra histonas usando microarrays de peptídeos. Este método permite gerar perfis detalhados de reconhecimento de modificações pós-traducionais em pesquisa de bioquímica de cromatina.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

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