Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

O objetivo geral deste procedimento é obter uma população pura de mioblastos humanos do músculo esquelético adulto. Essas células são usadas para estudos funcionais, como avaliação da diferenciação miogênica e medição da entrada de cálcio operada por armazenamento. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um isolamento rápido, simples e reprodutível de mioblastos primários humanos.

Esses mioblastos são o novo ex-vivo para estudar a sinalização de cálcio durante a regeneração muscular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo muscular, como identificar os canais iônicos e os fatores de transcrição envolvidos durante a diferenciação muscular. Pois este método pode fornecer informações sobre as funções gênicas durante a diferenciação miogênica humana.

Também pode ser aplicado a outros estudos, como potencial para o uso de células-tronco miogênicas para tratar distrofias musculares. Transfira a amostra de músculo para uma placa estéril de seis centímetros, lave a amostra com PBS duas vezes. Remover o tecido adiposo restante e pesar a amostra.

Em seguida, adicione tripsina e pique o músculo em pedaços menores que dois milímetros de tamanho. Depois de picado, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir o tecido para um frasco de dissociação de 200 mililitros contendo uma barra de agitação e, em seguida, continue coletando o tecido picado em solução de tripsina até que o frasco de dissociação esteja cheio a 90 mililitros. Agora, incube o tecido em banho-maria a 37 graus Celsius por 60 minutos com agitação suave.

Após uma hora, adicione 10 mililitros de FCS para interromper a reação e homogeneizar a mistura usando trituração. Agora, carregue filtros de 70 mícrons em dois tubos de 50 mililitros e passe metade da suspensão celular por cada filtro, pipetando a suspensão nos filtros. Em seguida, faça uma suspensão das células em meio de crescimento e coloque 200.000 células em placas de seis centímetros com quatro mililitros de meio.

Incubar as placas, trocando o meio a cada três dias. Após cinco a sete dias, as células devem estar 70% a 80% confluentes e, em seguida, corá-las. Para começar, enxágue a placa de células confluentes com PBS.

Em seguida, adicione um mililitro de solução de tripsina e deixe a enzima agir por três minutos. Pare a reação adicionando dois mililitros de meio e colete as células em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, gire as células para baixo e ressuspenda-as em um mililitro de meio.

Em seguida, faça uma contagem de células enquanto armazena as células no gelo. Para a análise dos fatos, carregue sete tubos com 100.000 células cada. Coloque as células restantes em um oitavo tubo para classificação.

Lave as células com um mililitro de tampão de fax frio e, em seguida, centrifugue os tubos e aspire e descarte o sobrenadante. Adicione de volta 200 microlitros de tampão de fax com os anticorpos apropriados e deixe as células incubarem no gelo por 30 minutos. Após 30 minutos, lave as células novamente e ressuspenda-as em 500 microlitros de tampão de fax e, em seguida, classifique as células usando um citômetro de fluxo.

Depois de excluir as células hematopoiéticas CD45 positivas, separe as células CD45 negativas com base na expressão de CD56. Em seguida, bloqueie a população CD56 positiva para CD34, CD144 e CD146. Reanalise uma fração da população classificada para verificar a pureza.

Agora, puxe os mioblastos humanos e lave-os com cinco mililitros de meio. Em seguida, suspenda-os novamente em um mililitro de meio. Transfira a suspensão para uma placa de seis centímetros com quatro mililitros de meio e incube a placa a 37 graus Celsius com 7% de dióxido de carbono.

Para este procedimento, cultive mioblastos e faça um novo meio de transvecção. Incube o meio em temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Durante a incubação média, prepare os mioblastos.

Primeiro, enxágue-os uma vez com PBS. Em seguida, tripsinize as células aderentes. Pare a reação adicionando dois mililitros de meio.

Em seguida, colete as células em um tubo de 50 mililitros. Gire-os para baixo e suspenda-os novamente em um mililitro de meio. Para cada transvecção, prepare 500.000 células em 200 microlitros de meio.

Para cada 500 microlitros de meio de transvecção, adicione uma alíquota de 200 microlitros de células e misture usando apenas duas passagens da pistola de pipeta. Em seguida, deixe as reações prosseguirem por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, transfira as reações para placas de cultura de 3,5 centímetros, cada uma contendo uma lamínula de vidro.

Em seguida, adicione 1,3 mililitros de meio para um volume final de dois mililitros e incube os pratos. Após 48 horas de diferenciação, as células podem ser imunomarcadas ou analisadas usando imagens de cálcio. Para qualquer uma das opções, primeiro lave cuidadosamente as células duas vezes usando um mililitro de PBS em temperatura ambiente para lavar.

Tente evitar o descolamento dos miotubos. Para uma imagem de cálcio, cubra as células lavadas com dois micromolares fura-2 AM mais um ácido treônico micromolar em meio contendo cálcio. Em seguida, deixe-os incubar por cerca de 30 minutos antes de misturar.

Em seguida, lave as células duas vezes com meio contendo cálcio não modificado e, em seguida, incube-as por 10 a 15 minutos para a esterificação. Agora, remova a lamínula de uma placa de cultura e instale-a na câmara experimental. Carregue a câmara com meio contendo cálcio, coloque-a sob um microscópio e, em seguida, inicie o registro de dados.

O Fura-2 é animado alternadamente em 340 e 380 nanômetros. A luz de emissão é coletada em 510 nanômetros. Mergulhando as imagens de nanômetros de 340 nanômetros pelas imagens de 380, fornece as proporções de imagem, pois as flutuações e a concentração de cálcio são relativamente baixas, adquirem uma proporção de imagem a cada dois segundos.

Após dois ou três minutos, substitua o meio por meio livre de cálcio. Em seguida, por um ou dois minutos, monitore a atividade do cálcio armazenado nas células. Em seguida, adicione uma tapsigargina micromolar às células para esgotar seus estoques internos de cálcio.

Aguarde de oito a 10 minutos e, em seguida, substitua rapidamente o meio pelo meio contendo cálcio e registre por cinco minutos enquanto o cálcio entra nas células pelos canais de sucesso. Depois de terminar o experimento, analise as imagens. Selecione uma área onde não haja células para a região um, que define o plano de fundo e, em seguida, selecione uma área no citoplasma para a região dois.

As duas regiões podem ser desenhadas em qualquer uma das imagens da série. Em seguida, vá para a guia de experimentos de execução e selecione imagens de referência para os canais 340 e 380, selecione a região um e clique em subtrair plano de fundo. Agora, execute todo o experimento para remover o plano de fundo de todas as imagens.

Depois de concluído, clique na opção de dados de log para abrir uma planilha na qual os dados de tempo e proporção são registrados. As células musculares foram cultivadas, expandidas e classificadas usando fax. Os mioblastos representaram mais de 60% da população analisada.

Os mioblastos humanos primários foram então cultivados em meio de diferenciação e imunomarcados para o fator de transcrição de MEF2 e proteínas de cadeia pesada de miosina. A maioria das células expressou cadeia pesada de miosina e formou miotubos com valores de índice de fusão de cerca de 60% - os outros 40% das células permaneceram células mononucleadas indiferenciadas, também conhecidas como células de reserva. O experimento de entrada de cálcio operado por armazenamento descrito foi realizado com sucesso nas células diferenciadas.

A realização do mesmo experimento em células transvectivadas com pequeno RNA interferente, direcionado contra canais permeáveis ao cálcio da família TRPC, mostra que o knockdown teve um impacto mensurável na entrada de cálcio operada pelo armazenamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar mioblastos humanos do músculo esquelético adulto. Usamos essas células para estudar as etapas sucessivas de diferenciação muscular e, em particular, a desativação dos fatores de transcrição e dos canais de cálcio.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de três horas se for executada corretamente. É um método rápido, simples e reprodutível que obtém o rendimento dos mioblastos humanos. Ao tentar este procedimento, é importante evitar que as culturas de mioblastos atinjam total confiança, pois haverá diferenciação espontânea indesejada.