Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

O objetivo geral deste procedimento é estudar a fosforilação da tau, as capacidades de ligação dos microtúbulos da tau e a localização da tau, usando microscopia confocal em células de câncer colorretal. Este método pode ser eficaz para a maioria dos campos de pesquisa biológica, especialmente a pesquisa de câncer e demência, onde a fosforilação e a ligação aos microtúbulos são fatores importantes. A principal vantagem do ensaio de fosforatase apresentado é que ele fornece uma maneira fácil de perceber toda a fosforilação de amostras de proteínas.

A principal vantagem do ensaio de ligação aos microtúbulos é que é um procedimento simples para separar as proteínas de ligação aos microtúbulos das frações não ligantes. No entanto, os principais benefícios da técnica de localização tau é que ela requer uma quantidade relativamente pequena de anticorpos primários e secundários. Para iniciar este procedimento, prepare todos os reagentes conforme descrito no protocolo de texto.

Transfira aproximadamente um milhão de células HCT 116 para placas de cultura contendo meio essencial mínimo suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de estreptomicina de penicilina. Quando as células atingirem 65% de confluência, use um aspirador para remover o meio suplementado com FBS. Em seguida, adicione MEM sem soro, contendo curcumina ou cloreto de lítio.

Incube a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Depois disso, lave as células com 10 mililitros de PBS gelado. Adicione um mililitro de PBS gelado e, em seguida, use um raspador de células para raspar as células e transferi-las para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.

Centrifugue por quatro minutos a 1800 vezes G e quatro graus Celsius. Suspendemos os grânulos celulares em 100 microlitros de tampão RIPA completo a quatro graus Celsius por 20 minutos, certificando-nos de bater nos tubos regularmente para lisar as células. Em seguida, sonice brevemente as amostras a uma amplitude de 10% pulsando por 0,2 segundos e desligando por 0,2 segundos, por um total de 2 segundos.

Centrifugue o homogeneizado da célula a 22.570 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos. Transfira os sobrenadantes para novos tubos marcados e, em seguida, meça a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford, conforme descrito no protocolo de texto. Depois de preparar amostras contendo 20 microgramas de proteína total, adicione dois microlitros de tampão fosfatase alcalina e 10 microlitros de fosfatase alcalina a cada um.

Em seguida, adicione água destilada, de modo que o volume final de cada amostra seja de 20 microlitros. Incube as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto as amostras incubam, prepare amostras adicionais na mesma concentração, mas sem fosfatase para comparação.

Após uma hora, interromper a reação adicionando EDTA a uma concentração final de 50 milimolares ou ortovanadato de sódio a uma concentração final de 10 milimolares. Adicione o tampão de carregamento de gel 4XSDS recém-preparado contendo 400 DTT milimolar. Usando um bloco de calor, incube as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos.

Vortex as amostras e deixe-as esfriar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Em seguida, carregue 13 microlitros de amostra por poço, bem como a escada pesada molecular em um gel de poliacrilamida a 10%. Conecte o sistema de eletroforese a uma fonte de alimentação e ajuste a tensão para 70 volts por 20 minutos para mover as amostras de proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução.

Depois disso, aumente para 125 volts e deixe o gel funcionar por aproximadamente 70 a 120 minutos até que as amostras e a escada de proteínas cheguem ao final do gel. Usando um sistema de eletroblotting úmido, transfira o gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno a 100 volts por cerca de 100 minutos. Em seguida, incube a membrana para enxugar em albumina de soro bovino a 4% por 90 minutos em temperatura ambiente.

Incube o blot durante a noite em solução de anticorpo primário a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave o borrão três vezes em PBST, lavando por sete minutos de cada vez. Incubar na solução de anticorpos secundários incertos durante 90 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, lave com PBST quatro vezes, com cada lavagem durando sete minutos. Desenvolva o blot, usando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante. Cubra a mancha revelada com filme plástico transparente e, em seguida, adquira imagens de quimioluminescência da mancha com um sistema de imagem de quimioluminescência disponível comercialmente.

Depois de preparar amostras frescas, incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Ultracentrifugar as amostras a 100 000 vezes G e 25 graus Celsius durante 60 minutos. Em seguida, transfira 120 microlitros de cada sobrenadante contendo tau não ligado para tubos separados, limpos e rotulados.

Adicione 120 microlitros de tampão de amostra Fibic ao pellet que contém tau ligado. Depois de misturar bem, por vórtice e pipetagem, transfira a mistura para tubos limpos e rotulados. Depois de preparar amostras de concentração de proteína equivalente, adicione tampão de carregamento de gel 4XSDS fresco contendo 400 DTT milimolar.

Use um bloco de calor para incubar as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Vortex as amostras e deixe-as esfriar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Carregue 13 microlitros de amostra por poço e a escada de peso molecular em um gel de poliacrilamida a 10%.

Conecte os eletrodos positivo e negativo do sistema de eletroforese a uma fonte de alimentação e, em seguida, ajuste a tensão para 70 volts por 20 minutos. Depois disso, aumente para 125 volts e deixe o gel funcionar por aproximadamente 70 a 120 minutos até que as amostras e a escada de proteínas cheguem ao final do gel. Use um sistema de eletroblotting úmido para transferir o gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno a 100 volts por cerca de 100 minutos.

Incube a membrana para secar em albumina de soro bovino a 4% por 90 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, incube durante a noite em solução primária de anticorpos a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave o borrão quatro vezes com PBST, com cada lavagem durando sete minutos.

Incubar a mancha lavada na solução de anticorpos secundários pertinente durante 90 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave com PBST por sete minutos, repetindo a lavagem um total de quatro vezes. Revele o borrão, usando um kit de quimioluminescência.

Cubra com filme plástico transparente e adquira imagens usando um sistema de imagem por quimioluminescência. Para começar, coloque as lamínulas nos poços de uma placa de cobertura de tecido de seis poços e, em seguida, semeie 250.000 células em cada poço no meio de cultura recomendado. Após 24 horas, enxágue as células duas vezes com PBS.

Adicione MEM sem soro, contendo curcumina e incube a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Depois disso, lave as células com PBS gelado novamente. Fixe as células em 3,7% de formaldeído em uma incubadora de 37 graus Celsius, no escuro.

Lave as células com PBS e, em seguida, fixe-as em metanol gelado a 20 graus Celsius por 15 minutos. Depois disso, incube as células no gelo em 3% BSA e 0,1% Triconex 100 em PBS por 10 minutos. Lave as células com PBS e incube em tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 60 microlitros de solução de anticorpo primário ao pedaço de fluoreto de polivinilideno cortado em cada poço. Colocar as lamínulas de forma que as células entrem em contato com a solução de anticorpos. Incube durante a noite a 4 graus Celsius em uma câmara escura e úmida.

No dia seguinte, lave as células quatro vezes com PBS. Adicione 80 microlitros da solução de anticorpo secundário a cada uma das peças de fluoreto de polivinilideno, colocando as lamínulas de forma que as células entrem em contato com a solução de anticorpos. Incubar em câmara escura e úmida em temperatura ambiente por duas horas.

Depois disso, lave as células quatro vezes com PBS. Monte as amostras no meio de montagem com DAPI e, em seguida, fixe as lamínulas nas lâminas de vidro. Em seguida, incube em uma câmara escura em temperatura ambiente por uma hora e meia.

Usando um microscópio confocal, examine as lâminas. Neste estudo, a fosforilação de tau específica da cite é avaliada usando um anticorpo fosfo-tau. As células tratadas com curcumina expressam diminuição da tau à medida que a concentração de curcumina aumenta.

A expressão de fosfo-tau, por outro lado, aumenta em concentrações mais baixas de curcumina, diminuindo apenas em concentrações muito altas. As células tratadas com cloreto de lítio são então examinadas. Como pode ser visto, a expressão de tau e fosfo-tau é significativamente diminuída sob tratamento com cloreto de lítio.

A fosforilação geral é então avaliada pelo ensaio de fosfatase. Observa-se que a tau migra mais rapidamente em amostras tratadas com fosfatase em comparação com a amostra de controle não tratada, indicando que a amostra de controle é fosforilada. As amostras de células tratadas com curcumina mostraram resultados muito semelhantes, indicando que as linhagens celulares de câncer colorretal de tratamento não reduziram a fosforilação da tau.

Ambas as amostras tratadas com fosfatase e não tratadas eletroforizaram quase a mesma faixa em amostras de células tratadas com cloreto de lítio, indicando uma redução na fosforilação da tau. Em seguida, o ensaio de ligação microtubular de amostras de células é estabelecido com sucesso usando tau 352 como controle positivo. Como mostrado aqui, tanto a curcumina quanto a baixa concentração de cloreto de lítio resultam em atividade inibida de ligação aos microtúbulos.

A microscopia confocal é então realizada. Após o tratamento com curcumina, a tau é translocada para o núcleo. Isso apóia estudos anteriores, relatando que a tau nuclear é um jogador-chave na proteção do DNA neuronal.

Depois de ver este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de fosfatase para determinar toda a fosforilação de amostras de proteínas e como realizar um ensaio de ligação de microtúbulos. Você deve ser capaz de descobrir como executar um ensaio de imunofluorescência por microscopia confocal usando várias quantidades menores de anticorpos. Os procedimentos apresentados aqui são econômicos e potencialmente ajudarão na descoberta e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para tratar diferentes tau-foses e cânceres.