Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método para garantir meios simplificados de carbogenação de ACSF de reciclagem de pequenos volumes e obter registros de longo prazo de potenciais de campo usando uma câmara de registro montada em um microscópio de fluorescência. Este método pode nos ajudar a responder às questões-chave no campo das neuroplasticidades relacionadas às vias subjacentes da lignina que regulam a transmissão sináptica e a formação da memória em um modo celular de aprendizagem e memórias. A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a estabilizar o nível de oxigênio de um pequeno reservatório biológico para aumentar a eficiência de custo dos experimentos usando antagonistas ou agonistas específicos.

A preparação das fatias agudas do hipocampo é demonstrada pelos alunos de doutorado, Xia e Weiguang do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, use uma lâmina cirúrgica fria para dissecar um pedaço do córtex dorsal em um ângulo de 70 graus ao longo da borda dorsal de cada hemisfério. Com uma espátula de cimento dental frio, transfira cada hemisfério para um pedaço de papel de filtro para secar brevemente a superfície.

Monte os dois hemisférios com superfícies recém-cortadas na plataforma de corte gelada usando cola adesiva de ação rápida para que a extremidade caudal dos hemisférios fique voltada para a lâmina de barbear. Em seguida, coloque a plataforma de corte na câmara de resfriamento de um vibratome. Encha a câmara com o tampão de corte a dois a quatro graus Celsius e carbogene-o.

Depois disso, corte fatias de 350 micrômetros usando configurações de vibrotoma adequadas. Isole a formação hipocampal do subículo e dos córtices entorrinais usando duas cânulas de injeção como tesoura. Remover as bolhas da malha de fixação de fatias da câmara de incubação previamente preparada com uma pipeta de pasteur.

Em seguida, transfira as fatias que têm alguma transparência no estrato piramidal da plataforma de corte na malha da câmara de incubação com uma pipeta pasteur de boca grande. Nesta etapa, adicione um conector de tubo de três vias à saída do sistema de reciclagem. Conecte o braço do meio do conector do tubo de três vias a um tubo de alimentação de carbogênio e regule a vazão com um medidor de fluxo de ar.

Depois disso, adicione um segundo conector de tubo de três vias à entrada do sistema de reciclagem. Conecte o braço do meio ao tubo voltado para o aquecedor em linha, o braço superior a um tubo de silicone fino e o braço inferior ao tubo de entrada do reservatório. Em seguida, coloque um espremedor de tubos em um tubo fino de silicone em uma posição ao longo do tubo onde a pulsação do ACSF na câmara de fatia gerada pela bomba periistólica seja mínima.

Agora, mergulhe um pequeno pedaço de papel de limpeza de lentes e uma malha de náilon fixada em um fio de platina em forma de U na câmara de submersão por alguns minutos. Depois disso, remova o fio de platina em forma de U. Desligue a reciclagem e coloque uma fatia no papel de limpeza das lentes.

Em seguida, coloque imediatamente a malha de suporte da fatia em cima da fatia. Ligue a bomba e deixe a fatia equilibrar por 30 minutos sem mergulhar a objetiva no ACSF. Enquanto isso, encha o eletrodo de gravação com ACSF e monte-o no porta-pipeta.

Verifique o isolamento do eletrodo de estimulação de metal colocando-o em solução de bicarbonato de sódio. Conecte o eletrodo ao pólo negativo de um gerador de tensão CC e observe a formação de bolhas na ponta sob um microscópio de dissecação. Em seguida, coloque o eletrodo de estimulação de tungstênio isolado com apoxi testado no suporte do manipulador e o fio de referência na câmara de fatia.

Adicione um segundo eletrodo de referência à câmara e conecte-o ao soquete de referência do estágio principal do eletrodo de registro. No software de controle do amplificador, clique na caixa de modo zero clamp e, em seguida, clique duas vezes na caixa de listagem de ganho de saída. Escolha um ganho de 100, clique duas vezes no vaso da caixa de filtro passa-altas, escolha três kilohertz e clique duas vezes na caixa de listagem do filtro passa-baixo AC para escolher 0,1 hertz.

No software de gravação, clique em adquirir, abra o protocolo. Escolha um protocolo que tenha as configurações que permitem estímulos episódicos e a digitalização de potenciais amplificados a 10 a 20 kilohertz por 50 a 100 milissegundos e que acione automaticamente um isolador de estímulo 10 milissegundos após o início de uma gravação episódica. Coloque os eletrodos de estimulação e registro alinhados e paralelos ao estrato piramidal.

Em seguida, clique em adquirir, editar protocolo e escolha a guia de gatilho na janela pop-up. Clique na caixa de origem do gatilho e escolha a barra de espaço como a fonte do gatilho. Em seguida, clique no botão OK e clique no botão de gravação para iniciar a aquisição.

No software isolador de estímulo, clique na caixa de controle de tensão e digite zero. Clique no botão de download. Em seguida, clique na janela do software de gravação e pressione a barra de espaço.

Repita esse ciclo inserindo sequencialmente valores de 1000 a 8000. Correlacione a força de estimulação com os valores de inclinação do FEPSP e determine a força de estimulação necessária para obter 40% do máximo de inclinação do FEPSP. Clique na caixa de controle de tensão e insira o valor determinado.

Em seguida, clique no botão de download. No software de gravação, clique no botão Parar e, em seguida, no menu Adquirir. Clique em editar protocolo e escolha a guia de gatilho na janela pop-up.

Depois, clique na caixa de fonte do gatilho e escolha o temporizador interno como fonte do gatilho. Clique no botão ok, seguido do botão de gravação que inicia a gravação automática de potenciais de campo a cada 60 segundos. Clique no botão Parar após 30 a 60 minutos.

No software de gravação, clique em adquirir, abrir protocolo e escolha o mesmo protocolo da gravação de linha de base. Clique no botão OK e, em seguida, clique em gravar. Continue executando automaticamente as gravações de potencial de campo por duas a quatro horas.

Quando terminar, clique no botão Parar para encerrar a gravação. Esta figura mostra os registros representativos da potenciação dependente da atividade da transmissão sináptica usando carbogenação de fluxo de saída e carbogenação de reservatório com a reciclagem de um pequeno reservatório ACSF. A potenciação foi induzida após o ponto zero no tempo por três vezes 100 hertz por segundo em trens.

Esta figura mostra que a carbogenação de saída com reciclagem de um pequeno reservatório de ACSF melhorou a indução de LTD em comparação com experimentos com carbogenação de reservatório apenas. Uma vez dominada, a preparação da fatia pode ser feita em cinco a 10 minutos e uma gravação de potencial de campo estável também pode ser alcançada por muitas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ajustar seu nível de carbogenação, velocidade de perfusão, a posição dos eletrodos e a tensão de estimulação de sua equivalência específica.

Após este procedimento, outro método como o patch clamp, a microscopia forense pode ser realizada para responder a questões adicionais, como a virilização da localização celular da seiva das sondagens de ravina em resposta à indução de plasticidade sináptica dependente da atividade. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da neuroplasticidade explorarem a plasticidade sináptica dependente da atividade como um modo celular de aprendizado e memória em fatias de hipocampo in vitro de genes de camundongos transgênicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a preparação de cortes agudos do hipocampo temporal e como obter condições estáveis para o registro de longo prazo de transmissões sinápticas usando um pequeno volume de ACSF reciclado.

Não se esqueça de que trabalhar com animais e compostos químicos pode ser perigoso e precauções como o uso de luvas e a desinfecção adequada devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.