Melhorar a aplicação de alto Peso Molecular Biotinylated dextrano amina para projeção Thalamocortical rastreamento em ratos

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar um protocolo refinado para a aplicação de BDA de alto peso molecular para estudar a marcação neural ideal no sistema nervoso central. Essa medida pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de redes neurais. Visualizando a estrutura do quadro de rotulagem neural por meio de circuitos neurais.

A principal vantagem desta técnica é que ela oferece a oportunidade de iniciar um circuito neural local e suas características químicas. Preparar uma microsseringa de microlitros, equipada com uma micropipeta de vidro, e testá-la através da elaboração de parafina líquida. Depois de anestesiar o rato usando um protocolo aprovado, confirme a anestesia profunda pela ausência de reação a um beliscão da cauda.

Em seguida, raspe o topo da cabeça do animal com um barbeador elétrico e esfregue o local da cirurgia com iodo de povidona a 10%, seguido de etanol a 70%. Prenda o rato no dispositivo estereotáxico inserindo barras de orelha rombas nas orelhas e colocando os incisivos superiores do rato no suporte bucal. Aplique uma pomada oftálmica nos olhos.

Use luvas e cortinas cirúrgicas estéreis para manter as condições estéreis. Limpe a pele da cabeça do local da cirurgia novamente usando etanol 70%. Depois de fazer uma incisão sagital na pele com um bisturi, ao longo da sutura sagital, use aplicadores estéreis com ponta de algodão para raspar o músculo e o periósteo do crânio.

Usando coordenadas predefinidas de um atlas, determine a localização da craniotomia. Realize uma craniotomia usando uma broca de rebarbas com uma broca de ponta redonda para perfurar até cerca de um milímetro de profundidade até que as meninges sejam visíveis. Extirpar a dura-máter usando microfórceps para expor o córtex cerebral sobre o local da injeção.

Expulse a parafina líquida da microsseringa e, em seguida, retire a solução de BDA a 10%. Monte a seringa no aparelho de microinjeção e conecte a microbomba. Sob um estereomicroscópio, manipule o aparelho de microinjeção.

Insira a micropipeta de vidro preenchida no VPM através da superfície cortical do cérebro, a uma profundidade de 5,8 milímetros. Em seguida, use a microbomba para injetar sob pressão 100 nanolitros de 10% BDA no VPM, durante um período de três minutos. Após cinco minutos, retire lentamente a pipeta.

Suturar a ferida com fio estéril e, em seguida, colocar o rato em uma área de recuperação quente, até que ele recupere a consciência e esteja totalmente recuperado. Depois de sacrificar o rato, use uma tesoura e uma pinça para abrir a cavidade torácica do rato e acessar o coração. Insira um cateter intravenoso no ventrículo esquerdo, em direção à aorta, e abra a aurícula direita.

Primeiro, perfunda com solução salina a 0,9% em temperatura fisiológica, por cerca de um a dois minutos, até que o sangue que sai do coração esteja limpo. E então continue com 250 a 300 mililitros de 4% de paraformaldeído, em tampão fosfato 0,1 molar. Pós-fixar o cérebro dissecado em 4% de paraformaldeído por duas horas em temperatura ambiente.

Em seguida, transfira o cérebro para 30% de sacarose em PBS 0,1 molar e crioproteja por três dias a quatro graus Celsius. Após três dias, quando o cérebro tiver afundado na solução, divida o cérebro em três blocos na direção coronal com o auxílio de uma matriz cerebral. O bloco central contém o núcleo posteromedial ventral do tálamo no córtex somatossensorial primário.

Monte o bloco central do cérebro no estágio de congelamento do micrótomo deslizante para seccionamento no plano coronal e corte a 40 mícrons quando congelado. Colete as seções em um prato de seis poços, contendo 0,1 molar PBS. Comece a coloração enxaguando as seções em PBS 0,1 molar por cerca de um minuto com balanço.

Em seguida, transfira as seções para uma solução mista de estreptavidina-AF594 em coloração de Nissl fluorescente verde AF500 / 525 em PBS 0,1 molar contendo 0,3% Triton X-100 e incube por duas horas em temperatura ambiente. Após a coloração, lave as seções três vezes em 0,1 molar PB com balanço. Monte as seções nas lâminas do microscópio usando técnicas histoquímicas padrão.

Seque as seções ao ar por cerca de uma hora. Aplique 50% de glicerina em água destilada nas seções torescentes e na lamínula antes de fazer a imagem das lâminas. Esta fotomicrografia representativa mostra o local da injeção de BDA em vermelho do núcleo posteromedial ventral do tálamo no fundo da coloração verde de Nissl.

A marcação de BDA torescente é mostrada aqui, incluindo axônios de corticol talâmico na camada quatro e neurônios talâmicos corticais nas camadas cinco e seis. Para comparação, esta fotomicrografia demonstra que a marcação convencional de BDA com um procedimento padrão de avidina-biotina peroxidase revela um padrão semelhante de marcação neural à marcação de BDA torescente. Esta visão de maior ampliação de uma seção marcada com BDA torescente mostra as árvores axonais marcadas anterógradas em detalhes, em vermelho.

O corpo celular neuronal rotulado retrógradamente, dendritos e espinhas dendríticas são mostrados em detalhes aqui. Uma vez dominadas, a craniotomia e a injeção estereotáxica podem ser feitas em 20 a 30 minutos, se forem realizadas corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar BDA de alto peso molecular para reviver conexões neuronais e estrutura detalhada de marcação neural.