UMA

O objetivo geral deste ensaio de aversão ao cobre baseado no estado nutricional é avaliar a resposta do nematódeo a um produto químico aversivo e uma fonte de alimento durante um período de quatro horas. Isso permite a avaliação simultânea do estado nutricional. Este método pode auxiliar o campo da neurociência comportamental identificando mutantes que falham em modular padrões locomotores e resposta a um produto químico aversivo apesar das condições de fome.

A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser conduzida por um período prolongado, o que permite a análise do estado nutricional à medida que os vermes ficam progressivamente mais famintos ao longo de quatro horas. Para preparar os organismos experimentais para o ensaio, escolha 10 nematódeos no estágio L4 por corrente, 24 horas antes de iniciar o ensaio, para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada nematódeo mutante ou controle testado, escolha 10 L4s.

Mantenha os organismos L4, usando métodos padrão por 24 horas em placas de ágar padrão semeadas com OP50 E.Coli. 24 horas antes do ensaio, use uma régua e um marcador permanente grosso para desenhar uma linha na parte inferior de uma placa de meio de crescimento de nematódeos preparada anteriormente ou NGM ao longo da borda externa. Marque uma barreira de linha média equidistante de cada borda da placa.

Semente a placa com 50 microlitros de OP50 E.Coli apenas em um lado da barreira de cobre para criar um gramado uniforme. Use as linhas marcadas na parte inferior da placa para garantir que as bactérias não entrem em contato com a solução de cobre. Certifique-se de que a solução de cobre alinhe a borda da placa e forme uma barreira na linha média e transfira as bactérias para que a solução de cobre não entre em contato com a fonte de alimento.

Marque um segundo conjunto de placas sem OP50 E.Coli, para servir como controle negativo. Deixe as bactérias secarem e, em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Certifique-se de que as manchas de bactérias não sejam perturbadas ao transferir os nematódeos para um incubado a 37 graus Celsius.

A perturbação excessiva pode alterar a localização ou a forma do manto alimentar. Após a incubação noturna, retire as placas do incubado e, usando o lado inferior marcado da placa como guia, pipete 100 microlitros de solução de sulfato de cobre (II) 0,5 molar fresco na borda do ágar, para criar uma barreira externa de cobre. Pipete 25 microlitros da solução de sulfato de cobre (II) para criar uma barreira na linha média.

Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre (II) não entre em contato com a mancha de bactérias e deixe a solução de cobre secar na placa. Verifique a secagem a cada cinco minutos após a transferência, com um tecido de laboratório, pressionando levemente a solução perto da borda da placa para discernir. Imediatamente antes do ensaio, transfira os organismos experimentais para uma placa de ágar sem bactérias e permita que os nematódeos se movam livremente por um minuto para remover o excesso de bactérias.

Em seguida, pipete um mililitro de M9 na placa com adultos jovens, que foram transferidos 24 horas antes, a fim de lavar os vermes em um tubo de microcentrífuga. Centrífuga os nematódeos a 3.000 x G por um minuto. Os vermes devem formar um sedimento na parte inferior do tubo.

Aspire a solução M9 sem perturbar o sedimento de vermes. Adicione um mililitro de solução M9 ao sedimento de vermes. Inverter o tubo para misturar os vermes com a solução.

Se excesso de bactérias for transferido inicialmente com os vermes, repita um total de cinco vezes. Após a última lavagem, aspire o sobrenadante até que restem 100 microlitros de solução M9 e o sedimento de vermes. Transferir imediatamente os vermes da solução assim que as lavagens tiverem sido concluídas.

Pipete 20 microlitros do sedimento de vermes da parte inferior do tubo na metade da placa de ensaio sem bactérias, certifique-se de que 10 vermes sejam transferidos para a placa de ensaio e que não haja alimento contaminado presente. Nenhuma bactéria deve ser transferida para as placas de corrida de alimentos de cobre. Remova o excesso de solução M9 dos nematódeos com um tecido de laboratório dentro de um minuto.

Certifique-se de que a solução M9 não entre em contato com a solução de sulfato de cobre (II) e que os vermes e a superfície do ágar permaneçam intactos. Descarte os vermes que foram acidentalmente removidos com o tecido de laboratório. Uma vez que a solução M9 tenha sido removida e todos os vermes tenham iniciado padrões locomotores não líquidos, ou seja, quando pararem de se debater.

Inicie o cronômetro do ensaio, se vermes extras foram acidentalmente incluídos, remova-os escolhendo com óleo de halocarboneto para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada à placa. Verifique as placas de ensaio a cada 30 minutos. Para as placas de ensaio com manchas de bactérias, pontue positivamente os organismos se eles alcançarem a mancha de alimentos durante um período de quatro horas.

Para as placas de controle negativo, pontue positivamente os organismos se eles tiverem cruzado a barreira. Utilizamos o mutante de perda de função N2 e npr-9 e uma linha de superexpressão npr-9, referida como ganho de função npr-9, para avaliar as respostas à fome e à aversão ao cobre. No final do ensaio, 100% dos organismos do tipo selvagem se realocaram para a fonte de alimento, enquanto os organismos de superexpressão npr-9 não modularam padrões locomotores em resposta ao alimento e continuaram a cruzar a barreira aversiva mesmo após entrar em contato com a fonte de alimento.

Em uma placa sem alimentos, os organismos n2 ou npr9 com perda de função raramente cruzavam a barreira de cobre, enquanto os nematódeos com superexpressão npr-9 cruzavam repetidamente a barreira de ida e volta. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar perturbar a barreira de cobre ao transferir nematódeos e M9 e também manter condições consistentes para cada linhagem para evitar fatores de confusão.