Name: Agudo In Vivo Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a realizar gravações eletrofisiológicas agudas in vivo de potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades em ratos anestesiados. Este método permite registrar simultaneamente sinais extracelulares de alvos corticais e subcorticais para estudar a fisiopatologia de doenças neuropsiquiátricas.

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Agradecemos a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, por financiar nosso estudo.

Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal (última revisão em 2014) e regulamentos europeus (2010/63 / UE). As experiências foram aprovadas pela autoridade local de bem-estar animal (LaGeSo, Berlim), e em conformidade com o departamento local e diretrizes internacionais. NOTA: No método apresentado, dois modelos de eletrodos são usados ​​para registrar a partir da via ganglionar cortico-basal hiperdirecional que conecta o córtex motor primário (M1) com o núcleo subtalâmico (STN) e a substância nigra pars reticulada (SNr). Para as gravações de eletrocorticograma peridural (ECoG) dos eletrodos Ag / AgCl personalizados de baixa impedância M1, são usados. As gravações da STN e SNr são realizadas com eletrodos de tungstênio de alta impedância comercialmente disponíveis. 1. Construção de eletrodos epidurais Epidural Ag / AgCl <ol><li> Pegue um aprox. Faixa de 5 cm de comprimento de fio de prata puro de 99,99% com um diameteR de 200 μm e remova qualquer revestimento, se necessário. </li><li> Segure a ponta do fio com a ponta para baixo em uma chama de um isqueiro ou vela até a ponta começar a derreter. Aguarde até que a ponta seja em forma de bola e tenha um diâmetro de aproximadamente 1 mm. Corte o eletrodo pré-formado até um comprimento total de 15 mm desde o início da ponta em forma de bola até a extremidade do fio. </li><li> Solde um conector de precisão para a extremidade do fio, que se adapta ao sistema de gravação eletrofisiológico usado. Cubra o ponto de soldagem da extremidade do fio ao conector com verniz de prata condutor. Isso ajuda a condutividade e resulta em uma melhor qualidade de sinal. </li><li> Após o verniz condutor ter secado, cubra o ponto de soldagem com um tubo termoretrante de 3 mm a 1 mm. Use cuidadosamente o martelo de um relojoeiro para aplainar a ponta em forma de bola para metade da espessura. </li><li> Coloque as luvas de exame e tome um pano de limpeza sem fiapos com 100% de etanol para remover qualquer sujeira e graxa. </li><li> Coloque os eletrodos emUm tubo de centrifugação de 15 mL ou um tubo de cultura de células e preenchê-lo com cloro de cloro doméstico (CUIDADO: contendo 2,8 g de hipoclorídio de sódio por 100 g de solvente) até a ponta em forma de bola estar totalmente coberta. CUIDADO: O cloro é corajoso; Siga sempre as instruções de segurança do fabricante. </li><li> Retire os eletrodos após 23 minutos e elimine-os generosamente com água destilada. A aplicação bem sucedida de uma camada de cloreto de prata aparece como uma mudança de cor marrom homogênea. </li><li> Seca no ar. Depois de completamente seco, leve os eletrodos com uma pinça fina. Com um pincel fino, aplique isolamento elétrico líquido. Comece no fio diretamente atrás da ponta do eletrodo e cubra tudo até o tubo de encolhimento de calor. Deixe o isolamento secar durante pelo menos 2 h. </li><li> Para controle de qualidade, realize uma verificação da condutividade elétrica com um multímetro. Se disponível, execute testes de impedância a 1 kHz usando um medidor de impedância apropriado, enquanto o eletrodo e testeA sonda é colocada em uma solução contendo H2O contendo 0,9% sem tocar entre si. Os valores de impedância a 1 kHz devem ser de aproximadamente 8 kΩ. </li></ol> 2. Afixando os eletrodos a um suporte estereotáxico NOTA: Para gravar MUA e LFPs ao mesmo tempo, use eletrodos de microondas de tungstênio com uma impedância de 1,5 MΩ. Se o foco das gravações estiverem em gravações de alta qualidade de unidades únicas, escolha eletrodos de microwire com uma impedância maior (&gt; 5 MΩ). Se o objetivo do estudo for direcionado exclusivamente para LFPs, os eletrodos com impedâncias mais baixas podem ser aceitáveis. Para pequenas estruturas, para as quais os ajustes estereotáxicos dorsoventrais são freqüentemente necessários, use pares de eletrodos com uma separação adequada da ponta dorsoventral (neste caso, 250 μm). Além disso, isso proporciona a vantagem de um eletrodo de referência mais local, se necessário. As coordenadas estereotáxicas são sempre medidas a partir do eletrodo mais baixo e umaÉ calculado em referência ao bregma. <ol><li> Pegue um suporte de eletrodo estereotáxico padrão com um bloco de acrílico e aperte e coloque-o com segurança sobre uma superfície plana no campo de visão de um microscópio cirúrgico. </li><li> Coloque suavemente o primeiro par de eletrodos no bloco acrílico do suporte com pedaços de fita adesiva (3 mm x 8 mm) usando uma pinça fina. Os eletrodos devem protrusar o bloco de acrílico aprox. 12 mm. </li><li> Coloque cuidadosamente o segundo eletrodo bipolar ao lado do primeiro eletrodo. Para segmentar as estruturas da via hiperdiretada, a distância deve ser de 2 mm ( Figura 1 ). Para a maioria dos suportes de eletrodos estereotáxicos padrão, este é o recesso adjacente. Use um medidor de calibre para verificar. Diferentes redes podem ser abordadas da mesma maneira. Para isso, o bloco de acrílico pode ser girado até certo ponto. </li><li> Ajuste o segundo par de eletrodos deslizando-o cuidadosamente para uma posição, na qual a ponta mais ventral é de aproximadamente 200Μm recesso comparado ao primeiro eletrodo ( Figura 1 ). Faça isso sob visão microscópica. Para isso, use uma cânula de 30 G (diâmetro externo de 300 μm) para melhor estimar a distância. </li><li> Pressione a fita adesiva e, em seguida, segure com a braçadeira de metal do suporte. </li></ol> 3. Cirurgia <ol><li> Para gravações eletrofisiológicas, use uretano (CUIDADO) para anestesia. Cuidado: O uretano é tóxico e carcinogênico, portanto, siga sempre os regulamentos de segurança e a folha de dados fornecida pelo fabricante da substância. </li><li> Prepare uma solução de 200 mg / mL de uretano em solução salina médica de NaCl a 0,9%. </li><li> Administrar um total de 1,3 g / kg de uretano corporal por via intraperitoneal (IP). Dependendo da cepa do rato, pode ser razoável dividir a dose em duas doses com um intervalo de 15 min entre as injeções, a fim de aumentar a segurança da anestesia. </li><li> Verifique a profundidade da anestesia usando pReflexo de retirada de edal e outros reflexos adequados. Se a anestesia não for suficientemente profunda para realizar uma cirurgia, injete 0,15 g / kg de peso corporal de uretano IP e espere mais 15 min. </li><li> Aplique uma pomada ocular para evitar a desidratação da córnea. </li><li> Monitorar constantemente a freqüência respiratória e o reflexo de retirada do pedal durante a anestesia. Use uma almofada de aquecimento de pequenos animais com controle de temperatura para garantir que uma temperatura corporal fisiológica seja mantida durante toda a cirurgia. Antes do início das gravações eletrofisiológicas, mude para uma alternativa não elétrica ( por exemplo , almofada de cabeça de acetato de sódio). </li><li> Raspar o pêlo ao lado do lado dorsal da cabeça para conseguir um campo cirúrgico limpo. Desinfecte em torno do local da incisão com desinfetante cirúrgico apropriado. Corrigir o animal no quadro estereotáxico. </li><li> Execute uma incisão de 2 cm de comprimento no couro cabeludo na direção sagital com um bisturi. Use um bisturi para raspar ligeiramente a aponeurose do crânio e desinfecte o crânio. Use coTton buds embebido em 3% de H 2 O 2 para remover qualquer tecido restante. </li><li> Use um electrocauter ou termocauter para controlar o sangramento, se necessário. Pare as sangramentos do osso do crânio e hipoderma, se o sangramento não parar espontaneamente após 1-2 minutos e dificulta a visão no crânio. </li><li> Ajuste a barra do incisivo até que a cabeça esteja posicionada na posição plana do crânio, o que significa que o bregma e lambda como pontos de referência estereotáxicos estão no mesmo plano. Isso é mais importante para obter alta precisão cirúrgica. Use uma ferramenta padrão de alinhamento de ratos estereotáxicos, calibre a ponta designada para o bregma sob visão microscópica e ajuste a barra do incisivo até que os pontos designados para a bregma e lambda na ferramenta toquem o crânio ao mesmo tempo. NOTA: Uma visão de um lado com luz focada do outro pode ajudar a determinar esta condição. Alternativamente, tome um suporte estereotáxico com uma cânula fina e mande as coordenadas dorsoventral da Bregma aNd lambda sob visão microscópica. Ajuste a barra do incisivo até que as coordenadas dorsoventrais de Bregma e lambda sejam as mesmas. </li><li> Use um suporte estereotáxico com cânula, calibre para o bregma e depois calcule a posição de todos os furos no crânio. Usando o suporte estereotáxico, marque as posições dos furos a serem perfurados, coçando com cuidado o crânio ou usando um marcador de cor cirúrgica. As coordenadas para isso dependem dos alvos, as coordenadas com referência ao bregma são dadas para a via hiperdiretada na Tabela 1 , incluindo as coordenadas sugeridas para eletrodos de referência cerebelares. </li><li> Usando uma microdrill cuidadosamente perfurar todos os buracos. Para a STN e SNr, perfure um furo comum (aproximadamente 2 mm x 3 mm de tamanho). Todos os outros furos devem ter um diâmetro de cerca de 1 mm. </li><li> Pegue duas cânulas finas (pelo menos 27 G) e dobre suas pontas para formar uma forma de ganchos, usando uma superfície dura ou uma pinça. Use estes para remover qualquer debriS dos furos, e cuidadosamente cortar e remover a dura-máter no buraco comum STN / SNr. </li><li> Desligue os furos com solução salina fisiológica. Aplique uma gota de solução salina fisiológica a cada 15 minutos até os orifícios de perfuração para evitar que o cérebro ea duraçao se desabafam. </li><li> Pegue uma microdrill e um micro-parafuso de aço inoxidável correspondente ( por exemplo, um parafuso M 1,2 mm x 2 mm), perfure um furo e rosqueie um micro-parafuso entre os furos dos eletrodos epidural de referência acima do cerebelo, faça o mesmo para o Eletrodos epidurais M1. </li><li> Deslize os eletrodos peridurais Ag / AgCl auto-construídos nos furos para os eletrodos de referência e os eletrodos M1. Guie a ponta do eletrodo com pinças finas e deslize-o diretamente abaixo do osso do crânio no furo. </li><li> Corrigir todos os eletrodos epidural com acrílico dental de dois componentes. Certifique-se de não cobrir o ponto de bregma nem afetar o buraco STN / SNr comum. </li><li> Insira o suporte preparado com o eletrodo de microondas de tungstênioEstá no quadro estereotáxico. </li><li> Calibre o eletrodo mais ventral, que se destina a direcionar a STN, para o bregma. Ajuste para a posição calculada acima do buraco comum STN / SNr e abaixe os eletrodos até o cérebro sob visão microscópica. Certifique-se de que os eletrodos de microondas de tungstênio entrem no interior do cérebro sem problemas. </li></ol> 4. Mapeamento eletrofisiológico e gravações NOTA: Para esta etapa, é necessária uma gaiola Faraday e um sistema de gravação eletrofisiológica multicanal com software de gravação capaz de filtrar on-line e classificar por linha. De preferência, use um sistema que funcione com um pré-amplificador posicionado perto da cabeça dos animais para manter o ruído elétrico e os artefatos no mínimo absoluto. Além dos eletrodos de microondas de tungstênio, pelo menos um eletrodo epidural e um eletrodo de referência são necessários para realizar gravações da via hiperdiretária. Recomenda-se inserir epidural e referenciarE eletrodos em par, sem que eles se toquem, isso ajuda em caso de mau funcionamento e permite diferentes tipos de referência na análise de dados. <ol><li> Coloque uma gaiola móvel Faraday acima do quadro estereotáxico. Se apenas uma gaiola estacionária de Faraday estiver disponível, mova cuidadosamente o quadro estereotáxico para a gaiola de Faraday, assegurando que os eletrodos do cérebro profundo não estejam abaixados no cérebro até o quadro estereotáxico estar em sua posição final. </li><li> Conecte os eletrodos ao headstage da instalação eletrofisiológica. Verifique se os eletrodos de referência estão conectados a canais de referência apropriados. </li><li> Configure o software de gravação: filtro Bandpass (0,05-8,000 Hz) e amplifique (ganho 1,500-2,000x) o sinal de dados brutos. Use um filtro LFP e espiga on-line com as configurações apropriadas (filtro passa-banda 0,05-250 Hz para LFPs, filtro passa-banda 300-8,000 Hz para MUA). Para todos os filtros, use um filtro tipo butterworth. </li><li> Configure um limite de pico, se aplicável, para onlinE spike classing. A maioria dos softwares de gravação permite a configuração de um limite de espiga, que é um valor de amplitude acima do qual um sinal é marcado como um pico pelo software. Este limiar pode ser determinado matematicamente como um fator ou desvio padrão da amplitude média do sinal de espiga filtrada, ou pode preferencialmente ser determinado por inspeção visual de segmentos de dados &lt;500 ms e configurado como uma linha acima do ruído de sinal em um gráfico interface de usuário. NOTA: A intenção na configuração de um limite de espiga é contar picos e unidades de ordenação para fornecer informações sobre quantos neurônios estão atualmente gravados e como seus picos são moldados. </li><li> Abaixe lentamente os eletrodos de microondas de tungstênio a 1 mm de dorsal do alvo, que é STN para hiperdireito. Aguarde até que o sinal se estabilize, se necessário. </li><li> Para o mapeamento eletrofisiológico, avance os eletrodos ventralmente em passos de 100 μm. Em cada passo, avalie o padrão de disparo, disparandoComia e forma de espigas. Compare aqueles com os exemplos típicos dados na Figura 2 . Comumente, os núcleos densos mostram espetadas rápidas e contínuas em várias etapas dorsoventrais, enquanto que as estruturas ricas em fibras mostram baixas taxas de disparo e atividade de espiga menos homogênea nas subseqüentes etapas ventrais. </li><li> Para o percurso hiperdireito, verifique se o eletrodo mais ventral está dentro da STN. NOTA: O STN é atingido quando um aumento considerável no MUA é detectado ventral da Zona incerta. Ventral para a STN, o pico termina quase completamente porque o eletrodo atingiu a cápsula interna. Quando o eletrodo mais ventral está em STN, a configuração dos microeletrodos de tungstênio garante que o posterior e segundo eletrodo esteja em SNr. O ajuste fino de Dorsoventral em pequenos incrementos pode ser necessário para gravar MUA típico em STN e SNr ao mesmo tempo. Observe que a freqüência de MUA depende do número de neurônios realmente registrados e no nível de cérebroativação. </li><li> Uma vez que os eletrodos estão nas estruturas desejadas, configure filtragem on-line e classificação por espiga (veja a Figura 4 ) e, em seguida, comece a gravação dos dados. Exemplos típicos para os diferentes estados de sincronização cortical que podem ser identificados nas gravações LFP são mostrados na Figura 3 . </li></ol> 5. Fim da experiência <ol><li> Quando as gravações são feitas, levante lentamente os eletrodos do cérebro e, instantaneamente, elimine-os com solução salina fisiológica. Os eletrodos podem ser reutilizados após uma lavagem completa e inspeção visual. Eléctrodos de dobra de descarga. </li><li> Eutanizar os animais por uma injeção IP de uma sobredosagem de uretano (2,5 g / kg de peso corporal). NOTA: O uretano só deve ser usado para procedimentos finais. </li><li> Se for necessária verificação histológica da posição do eletrodo ou outros procedimentos de coloração histológica, remova o cérebro do crânio e processe oTecido adequadamente. NOTA: Dependendo dos métodos de coloração pretendidos, a perfusão transcardial pode ser necessária. Para a verificação pós-mortem da posição do eletrodo, uma coloração padrão de Nissl é suficiente na maioria dos casos para visualizar a trajetória do eletrodo, por exemplo, nas seções coronais do cérebro. Outras abordagens para facilitar a verificação do alvo histológico incluem o uso de lesões induzidas eletricamente no tecido cerebral aplicando corrente elétrica através dos eletrodos de gravação ou a aplicação de corante biocompatível antes da inserção do eletrodo 16 , 17 . </li></ol>

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<li>Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+slow+%28%3C+1+Hz%29+oscillation+of+neocortical+neurons+in+vivo%3A+depolarizing+and+hyperpolarizing+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components.</a> J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).</li>
<li>Maggi, C. A., Meli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+urethane+anesthesia+for+physiopharmacological+investigations+in+various+systems.+Part+1%3A+General+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations.</a> Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).</li>
<li>Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globus+pallidus+discharge+is+coincident+with+striatal+activity+during+global+slow+wave+activity+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat.</a> J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).</li>
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<li>Paasonen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+seven+different+anesthesia+protocols+for+nicotine+pharmacologic+magnetic+resonance+imaging+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).</li>
<li>Mahmud, M., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+Analysis+of+Multichannel+Extracellular+Neuronal+Signals%3A+State-of-the-Art+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges.</a> Front Neurosci. 10, 248(2016).</li>
<li>Hadar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+oscillations+and+elevated+dopamine+levels+in+the+reward+pathway+during+alcohol+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse.</a> Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).</li>
<li>Voget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+local+field+potential+activity+and+serotonergic+neurotransmission+are+further+characteristics+of+the+Flinders+sensitive+line+rat+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression.</a> Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No presente estudo, o método é demonstrado como gravar sinais eletrofisiológicos extracelulares simultaneamente a partir de múltiplos locais de uma determinada rede utilizando o exemplo da via de ganglios cortico-basal hiperdirectos que conecta o M1 com STN e SNr em roedores. Um passo crítico na gravação de pequenas estruturas subcorticais, como a STN, é a inserção guiada com precisão dos eletrodos de gravação no alvo. No método apresentado, cuidar de duas etapas cruciais assegura uma alta p...

A evidência cumulativa recente sobre diferentes distúrbios neuropsiquiátricos, como a doença de Parkinson (PD) e esquizofrenia, sugere fortemente que sua fisiopatologia é baseada em uma disfunção crítica de circuitos neuronais estendidos que geralmente envolvem estruturas corticais e subcorticais 1 , 2 , 3 . De acordo com esta teoria, as manifestações clínicas das doenças surgem como conseqüência de uma capacidade de processamento da informação prejudicada de uma rede de células em vez de células únicas ou elementos neuronais específicos 1 , 2 , 3 . A fim de melhorar a compreensão deste complexo grupo de doenças neuropsiquiátricas e encontrar novas opções de tratamento, é obrigatório caracterizar a dinâmica neuronal dessas redes desordenadas em pacientes humanos e modelos animais em grande detalhe. Um excelO método para estudar redes em larga escala em indivíduos vivos é o registro multidisciplinar de potenciais extracelulares 4 . Usando esse método, é possível avaliar simultaneamente potenciais de campo locais (LFPs), que representam principalmente a soma temporal de correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias e atividade multi-unidade (MUA), que é gerada por potenciais pré-sinápticos 5 . A gravação de potenciais extracelulares tem várias vantagens em relação aos métodos alternativos para estudar redes, por exemplo , imagens de ressonância magnética funcional e imagens de cálcio, porque proporciona uma maior resolução temporal e espacial e não depende de organismos geneticamente modificados 5 . No entanto, o uso de gravações extracelulares in vivo é limitado, pois é uma técnica invasiva que não pode ser universalmente aplicada. Rec. Eletrofisiológica in vivoAs ordens podem ser realizadas tanto em animais acordados quanto em animais anestesiados 6 . Ambos os métodos são acompanhados por prós e contras específicos. Estudos em animais acordados permitem a gravação de sinais cerebrais durante o desempenho de tarefas comportamentais definidas, mas são propensos a movimentos relacionados e outros artefatos 7 , 8 . As gravações em animais anestesiados, por outro lado, oferecem a oportunidade de avaliar LFPs e MUA com um mínimo de artefatos em estados de sincronização cortical altamente definidos, mas os resultados também diferem em certa medida para o que pode ser encontrado em indivíduos acordados 9 , 10 , 11 . Nos últimos anos, foi demonstrado que a amostragem de LFPs é especialmente útil para delinear mudanças patológicas da atividade da rede. Um exemplo proeminente disso é a pesquisa sobre a fisiopatologia da PD em paciente humanoS e modelos animais da doença, onde poderia ser demonstrado que as oscilações beta aprimoradas no circuito dos gânglios cortico basal estão ligadas a sintomas motores parkinsonianos 12,13. Como conseqüência dessa linha de pesquisa, atualmente é investigado se as oscilações beta poderiam ser usadas como um biomarcador de feedback online para estimulação cerebral profunda em circuito fechado 14 , 15 . No presente estudo, fornece-se uma descrição detalhada das gravações eletrofisiológicas multi-site agudas de LFPs e MUA em ratos anestesiados com uretano. Está demonstrado como uma rede completa, como a via ganglionar cortico-basal hiperdirecional, pode ser caracterizada eletrofisiologicamente usando eletrodos padrão e personalizados e como esses eletrodos podem ser construídos. É especialmente enfatizado como uma segmentação precisa dos núcleos dos gânglios basais pode ser alcançada por coMbining cirurgia estereotáxica, juntamente com o registro on-line de MUAs.

<table><tbody><tr><td>Eletrodos epidurais personalizados Ag/AgCl</td><td>Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Alemanha info@goodfellow.com</td> ID do produto AG005127 para eletrodos Ag/AgCl com <td>fio de prata 99,99%</td><td>permitirão melhor qualidade de sinal, mas só podem ser usados em experimentos agudos. Possível substituição: Eletrodos de aço inoxidável</td></tr><tr><td>Suporte estereotáxico com bloco de acrílico</td><td>David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, EUA</td><td>ID do produto Modelo 1770 Suporte de eletrodo padrão</td><td>Certifique-se de que o bloco de acrílico tenha reentrâncias que se adequem à configuração do eletrodo para o alvo desejado. Os blocos de acrílico podem ser facilmente modificados com um arquivo para obter a configuração desejada. Possível substituição: Suportes de eletrodos autoconstruídos</td></tr><tr><td>Eletrodos de microfios de tungstênio 1.5 M&Omega; impedância</td><td>Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way&nbsp; Gaithersburg, Maryland, 20879 EUA</td><td>ID do produto WE3ST31.5A5-250um</td><td>O 1.5 M&Omega; é necessário para gravar MUA e LFP ao mesmo tempo. Possível substituição: Microeletrodos de diferentes materiais podem ser usados. Os eletrodos devem ser retos, robustos e o mais finos possível.</td></tr><tr><td>Ferramenta de alinhamento de ratos</td><td>David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, EUA</td><td>ID do produto Modelo 944 Ferramenta de alinhamento de ratos</td><td>Permite a orientação exata do cérebro para corresponder aos atlas estereotáxicos. Possível substituição: Suporte estereotáxico com cânula</td></tr><tr><td>Acrílico odontológico de dois componentes</td><td>Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, Reino Unido</td><td>Simplex Rapid Powder Clear 225g, Código do produto: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Código do produto: ACR920</td><td>Dependendo dos eletrodos usados, a supercola pode ser uma alternativa fácil, se os eletrodos forem pequenos e leves. Possível substituição: Supercola (à base de cianacrilato)</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Autoconstrução</td><td></td><td>Uma gaiola de Faraday adequada será a melhor proteção contra artefatos eletromagnéticos, mas tudo o que pode ser moldado em forma de caixa ou aplicado a uma estrutura e é feito de material condutor pode ajudar. Possível substituição: Folha de alumínio ou malha de cobre</td></tr><tr><td>Configuração eletrofisiológica com software de gravação e recursos de classificação de picos on-line</td><td>OmniPlex&reg; Sistema de Aquisição de Dados Neurais Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 EUA</td><td></td><td>O software de classificação offline é uma alternativa potencial, vários scripts e softwares podem ser encontrados gratuitamente na comunidade de código aberto.</td></tr></tbody></table>

agudo<em&gt; in vivo</em&gt; gravações eletrofisiológicas de potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

A evidência convergente mostra que muitas doenças neuropsiquiátricas devem ser entendidas como distúrbios das redes neuronais em grande escala. Para entender melhor a base fisiopatológica destas doenças, é necessário caracterizar com precisão de que maneira o processamento da informação é perturbado entre as diferentes partes neuronais do circuito. Usando gravações eletrofisiológicas extracelulares in vivo , é possível delinear com precisão a atividade neuronal dentro de uma rede neuronal. A aplicação deste método tem várias vantagens em relação a técnicas alternativas, por exemplo , ressonância magnética funcional e imagem de cálcio, pois permite uma resolução temporal e espacial única e não depende de organismos geneticamente modificados. No entanto, o uso de gravações extracelulares in vivo é limitado, pois é uma técnica invasiva que não pode ser universalmente aplicada. Neste artigo, um método simples e fácil de usar é apresentado wCom o qual é possível gravar simultaneamente potenciais extracelulares, como potenciais de campo locais e atividade multiunidade em vários sites de uma rede. É detalhado como uma segmentação precisa dos núcleos subcorticais pode ser alcançada usando uma combinação de cirurgia estereotáxica e análise on-line de gravações de várias unidades. Assim, é demonstrado, como uma rede completa, como o loop hiperligado de gânglios cortico basal, pode ser estudada em animais anestesiados in vivo .

Com os eletrodos de gravação aqui utilizados, é possível amostrar LFPs do córtex motor primário, o núcleo subtalâmico e a substância nigra pars reticulata e MUA da STN e SNr. Inicialmente, LFPs e atividade de várias unidades são gravadas em conjunto em um sinal de banda larga. Posteriormente, LFPs e MUAs são separados por filtros de passagem de banda (0,05-250 Hz para LFPs e 300-4,000 Hz para MUA). Para a segmentação correta d...

Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

O objetivo geral deste experimento é demonstrar como realizar gravações eletrofisiológicas agudas in vivo de potenciais de campo locais e atividade multiunitária do circuito cortico-basal em ratos anestesiados. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de neurociência, como a forma pela qual oscilações patológicas contribuem para a complexa fisiopatologia das doenças neuropsiquiátricas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para registrar potenciais extracelulares de diversos alvos corticais e subcorticais do cérebro simultaneamente.As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento de diversas doenças neuropsiquiátricas, pois os potenciais de campo locais podem ser potencialmente utilizados como biomarcadores para tratamentos como a estimulação em circuito fechado. Embora este método possa fornecer informações sobre a fisiopatologia dos gânglios da base, ele também pode ser aplicado a outras áreas cerebrais. Para iniciar este procedimento, prepare um comprimento de cinco centímetros de fio de prata com diâmetro de 200 micrômetros e remova qualquer revestimento, se necessário.Em seguida, segure a ponta do fio voltada para baixo em uma chama até que a ponta comece a derreter e forme uma esfera com diâmetro de um milímetro. Em seguida, corte o eletrodo para um comprimento total de 15 milímetros, medido desde o início da ponta esférica até a extremidade do fio. Solde um conector de precisão na extremidade do fio, compatível com o sistema de gravação eletrofisiológica.Em seguida, cubra o ponto de solda da extremidade do fio até o conector com verniz prateado condutor para melhorar a condutividade. Após a secagem do verniz condutor, cubra o ponto de solda com um tubo termorretrátil de um a três milímetros. Aplane cuidadosamente a ponta com formato esférico até a metade da espessura usando um martelo de relojoeiro.Posteriormente, coloque luvas de exame e use um pano de limpeza sem fiapos com etanol a 100% para remover qualquer sujeira e graxa. Em seguida, coloque os eletrodos em um tubo de centrífuga de 15 mililitros ou em um tubo de cultura celular e preencha-o com água sanitária comum até que a ponta em forma de bola esteja completamente coberta. Após 23 minutos, retire os eletrodos e enxágue-os abundantemente com água destilada.A superfície do eletrodo deve apresentar-se roxa-escura homogênea na aplicação bem-sucedida de cloreto de prata. Em seguida, deixe os eletrodos secarem ao ar. Pegue os eletrodos com pinças finas após estarem completamente secos.Em seguida, use um pincel fino para aplicar isolante elétrico líquido sobre os eletrodos. Comece pelo fio diretamente atrás da ponta do eletrodo e cubra tudo até o tubo termorretrátil. Posteriormente, deixe o isolante secar por pelo menos duas horas.Neste passo, fixe levemente o primeiro par de eletrodos ao bloco de acrílico do suporte com pedaços de fita adesiva. Os eletrodos devem protruir do bloco de acrílico em aproximadamente 12 milímetros. Em seguida, fixe cuidadosamente o segundo eletrodo bipolar ao lado do primeiro eletrodo.Para direcionar as estruturas da via hiperdireta, a distância entre os pares de eletrodos deve ser de dois milímetros. Sob o microscópio, ajuste o segundo eletrodo bipolar deslizando-o cuidadosamente para uma posição na qual a ponta mais ventral esteja recuada aproximadamente 200 micrômetros em comparação com o primeiro eletrodo. Pressione a fita adesiva e, em seguida, fixe os eletrodos com o grampo metálico do suporte.Após anestesiar o animal, rape a cabeça para obter um campo cirúrgico limpo. Fixe o animal no estereotáxico e, em seguida, desinfete o local da incisão e a área circundante com um desinfetante cirúrgico apropriado. Posteriormente, realize uma incisão de dois centímetros de comprimento no couro cabeludo na direção sagital com um bisturi.Use o bisturi para raspar levemente a aponeurose do crânio e desinfete o crânio com peróxido de hidrogênio a 3%. Em seguida, use cotonetes embebidos em peróxido de hidrogênio a 3% para remover quaisquer tecidos remanescentes. A seguir, ajuste a barra incisiva até que o topo do crânio esteja nivelado, o que significa que o bregma e o lambda, como pontos de referência estereotáxicos, estão no mesmo plano.Sob o microscópio, utilize uma ferramenta padrão de alinhamento estereotáxico para ratos para calibrar a ponta designada até o bregma e ajuste a barra incisiva até que os pontos designados para o bregma e lambda na ferramenta toquem o crânio simultaneamente. Usando um suporte estereotáxico com cânula, calibre-o em relação ao bregma e, em seguida, calcule a posição de todos os orifícios a serem perfurados no crânio. Em seguida, marque as posições dos orifícios a serem perfurados, arranhando cuidadosamente o crânio ou utilizando um marcador cirúrgico colorido.Em seguida, utilizando uma micromotriz, perfure cuidadosamente todos os orifícios com um diâmetro de cerca de um milímetro. Para o NST e o SNr, faça um orifício comum com aproximadamente dois milímetros por três milímetros. Pegue uma cânula fina e dobre a ponta para formar dois ganchos.Em seguida, utilize os ganchos para remover qualquer detrito dos orifícios de perfuração e corte e remova cuidadosamente a dura-máter no orifício comum do NST/SNr. Depois disso, lave os orifícios de perfuração com solução salina fisiológica. Aplique uma gota de solução salina fisiológica a cada 15 minutos nos orifícios de perfuração para evitar que o cérebro e a dura sequem.Em seguida, pegue uma microbroca e um microparafuso de aço inoxidável compatível, faça um furo e parafuse um microparafuso entre os orifícios de perfuração dos eletrodos epidurais acima do cerebelo. A seguir, guie as pontas dos eletrodos com pinças finas e deslize-as diretamente abaixo do osso do crânio para dentro dos orifícios de perfuração. Fixe todos os eletrodos epidurais com acrílico estêncil de dois componentes.Certifique-se de não cobrir o ponto de bregma nem afetar o orifício comum do STN/SNr. Em seguida, insira o suporte preparado com os eletrodos de fio micro de tungstênio no estereotáxico. Calibre o eletrodo mais ventral em relação ao bregma, que tem como alvo o STN.Ajuste para a posição calculada acima do orifício comum do STN/SNr e introduza os eletrodos até o cérebro. Certifique-se de que os eletrodos de fio microfinos de tungstênio entrem no cérebro suavemente. Neste procedimento, configure o software de gravação, como filtro passa-banda, e amplifique o sinal bruto dos dados.Em seguida, utilize um filtro online de LFP e spikes com configurações apropriadas. Para todos os filtros, use um filtro do tipo Butterworth. Configure um limiar de spike para a classificação online de spikes.A maioria dos softwares de gravação permite configurar um limiar de pico, que é um valor de amplitude acima do qual um sinal é marcado como pico pelo software. Em seguida, abaixe lentamente os eletrodos de fio microfino de tungstênio até um milímetro acima do NST e aguarde a estabilização do sinal, se necessário. Para o mapeamento eletrofisiológico, avance os eletrodos ventralmente em etapas de 100 micrômetros.Em cada etapa, avalie o padrão de disparos, a taxa de disparos e a forma dos potenciais de ação comparando-os com os exemplos típicos apresentados na figura dois do manuscrito suplementar. Uma vez que os eletrodos estejam nas estruturas desejadas, configure a filtragem em tempo real e a separação de potenciais de ação, e então inicie a gravação dos dados. A seguir, tem-se uma gravação representativa de 600 segundos do potencial de campo local do córtex motor primário.Períodos de tempo com atividade de baixa amplitude e alta frequência, correspondentes ao estado ativado, e períodos de tempo com ritmo mais lento e amplitude mais alta, correspondentes ao estado de atividade de onda lenta, podem ser diferenciados. E este é o gráfico de tempo-frequência correspondente ao longo de um intervalo de 600 segundos, ilustrando a potência relativa de 0 a 20 Hertz dos LFPs. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar gravações eletrofisiológicas extracelulares in vivo do circuito cortico-basal ganglionar em ratos anestesiados.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento detalhado para preparar um rato anestesiado para registros eletrofisiológicos da atividade cerebral de vários locais. O couro cabeludo é dissecado para acessar o crânio e os orifícios são feitos em locais precisos para instalar e prender os eletrodos. Os eletrodos de microfios de tungstênio são então inseridos no local de destino para registrar os dados.

Registros eletrofisiológicos in vivo de atividades cerebrais de vários locais em ratos

Este vídeo demonstra o procedimento para gravações simultâneas de eletroencefalografia co-localizada (EEG) e potenciais de campo local (LFPs) em um rato anestesiado. O processo envolve preparar o rato e anexar eletrodos estimulantes às almofadas do bigode. Um eletrodo de aranha EEG é colocado no crânio do rato para medições de EEG de superfície. Ao mesmo tempo, um microeletrodo multicanal é inserido em uma região específica do cérebro através de um orifício no crânio para registrar a atividade...

Registros Eletroencefalográficos Simultâneos e Potenciais de Campo Local em um Rato Anestesiado

Este procedimento executa longa duração in vivo gravações intracelulares de neurônios individuais durante os estados cerebrais fisiologicamente relevantes e após a abolição completa das atividades elétricas em curso, resultando em um estado cerebral isoelétrico. As constantes fisiológicas do animal são cuidadosamente monitorizado durante a transição para o estado de coma artificial.

A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal<em&gt; In Vivo</em

Este protocolo descreve a medição simultânea do eletrorretinograma e dos potenciais evocados visuais em ratos anestesiados.

Gravação simultânea de Eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados

Mostramos procedimentos de implantação e de gravação cirúrgicos para medir sinais eletrofisiológicos visuais do olho (eletrorretinograma) eo cérebro (potencial evocado visual) em ratos conscientes, que é mais análogo à condição humana, onde as gravações são realizadas sem confunde anestesia.

Implantação e Gravação do Wireless Eletrorretinograma e Visual Potencial Evocado em ratos conscientes

Este protocolo descreve um método simples para gravação simultânea de co localizada Eletroencefalografia (EEG) e multi-laminar local campo potencial em um rato anestesiado. Um orifício de trépano, perfurado o crânio para a inserção de um microeléctrodo é mostrado para produzir distorção negligenciável do sinal EEG.

Gravação simultânea de eletroencefalografia co localizada e potencial do campo Local em roedores

Este estudo apresenta um método para a gravação simultânea dos potenciais do campo local no cérebro, eletrocardiogramas, electromyograms e respirando os sinais de um rato andando livremente. Esta técnica, o que reduz custos experimentais e simplifica a análise de dados, irá contribuir para a compreensão das interacções entre o cérebro e os órgãos periféricos.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Desenvolvemos uma técnica que registra simultaneamente tanto eletrocorticografia e potenciais de campo local em resposta a estímulos nociceptivos do laser de ratos movimentando-se livremente. Esta técnica ajuda a estabelecer uma relação direta dos sinais de electrocortical o nível macroscópico e mesoscópica e que facilita a investigação de informação nociceptiva processamento no cérebro.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local e Electrocorticograms em resposta a estímulos nociceptivos Laser de ratos movimentando-se livremente

Este protocolo descreve um método para obter gravações in vivo de neurônio único de alta densidade do tronco cerebral de camundongos com cabeça fixa. Essa abordagem é implantada para medir o potencial de ação disparado de neurônios no cinza periaquedutal ventrolateral - uma região do tronco encefálico inativa durante o sono REM (Rapid Eye Movement) - antes e durante a anestesia geral.

Gravações agudas de vários eletrodos de unidade única do tronco encefálico de camundongos com cabeça fixa

Aqui, apresentamos um método para avaliar a ativação e o bloqueio dos axônios sensoriais nos nervos periféricos em experimentos agudos, anestesiados e in vivo com ratos, utilizando dois tipos de medições eletrofisiológicas da coluna vertebral que podem discriminar a atividade dos subtipos de fibras nervosas: Potenciais de Campo Local e registros de neurônios únicos em Faixa Dinâmica Ampla.

Métodos eletrofisiológicos para avaliar o bloqueio de dor periférica em um rato anestesiado

Aprenda a realizar gravações eletrofisiológicas agudas in vivo de potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades em ratos anestesiados. Este método permite registrar simultaneamente sinais extracelulares de alvos corticais e subcorticais para estudar a fisiopatologia de doenças neuropsiquiátricas.

Agudo In Vivo Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados (Vídeo) | JoVE Journal

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