Name: Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a determinar a posição cromossômica ideal de elementos de DNA em Escherichia coli usando inserção mediada por transposon, experimentos de competição e sequenciamento de genoma completo. Este método avança a compreensão da organização cromossômica bacteriana.

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Os autores foram financiados por subsídios da Fundação Novo Nordisk, a Fundação Lundbeck e o dinamarquês National Research Foundation (DNRF120) através do centro para resposta ao estresse bacteriana e persistência (BASP).

1. coleção da biblioteca do Transposon Nota: O locus DARS2 cromossômico foi clonado para o Tn mini 10-baseado transposon, NKBOR (na pNKBOR) 21, resultando em NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pode ser obtido on-line de 22. pNKBOR é um vetor de suicídio baseado em R6K que requer a π de proteínas do iniciador para replicação 23. Plasmídeo pJFM1, portanto, é capaz de replicar em uma cepa de Escherichia coli (por exemplo, Dh5α λ pir) contendo uma cópia cromossômica do gene do pir. No entanto, quando pJFM1 é transformado a sua deficiente em Pir MG1655, pJFM1 não pode replicar, levando à seleção de clones resistentes canamicina gerado pelas inserções aleatórias das NKBOR:: DARS2 para o cromossomo bacteriano. Para simplificar, estes são referidos como DARS2 inserções. Veja a Figura 1 para uma apresentação esquemática da metodologia.
<ol><li>Prepare electrocompetent MG1655 Δ DARS2 de crescimento activo em caldo lisogenia (LB), crescido a 37 ° C 24 células.</li>
	<li>Electroporate pJFM1 em electrocompetent MG1655 Δ DARS2, de acordo com Gonzales et al. 24 <ol><li>Adicionar 1 µ g de pJFM1 (em 1 µ l de água) para 40 µ l de Δ de electrocompetent MG1655 de e. coli DARS2 e transfira esta mistura para uma cubeta do pre-refrigerados e estéril intervalo de 0,2 cm. Inserir a cubeta na câmara de eletroporação. Electroporate em 18 kV, Ω 500 e 25 µF; a constante de tempo deve ser ~5.0 ms, e não há formação de arco deve ocorrer.</li>
		<li>Recuperar rapidamente a suspensão bacteriana por resuspending-lo em 1 mL de caldo LB pré-aquecido e transferir para um tubo de ensaio de 15 mL.</li>
		<li>Deixa as células recuperar incubando sob condições de crescimento aerado a 37 ° C por 30 min, sem seleção de antibiótica. As bactérias em placas de ágar LB suplementadas com canamicina 50µg/mL a placa e incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
	</ol></li> <li>Contar as colônias da eletroporação: uma colônia é considerada igual a uma inserção cromossômica transposon. 
	Nota: As colónias podem ser contadas pelo olho ou com um contador de colônia. O número de colônias é inversamente proporcional a distância média que separa os transposões localizados no cromossomo de cada clone.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de caldo LB para cada placa e lave todas as colônias; 1 mL de caldo LB deve ser suficiente para lavar fora ~ 100.000 colônias. Re-utilize o mesmo 1 mL de caldo LB para aumentar a concentração bacteriana. Piscina de todas as colônias no mesmo tubo 50 mL.</li>
	<li>Vortex o tubo e congelar o material de início (t = 0). Para congelá-lo, misture 1 mL de suspensão de células com 1 mL de glicerol a 50% no gelo. Transferi os tubos para secar gelo durante 10 minutos. Uma vez que as culturas estão congeladas, transferi-los para um freezer-80 ° C. 
	Nota: Espera-se uma concentração de células de um mínimo de 50.000 UFC/mL neste passo.</li>
</ol> 2. Experiência de competição em LB <ol><li>Thaw a biblioteca transposon de-80 ° C no gelo. Mix pipetando.</li>
	<li>Transferir 100 µ l da biblioteca transposon a 10 mL de LB em um tubo de ensaio de 15 mL.</li>
	<li>Crescer as células, ventiladas por agitação contínua (250 rpm), para 8 h a 37 ° C, a fase estacionária (ou seja, OD 600 = ~ 4.0). Ajustar esses parâmetros para as condições de crescimento diferentes, conforme desejado.</li>
	<li>Propagar a população bacteriana por transferências contínuas em meio fresco escaldada cada ~ 10 gerações. Para fazer isso, a transferência de 10 µ l da cultura anterior fase estacionária para 10 mL de LB fresco e crescendo para outro h 8 para a fase estacionária (ou seja, OD 600 = ~ 4.0). 
	Nota: Como a densidade óptica inicial e final são iguais, uma 1,000-fold diluição corresponde a ~ 10 gerações de crescimento (2 10 = 1.024). A população bacteriana pode ser propagada diretamente no meio fresco escaldado ou salvos em 0-4 ° C (no gelo) e propagadas no dia seguinte. LB foi usado aqui para garantir tantos doublings celulares em tão curto tempo possível (uma vez dobrando perto 22 min).</li>
	<li>Após cada 100 gerações de competição, salvar cinco amostras de 1 mL a-80 ° C (conforme descrito na etapa 3.3).</li>
	<li>Se as diferenças de aptidão entre células contendo inserções transposon individuais deverão ser pequenas, manter a duração da competição longa; aqui, 700 gerações (t = 700) foram utilizados.</li>
</ol> 3. Análise de borrão do Sul para controlar o experimento sobre tempo de concorrência <ol><li>prepara a sonda para o sul do borrão (seção 1-kb da NKBOR), realizando a amplificação de reação em cadeia (PCR) de polimerase utilizando primers específicos: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat e NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
	<ol><li>Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturação inicial. Em seguida, executar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s. Para a extensão final, use a 72 ° C durante 10 min. 
		Nota: O modelo para a reação de PCR foi um de plasmídeo purificado pNKBOR 21.</li>
		<li>Etiqueta o fragmento resultante de PCR com dATP [α - 32P] usando o sistema aleatório da primeira demão, de acordo com Smith 25.</li>
	</ol></li> <li>Preparar o DNA celular total, de acordo com Løbner-Olesen e von Freiesleben 26 para t = 0 e selecionados tempo pontos até t = 700 estimado gerações de competição.</li>
	<li>Digerir o ADN celular total com Pvu I, que corta o NKBOR que contém a região de interesse, uma vez só em uma região não coberta pela sonda; 1 unidade de Pvu pode ser usado para completamente digest 1 µ g de substrato DNA. 
	Nota: A sonda vai reconhecer fragmentos contendo parte do transposon, juntamente com o DNA cromossômico de vários comprimentos, dependendo do local de inserção.</li>
	<li>Realizar um borrão do Sul usando um gel de agarose de 0,7% de acordo com Løbner-Olesen e von Freiesleben 26.</li>
</ol> 4. Identificação dos Clones mais aptos gene de fácil de utilização <ol><li>andando, como descrito por Harrison et al. 27, para identificar locais de inserção DARS2 de clones único (isoladas em placas LB) após 700 gerações estimadas da concorrência; as bandas mais no Southern blot, os mais isolados são necessárias para cobrir todas as inserções de transposon.
	<ol><li>Isolar o DNA genômico para modelo de PCR. Espalhar as bactérias em uma placa de ágar LB contendo 50 canamicina µ g/mL e incubar a 37 ° C durante a noite. Crescem colônias única pernoite no caldo LB a 37 ° C e posteriormente transferir 20 µ l em 200 µ l de água destilada esterilizada (ou usar purificação de DNA, como no passo 3.2).
		<ol><li>Vortex para misturar. Aqueça a mistura a 100 ° C por 10 min e centrifugar a velocidade máxima por 5 min. salvar o lisado a-20 ° C para uso futuro celular.</li>
		</ol></li> <li>Desenha três primers aninhados para recozer dentro o transposon de escolha (ver Figura 2 para uma representação gráfica da estratégia da PCR). 
		Nota: Projetar Primers aninhada deve garantir que aninhados Primer 3 se encontra mais próximo a 5 conhecido &#39; final do transposon DNA, seguido de Nested Primers 2 e 1. O espaçamento entre aninhados Primer 3 e o 5 &#39; final do conhecido transposon DNA deve ser suficiente para uma leitura de sequência de DNA conhecido ao DNA desconhecido (para encontrar o local de inserção do transposon cromossômicas específicas). Para NKBOR foram utilizados os seguintes primers aninhados: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg e pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. As primeiras demão aleatórias contendo os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição conhecidos também são usadas. Para garantir um resultado, deve-se usar pelo menos dois primers aleatórios diferentes. Os locais de restrição para as enzimas de restrição (e.g.,Sau 3AI e Hin dIII) deverá situar-se nos 3 &#39; final e precedido por dez bases aleatórias então que 5 &#39; - NNNNNNNNNNGATC - 3 &#39; e 5 &#39; - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 &#39; são os primers contendo um Sau 3AI site (GATC) e um site de dIII Hin (AAGCTT), respectivamente, onde N = A, T, G ou C.</li>
		Reação de PCR <li>uso 200 ng de DNA genômico em 20 µ l. Incubar a 98 ° C por 30 s para a desnaturação inicial. Realizar 25 ciclos a 98 ° C por 30 s, 50 ° C, por 15 s e 72 ° C por 4 min. Para a extensão final, use a 72 ° C para min. 10 pares da primeira demão de uso consistindo de aninhados Primer 1 e um dos primers aleatórios.</li>
		<li>Usar pares da primeira demão, consistindo de aninhados Primer 2 e o mesmo primer aleatório da segunda amplificação, usando 1 µ l de sua reação anterior como um modelo.</li>
		<li>Repita o passo 4.1.4 com pares da primeira demão, consistindo de aninhados Primer 3 e o primer aleatório mesmo.</li>
		<li>Executar os produtos da reação de PCR a final em um gel de agarose 1,5% e mancha com brometo de etídio. Cortar uma banda na faixa de 100-800 bp e isolar o DNA usando qualquer gel ADN comercial, extraindo o kit de acordo com o fabricante &#39; direção de s. Resuspenda o DNA em 15 µ l de água. 
		Nota: cuidado. Brometo de etídio é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
		<li>a banda isolada na etapa anterior (etapa 4.1.6), com 3 de Primer aninhados como o primer de sequenciamento, usando Sanger de sequências de sequenciamento em um provedor comercial.</li>
	</ol></li> <li>Executar WGS.
	<ol><li>WGS executar sobre o total de DNA extraído de selecionado amostras coletadas durante o experimento de competição, como descrito por Frimodt-Møller et al. 4.</li>
	</ol></li> <li>Realizar a análise do sequenciamento.
	<ol><li>Align emparelhado-final lê a 150 Ns contíguos ao NKBOR, 1.904 AF310136.1 &#8230; 2.204 usando Bowtie2 28 com um intervalo entre subsequências de sementes (S, 1, 1.15) e um número máximo de caracteres ambíguos (L, 0, 0.9).</li>
		<li>Selecione o lê alinhado e então re-alinhar a ambos ref MG1655 | NC_000913.3 e NKBOR gb | AF310136 usando blastN 29</li> <li>atribuir transposição posições de inserção nos cruzamentos MG1655-NKBOR.</li>
	</ol></li></ol> 5. Citometria de fluxo <ol><li>coletar amostras para citometria de fluxo.
	<ol><li>Equilíbrio cada cultura por mantê-lo em fase de crescimento exponencial pelo menos 10 gerações. Verifique o OD 600 e certifique-se de que nunca excede 0.3.</li>
		<li>Recolher dois tipos de amostras de fluxo.
		<ol><li>Para RIF-excentricidade, transferir 1 mL da cultura para um tubo de 15 mL contendo 30 µ l de RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cefalexina 36 µ g/mL dissolvido em 12,5 mM NaOH). Deixá-lo a 37 ° C por um período mínimo de 4h de tremer. 
			Observação: Rifampicina indiretamente bloqueia a iniciação da replicação do cromossomo permitindo para rondas em curso de replicação para continuar a rescisão. Cefalexina impede a divisão celular, o que resulta em desvio de replicação (RIF-excentricidade) e o acúmulo de células com cromossomos totalmente replicados. O número de cromossomos totalmente replicados é igual ao número de origens no momento do tratamento com rifampicina e cefalexina 20.</li>
			<li>EXP-no exemplo, transferência de 1 mL de crescimento exponencial de cultura para um tubo de 1,5 mL no Ice.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Consertar as células como segue. Recolher as células por centrifugação a 15.000 x g por 5 min a 4 ° C. resuspenda o pellet em 100 µ l de pH de gelada 10mm Tris 7.5 e adicione 1 mL de etanol gelado de 77%. Armazenar as amostras em 4 ° C até o uso.</li>
	<li>Mancha as células como segue. Colheita de 100-300 µ l de células fixas por centrifugação a 15.000 x g, durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 130 µ l de &#34; solução de coloração de DNA &#34; (90 mithramycin µ g/mL, 20 brometo de etídio µ g/mL, 10 mM MgCl 2 e 10 mM Tris pH 7,5). Colocar as amostras no gelo e no escuro; as amostras estão prontas para análise de citometria de fluxo após 10 min. 
	Nota: Outro DNA manchas do que o brometo de etídio e mithramycin também podem ser usados 30 , 31.</li>
	<li>Determinar a origem por célula, a massa relativa da célula e o conteúdo de DNA relativo por análise de citometria de fluxo.
	<ol><li>Perform citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente, 32. Executar o RIF-excentricidade e EXP-amostras usando o fabricante de citômetro de fluxo &#39; instruções de s . Para mithramycin - e ethidium células manchadas de brometo, usar excitação comprimentos de onda 395 e 440 nm e coletar a fluorescência acima 565 nm.
		<ol><li>Para determinar o conteúdo de DNA em massa e relativo de célula relativa, executar as EXP-amostras para obter a dispersão de luz para a frente single-parâmetro contra histogramas de número de celular e intensidade de fluorescência contra histogramas números de celular para um mínimo de 30.000 eventos correspondente ao sinal de celular.</li>
			<li>Uso difusa single-parâmetro distribuição de luz para medir a média relativa de célula Mass. 
			Nota: Luz difusa é uma medida da massa celular média 20.</li>
			<li>Distribuições de single-parâmetro de intensidade uso da fluorescência para medir o DNA médio conteúdo 20.</li>
			<li>Obter a concentração de DNA, como a relação do teor médio de DNA para a célula média massa 20.</li>
		</ol></li> <li>Determinar o número de origens por célula.
		<ol><li>Amostras de RIF-desvio de execução para obter a intensidade de fluorescência do único-parâmetro contra celular números histogramas para um mínimo de 30.000 eventos correspondentes para o sinal de celular.</li>
			<li>Distribuições de single-parâmetro de intensidade de fluorescência de uso para determinar o número de cromossomos em cada célula 20.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Calcular o índice de assincronia (Ai).
	<ol><li>Calcular o Ai, como descrito por Løbner-Olesen et al 32, utilizando as distribuições de único parâmetro de intensidade de fluorescência das amostras de RIF-excentricidade e a fórmula Ai = (f3 + f5 + f6 e f7) / (f2 + f4 + f8), onde fx é as células de fração com x número de cromossomos totalmente replicados. Considere a iniciações assíncrono quando A &#62; 0.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nenhum interesse financeiro concorrente.

A metodologia utilizada aqui aproveita-se de técnicas de estado-da-arte para responder a uma pergunta difícil em relação a posição ideal de genômica de um elemento genético. A inserção aleatória do elemento genético (mediada pelo transposon) possibilita a coleta fácil e rápida de milhares de clones, que então podem ser feitas para competir uns contra os outros para selecionar para a posição ideal do elemento genético investigada (ou seja, o clone mais apto).
Aqui, o DARS2 foi...

A função de qualquer elemento genético pode ser afetada pela sua localização no genoma. Em bactérias, isto principalmente resulta da interferência pela transcrição dos genes vizinhos, topologia de DNA local, e/ou dosagem de gene associada a replicação. Em particular, os processos de replicação de DNA e segregação são controlados, pelo menos em parte, pelas regiões cromossômicas não-codificantes1e o funcionamento destas regiões depende de localização/contexto genômico. Em e. coli, exemplos são o site dif , necessário para a irmã de resolução do cromossomo2; Sequências KOPS, necessárias para segregação de cromossomo3; e dados, DARS1e DARS2 regiões, necessárias para o controle adequado de replicação cromossômica (abaixo; 4). apresentamos um método permitindo a realocação aleatória, seleção e determinação do contexto genético ideal de qualquer elemento genético determinado, exemplificado aqui o estudo da região não-codificante DARS2 .
Em e. coli, DnaA é a proteína de iniciador responsável pela cadeia de DNA, abrindo a única replicação origemoriquee para o recrutamento do helicase DnaB5,6,7. DnaA pertence a AAA+ (i.e., ATPase associados com diversas atividades) proteínas e pode vincular tanto ATP e ADP com alta semelhante afinidades5. O nível de DnaAATP picos no início8, onde DnaAATP forma um multimer na orique que aciona o DNA abertura frente e verso9. Após a iniciação, orique feita temporariamente indisponível para re-iniciação devido ao sequestro por um mecanismo que envolve a ligação da proteína SeqA a hemimethylated orique10,11. Durante o sequestro, o nível de DnaAATP é reduzido pelo menos dois mecanismos: a inactivação regulamentar de DnaA (RIDA)12,13 e dados-dependente DnaAATP hidrólise (DDAH)14 ,15. Tanto RIDA e DDAH promovem a conversão de DnaAATP DnaAADP. Antes de uma nova rodada de iniciação, DnaAADP é re-ativado para DnaAATP em sequências específicas de DnaA-reativando (DARS): DARS1 e DARS216,17. Os cromossomas dados, DARS1, regiõese DARS2 são não-codificantes e agir em uma maneira semelhante ao acompanhante para modular DnaAATP/DnaAADP interconversão. Nestas regiões, localizadas fora a origem de replicação, permitem a montagem de um complexo de DnaA para qualquer a inactivação (dados; 14) ou ativação (DARS1 e DARS2; 17) de DnaA. Exclusão de DARS2 em uma célula não altera massa dobrando tempo mas resultados em replicação assíncrona iniciação15,16,18. No entanto, DARS2-células deficientes têm uma aptidão custo comparado a uma sua outra forma isogénicas durante ambas as competição de contínuo crescimento em meio rico, ou durante o estabelecimento da colonização do intestino de rato18. Isso indica que mesmo pequenas alterações na concentração de assincronia/origem tem um efeito negativo na aptidão bacteriana. Em e. coli, há uma pressão seletiva para manter a simetria (ou seja, dois braços de replicação de comprimento quase igual) de cromossomo19. Os dados, DARS1e DARS2 regiões têm a mesma distância relativa à orique em todas as e. coli estirpes sequenciadas18, apesar das grandes variações no tamanho do cromossoma.
Aqui, usamos a região de DARS2 de e. coli como exemplo para a identificação da posição cromossômica ideal para sua função. DARS2 foi inserido o transposon NKBOR e o resultante NKBOR::DARS2 transposon posteriormente inserido aleatoriamente no genoma de MG1655 ΔDARS2. Assim, geramos uma coleção de células, cada possuidor DARS2 colocados em um local diferente no cromossomo. Em vitro concorrência experimento, onde todas as células na coleção foram agrupadas e competiam entre si durante o crescimento contínuo em LB para um número estimado de 700 gerações, foi realizado. O resultado da experiência de competição foi monitorado/determinado usando o Southern blot, gene fácil caminhar e sequenciamento do genoma inteiro (WGS; A Figura 1). Clones de ponto de extremidade, resolvidos por gene fácil andar foram caracterizados por citometria de fluxo para avaliar parâmetros do ciclo celular. Em uma análise de fluxo cytometric, tamanho da célula, conteúdo de DNA e sincronia de iniciação podem ser medidos por um grande número de células. Durante citometria de fluxo, um fluxo de células únicas passa um feixe de luz de comprimento de onda apropriado para excitar o DNA manchado, então simultaneamente registado por photomultipliers que coletam a fluorescência emitida, uma medida do conteúdo de DNA, desde o as células são coradas para DNA. A luz difusa é uma medida da massa de célula20.
O experimento concorrência em vitro que apresentamos aqui é usado para abordar questões relacionadas com a importância da posição cromossômica e contexto genômico do elemento genético. O método é imparcial e fácil de usar.

<table><tbody><tr>Água <td></td><td>autoclavada Mili-Q</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes de Eletroporação, 0.1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser Sistema de Eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ágar LB, pó (Ágar Lennox L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Marca Fisher&nbsp; Placas de Petri de Plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; Tubos CryoTubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (2 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &micro; Kit</td> de Marcação de DNA Ci <td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>DECAprime II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro&nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Centrífuga Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle&nbsp; &nbsp; &nbsp; SF/MBV/03.46</td><td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich Centrífuga&nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2,0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Ultra Puro</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A tipo II</td><td>A Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sódiododecilsulfato (SDS)</td> <td>Merck</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0,5M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borato-EDTA tampão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>clorídricoSigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; 3MM papéis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20&times; Concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina - Fração V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxirribonucléico sal de sódio de testículos de salmão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp; BioMax &nbsp; filme leve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Kit de Extração de Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Kit de Limpeza PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp; Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotômetro</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Serva</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>Cefalexina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Mitramicina</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Apogee A10</td><td>Apogee</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de dna em escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por transposon

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

O ideal posição cromossômica (ões) de um determinado elemento de DNA foi/foram determinada por inserção aleatória mediada por transposon seguida pela seleção de aptidão. Em bactérias, o impacto do contexto genético na função de um elemento genético pode ser difícil de avaliar. Vários mecanismos, incluindo efeitos topológicos, interferência transcricional de genes vizinhos e/ou dosagem de gene associada a replicação, podem afetar a função de um determinado elemento genético. Aqui, descrevemos um método que permite a integração aleatória de um elemento do DNA no cromossomo da Escherichia coli e selecione os locais mais favoráveis, usando uma competição simples crescimento experimentar. O método aproveita-se de um sistema baseado em transposon bem-descrito de inserção aleatória, juntamente com uma seleção de clone(s) os mais aptos, pela vantagem de crescimento, um procedimento que é facilmente ajustável às necessidades experimentais. A natureza da clone(s) mais apto pode ser determinada pelo sequenciamento do inteiro-genoma sobre uma população clonal multi complexo ou pelo gene fácil caminhar para a rápida identificação de clones selecionados. Aqui, a região de DNA não-codificante DARS2, que controla a iniciação da replicação do cromossomo em e. coli, foi usada como um exemplo. A função de DARS2 é conhecida por ser afetado pela dosagem de gene associada a replicação; o mais perto DARS2 Obtém-se a origem da replicação do DNA, torna-se mais ativo. DARS2 foi inserido aleatoriamente o cromossomo de um DARS2-excluído estirpe. Os clones resultantes contendo inserções individuais foram agrupados e competiu contra o outro por centenas de gerações. Finalmente, os clones mais aptos foram caracterizados e encontrados para conter o DARS2 inserido em estreita proximidade com o local original de DARS2 .

Um borrão do Sul foi feito para verificar o que DARS2 foi distribuídas aleatoriamente o cromossomo na biblioteca transposon (t = 0) e que os clones mais aptos que persistem ao longo do tempo. O borrão do Sul foi realizado no DNA extraído do pool do transposon inicial (em t = 0) e cada 100 estimado de 700 gerações de concorrência (Figura 3). Aqui, o DNA celular total de cada time ponto foi digerido com o Pvuenzima de restrição, conhecida por ...

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a posição cromossômica ideal de qualquer elemento de DNA específico utilizando inserção aleatória mediada por transposons, experimentos de competição e sequenciamento completo do genoma. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de replicação do DNA, como a importância da localização cromossômica de um elemento genético. A vantagem desta técnica é que combina inserção aleatória baseada em transposons com a seleção do clone mais apto por vantagem de crescimento.Aqui, é simplificado pela região DARS2 de E. coli. Embora este método possa fornecer informações sobre a organização cromossômica de Escherichia coli, ele também pode ser aplicado a outras bactérias. Após o preparo de células eletrocompetentes, como MG1655 delta DARS2, de acordo com o protocolo descrito, adicione um micrograma de pNKBOR DARS2 a 40 microlitros de células e transfira a mistura para uma cubeta estéril pré-resfriada com entreferro de 0,2 centímetro.Insira a cubeta na câmara de eletroporação. Em seguida, realize a eletroporação das células a 18 quilovolts, 500 ohms e 25 microfarads. A constante de tempo deve ser de aproximadamente cinco milissegundos e não deve ocorrer arco elétrico.Recupere rapidamente a suspensão bacteriana ressuspendendo-a em um mililitro de caldo LB pré-aquecido e transfira para um tubo de ensaio de 15 mililitros. Incube as células sob condições de crescimento aerado a 37 graus Celsius por 30 minutos, sem seleção com antibiótico. Em seguida, plaque as bactérias em placas de ágar LB suplementadas com 50 microgramas por mililitro de canamicina e incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, conte as colônias provenientes da eletroporação. Uma colônia é considerada equivalente a uma inserção cromossômica de transposon. Adicione um mililitro de caldo LB a cada placa e remova todas as colônias.Reutilize o mesmo um mililitro de caldo LB para aumentar a concentração bacteriana. Em seguida, reúna todas as colônias no mesmo tubo de 50 mililitros. Vortexe o tubo para congelar o material inicial e misture um mililitro de suspensão celular com um mililitro de glicerol a 50% em gelo.Transfira os tubos para gelo seco durante 10 minutos. Uma vez que as culturas estejam congeladas, transfira-as para um congelador a menos 80 graus Celsius. Descongele a biblioteca de transposons de menos 80 graus Celsius em gelo.Misture por pipetagem, em seguida transfira 100 microlitros da biblioteca de transposons para 10 mililitros de LB em um tubo de ensaio de 15 mililitros. Incube as células com agitação contínua e aerada a 37 graus Celsius por oito horas até a fase estacionária. Ajuste os parâmetros conforme diferentes condições de crescimento, conforme desejado.Para propagar a população bacteriana a cada aproximadamente 10 gerações, transfira 10 microlitros da fase previamente estacionária para 10 mililitros de meio fresco pré-aquecido e cultive a cultura por mais oito horas até a fase estacionária. Após cada 100 gerações de competição, guarde cinco amostras de um mililitro e armazene-as a 80 graus Celsius negativos. Prepare a sonda para o Southern blot contra uma seção de um quilobase do NKBOR por amplificação PCR utilizando primers específicos, conforme listados aqui.Execute as amostras utilizando o seguinte programa. Marque o fragmento de PCR resultante com dATP marcado com P32 utilizando o sistema de iniciador aleatório conforme Smith e prepare o DNA celular total de acordo com o protocolo descrito no texto. Degrade o DNA celular total com Pvul, que corta o NKBOR contendo a região de interesse fora de uma região coberta pela sonda.Realize um blot de Southern utilizando gel de agarose 0,7% conforme descrito por Loebner-Olsen e von Freiesleben. Para utilizar a técnica de gene walking fácil a fim de identificar os sítios de inserção DARS2 a partir de clones individuais, após cerca de 700 gerações estimadas de competição, isole o DNA genômico para o molde de PCR primeiramente espalhando bactérias em uma placa de ágar LB e incubando a 37 graus Celsius durante a noite. Inocule caldo LB com colônias isoladas e cultive-as durante a noite a 37 graus Celsius.Em seguida, transfira 20 microlitros para 200 microlitros de água destilada autoclavada. Vortexe as colônias até completa solubilização e aqueça a mistura a 100 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugue as amostras à velocidade máxima por cinco minutos e guarde o lisado celular a menos 20 graus Celsius para uso futuro.Em seguida, projete três iniciadores aninhados para hibridarem dentro do transposon de escolha, conforme mostrado aqui. Use 200 nanogramas de DNA genômico, o iniciador aninhado um e um iniciador aleatório para preparar uma reação de PCR de 20 microlitros. Depois, execute as amostras usando o seguinte programa.Para a segunda amplificação, utilize um microlitro da primeira reação como molde e use o iniciador interno dois e o mesmo iniciador aleatório. Realize uma terceira reação de maneira semelhante utilizando o iniciador interno três, o mesmo iniciador aleatório e um microlitro da segunda reação como molde. Execute os produtos da reação final de PCR em um gel de agarose a 1,5% e visualize com brometo de etídio.Recorte uma faixa na faixa de 100 a 800 pares de bases e isole o DNA utilizando qualquer kit comercial de extração de gel de DNA, conforme as instruções do fabricante. Para realizar a citometria de fluxo, equilibre cada cultura bacteriana mantendo-a na fase de crescimento exponencial por pelo menos 10 gerações. Meça a DO600 e certifique-se de que nunca ultrapasse 0,3.Para realizar a saída de rifampicina conforme o protocolo descrito no texto, transfira um mililitro de cultura para um tubo de 15 mililitros contendo 30 microlitros de RIF-CEF. Incube o tubo a 37 graus Celsius com agitação por um mínimo de quatro horas. Para a amostra EXP, transfira um mililitro de cultura em crescimento exponencial para um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo.Em seguida, recolha as células por centrifugação a 15.000 × g e quatro graus Celsius durante cinco minutos. Re-suspenda o pellet em 100 microlitros de tris 10 milimolar gelado, pH 7,5, e adicione um mililitro de etanol 77% gelado. Armazene as amostras a quatro graus Celsius até o uso.Marque as células coletando de 100 a 300 microlitros de células fixadas por centrifugação a 15.000 vezes G durante 15 minutos. Remova o sobrenadante e use 130 microlitros da solução corante para DNA para ressuspender o precipitado. Em seguida, incube as amostras em gelo e no escuro por 10 minutos.Por fim, utilize citometria de fluxo para determinar a origem por célula, a massa celular relativa e o conteúdo relativo de DNA. Após a extração de DNA do pool inicial de transposons e a cada aproximadamente 100 das 700 gerações de competição, o DNA foi digerido com Pvul, que é conhecido por cortar o transposon NKBOR DARS2 uma única vez em uma região não coberta pela sonda, e foi realizada uma hibridização Southern. Como mostrado aqui, o pool inicial de DARS2 não apresentava bandas distintas, o que indica que o DARS2 foi inserido aleatoriamente ao longo do cromossomo.Com o tempo, surgiu um padrão no qual o conjunto inicial grande de clones DARS2 se desenvolveu em apenas um ou poucos clones DARS2 persistentes. O sequenciamento completo do genoma foi utilizado para identificar os locais de inserção do DARS2 a partir do conjunto inicial. E após 400, 500 e 700 gerações de competição em um subconjunto representativo com sequenciamento de inserção realizado, 98% de todas as inserções do DARS2 foram encontradas próximas à localização cromossômica do DARS2 do tipo selvagem.E 2% foram encontrados em outras regiões do cromossomo. Células deficientes em DARS2 já haviam demonstrado iniciar a replicação de forma assíncrona e apresentar uma diminuição na concentração de origens em relação às células selvagens. Aqui, a presença de um elemento DARS2 no terminador não restaura a sincronia nem o conteúdo celular de origens aos níveis selvagens, enquanto os clones DARS2 selecionados IR e RPPH realmente iniciam a replicação de forma sincronizada.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a posição cromossômica ideal de um determinado elemento de DNA. Isso é feito por meio de inserções aleatórias baseadas em transposons, seguidas por experimentos de competição e, finalmente, sequenciamento completo do genoma.

determination-optimal-chromosomal-location-s-for-dna-element

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos...

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Gerando bibliotecas de inserção de transposons em bactérias Gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento. J. Vis. (2020)Este vídeo demonstra a seleção, quantificação e preservação de bactérias receptoras Gram-negativas portadoras de inserções de transposons com base na resistência à canamicina.

Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Aqui, apresentamos um protocolo para nocautear um gene de interesse envolvido na conjugação de plasmídeos e, posteriormente, analisar o impacto de sua ausência usando ensaios de acasalamento. A função do gene é explorada para uma região específica de sua sequência usando deleção ou mutações pontuais.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

Apresentado aqui é um método simples para criar uma biblioteca de inserção alta densidade transposon em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Este protocolo permite a criação de uma coleção de centenas de milhares de mutantes exclusivos nas bactérias através da inserção de genômica aleatória de um transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Este é um método adaptado para identificar fatores de colonização de insetos candidatos em um simbionte benéfico da Burkholderia. O hospedeiro de besouro é infectado por uma biblioteca mutante aleatória gerada via mutagênese transposon, e a complexidade da biblioteca após a colonização é comparada a um controle cultivado in vitro.

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa

Aprenda a determinar a posição cromossômica ideal de elementos de DNA em Escherichia coli usando inserção mediada por transposon, experimentos de competição e sequenciamento de genoma completo. Este método avança a compreensão da organização cromossômica bacteriana.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon (Vídeo) | JoVE Journal

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

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