Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

O objetivo geral deste experimento é determinar a posição cromossômica ideal de qualquer elemento de DNA usando inserção aleatória mediada por transposons, experimentos de competição e sequenciamento do genoma completo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da replicação do DNA, como a importância da localização cromossômica de um elemento genético. A vantagem desta técnica é que acopla a inserção aleatória baseada em transposon com a seleção do clone mais apto por vantagem de crescimento.

Aqui, é simplificado pela região E.coli DARS2. Embora esse método possa fornecer informações sobre a organização cromossômica da Escherichia coli, ele também pode ser aplicado a outras bactérias. Depois de preparar células eletrocompetentes, como MG1655 delta DARS2 de acordo com o protocolo de texto, adicione um micrograma de pNKBOR DARS2 a 40 microlitros de células e transfira a mistura para uma cubeta estéril pré-resfriada de 0,2 centímetro.

Insira a cubeta na câmara de eletroporação. Em seguida, eletropore as células a 18 quilovolts, 500 ohm e 25 microfarad. A constante de tempo deve ser de cerca de cinco milissegundos e nenhum arco deve ocorrer.

Recupere rapidamente a suspensão bacteriana suspendendo-a novamente em um mililitro de caldo LB pré-aquecido e transfira para um tubo de ensaio de 15 mililitros. Incubar as células em condições de crescimento aerado a 37 graus Celsius por 30 minutos sem seleção de antibióticos. Em seguida, coloque as bactérias nas placas de ágar LB suplementadas com 50 microgramas por mililitro de canamicina e incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, conte as colônias da eletroporação. Uma colônia é considerada igual a uma inserção de transposon cromossômico. Adicione um mililitro de caldo LB a cada prato e lave todas as colônias.

Reutilize o mesmo mililitro de caldo LB para aumentar a concentração bacteriana. Em seguida, agrupe todas as colônias no mesmo tubo de 50 mililitros. Vortex o tubo para congelar o material de partida e misture um mililitro de suspensão celular com um mililitro de 50% de glicerol no gelo.

Transfira os tubos para gelo seco por 10 minutos. Depois que as culturas estiverem congeladas, transfira-as para um freezer negativo de 80 graus Celsius. Descongele a biblioteca de transposons de 80 graus Celsius negativos no gelo.

Misture por pipetagem e, em seguida, transfira 100 microlitros da biblioteca de transposons para 10 mililitros de LB em um tubo de ensaio de 15 mililitros. Cultive as células aeradas com agitação contínua a 37 graus Celsius por oito horas até a fase estacionária. Ajuste os parâmetros para diferentes condições de crescimento, conforme desejado.

Para propagar a população bacteriana aproximadamente a cada 10 gerações, transfira 10 microlitros da fase anteriormente estacionária para 10 mililitros de meio fresco pré-aquecido e cultive a cultura por mais oito horas até a fase estacionária. Após cada 100 gerações de competição, guarde cinco amostras de um mililitro e armazene-as em 80 graus Celsius negativos. Prepare a sonda para o Southern blot contra uma seção de um kilobyte do NKBOR por amplificação por PCR usando primers específicos, conforme listado aqui.

Execute os exemplos usando o programa a seguir. Rotule o fragmento de PCR resultante com dATP marcado com P32 usando o sistema de primer aleatório de acordo com Smith e prepare o DNA celular total de acordo com o protocolo de texto. Digerir o DNA celular total com Pvul, que corta o NKBOR contendo a região de interesse fora de uma região coberta pela sonda.

Realize um Southern blot usando gel de agarose a 0,7% de acordo com Loebner-Olsen e von Freiesleben. Para usar a caminhada fácil de genes para identificar locais de inserção de DARS2 de clones únicos, após 700 gerações estimadas de competição, isole o DNA genômico para o modelo de PCR, primeiro espalhando bactérias em uma placa de ágar LB e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Inocule o caldo LB com colônias únicas e cultive-as durante a noite a 37 graus Celsius.

Em seguida, transfira 20 microlitros para 200 microlitros de água destilada autoclavada. Transforme as colônias em solução e aqueça a mistura a 100 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugue as amostras na velocidade máxima por cinco minutos e, em seguida, guarde o lisado celular a 20 graus Celsius negativos para uso futuro.

Em seguida, projete três primers aninhados para recozer dentro do transposon de sua escolha, conforme mostrado aqui. Use 200 nanogramas de DNA genômico, primer aninhado um e um primer aleatório para preparar uma reação de PCR de 20 microlitros. Em seguida, execute os exemplos usando o programa a seguir.

Para a segunda amplificação, use um microlitro da primeira reação como modelo e use o primer aninhado dois e o mesmo primer aleatório. Realize uma terceira reação de maneira semelhante usando o primer aninhado três, o mesmo primer aleatório e um microlitro da segunda reação como o molde. Execute os produtos da reação final de PCR em um gel de 1,5% de agarose e estatina com brometo de etídio.

Corte uma faixa na faixa de 100 a 800 pares de bases e isole o DNA usando qualquer kit comercial de extração de gel de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Para realizar a citometria de fluxo, equilibre cada cultura bacteriana, mantendo-a na fase de crescimento exponencial por pelo menos 10 gerações. Meça o OD600 e certifique-se de que nunca exceda 0,3.

Para realizar o esgotamento da rifampicina de acordo com o protocolo de texto, transfira um mililitro de cultura para um tubo de 15 mililitros contendo 30 microlitros de RIF-CEF. Incube o tubo a 37 graus Celsius com agitação por no mínimo quatro horas. Para a amostra EXP, transfira um mililitro de cultura de crescimento exponencial para um tubo de 1,5 mililitro no gelo.

Em seguida, colha as células por centrifugação a 15.000 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tris gelado a 10 milimolares pH 7,5 e adicione um mililitro de etanol gelado a 77%. Armazene as amostras a quatro graus Celsius até o uso.

Manchar as células colhendo de 100 a 300 microlitros de células fixas por centrifugação a 15.000 vezes G por 15 minutos. Remova o sobrenadante e use 130 microlitros de solução de coloração de DNA para ressuspender o pellet. Em seguida, incube as amostras no gelo e no escuro por 10 minutos.

Finalmente, use citometria de fluxo para determinar a origem por célula, a massa celular relativa e o conteúdo relativo de DNA. Após a extração do DNA do pool inicial de transposons e a cada estimativa de 100 das 700 gerações de competição, o DNA foi cortado com Pvul, que é conhecido por cortar o transposon NKBOR DARS2 uma vez em uma região não coberta pela sonda e um Southern blot foi realizado. Como mostrado aqui, o pool inicial de DARS2 não tinha bandas distintas, o que mostra que o DARS2 foi inserido aleatoriamente em todo o cromossomo.

Com o tempo, surgiu um padrão em que o grande conjunto inicial de clones DARS2 se desenvolveu em apenas um ou alguns clones DARS2 persistentes. O sequenciamento do genoma completo foi usado para identificar os locais de inserção do DARS2 desde o pool inicial. E após 400, 500 e 700 gerações de competição em um subconjunto representativo de inserção sequenciada, 98% de todas as inserções de DARS2 foram encontradas perto da localização cromossômica DARS2 do tipo selvagem.

E 2% foram encontrados em outras partes do cromossomo. As células deficientes em DARS2 demonstraram anteriormente iniciar a replicação em sincronia e ter uma diminuição na concentração de origem em relação às células do tipo selvagem. Aqui, a presença de um elemento DARS2 no terminal não restaura a sincronia ou o conteúdo de origem celular para níveis de tipo selvagem, enquanto os clones DARS2 selecionados IR e RPPH iniciam a replicação em sincronia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a posição cromossômica ideal de um determinado elemento de DNA. Isso é feito por inserções aleatórias baseadas em transposons, seguidas por experimentos de competição e, finalmente, sequenciamento do genoma completo.