Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

O objetivo geral deste método é caracterizar o padrão de formação de embriões durante a embriogênese da planta usando o organismo modelo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da matéria vegetal, como a embriogênese em Arabidopsis. A principal vantagem desta técnica é que a formação de padrões embrionários na planta modelo Arabidopsis pode ser caracterizada pela operação recomendada.

Demonstrando o procedimento está Jinlin Feng, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione 100 sementes a um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de hipoclorito de sódio para esterilizar as sementes.

Inverta o tubo várias vezes para garantir que as sementes e a solução estejam bem misturadas. Após cinco minutos, centrifugar o tubo a 1200 Gs durante 30 segundos. Remova o sobrenadante e lave as sementes com água estéril quatro vezes para remover qualquer hipoclorito de sódio residual.

Em seguida, adicione 4,4 gramas de mistura de sal basal MS e 10 gramas de sacarose a um litro de água ultrapura. Mexa para dissolver o sal e a sacarose. Usando hidróxido de potássio em um mol, ajuste o pH da solução para 5,8.

Em seguida, adicione três gramas de agente gelificante e esterilize a solução a 121 graus Celsius por 15 minutos. Despeje 30 mililitros do meio MS resultante em uma placa de cultura de 12 centímetros. Coloque as sementes esterilizadas na placa MS.

Transfira o prato para a geladeira e mantenha-o quatro graus centígrados no escuro por três dias para estratificar as sementes. Em seguida, mantenha a placa em uma câmara de crescimento em condições de dias longos por oito dias. Em seguida, transfira as plantas para o solo em uma bandeja.

Cubra a bandeja com uma tampa branca transparente para evitar a perda de água. Deixando uma pequena lacuna para evitar a vitrificação das plantas. Após cinco dias, remova a tampa e cultive as plantas em uma câmara walk-in em condições de dias longos.

Após cerca de 20 dias de crescimento, use um fio para marcar de 10 a 15 botões de flores na posição dos caules das sementes e da inflorescência às 20:00. Defina o início da polinização do óvulo quando os botões marcados se abrirem para florescer às 8:00 da manhã seguinte. Para começar a preparar a solução de Hoyer, adicione 24 gramas de cloridrato a um tubo de 50 mililitros. Enrole o tubo completamente em papel alumínio, certificando-se de que o papel alumínio veda toda a luz.

Adicione nove mililitros de água ultrapura e três mililitros de glicerol. Agite o tubo para dissolver o cloridrato. Em seguida, deixe a solução de Hoyer preparada repousar durante a noite em temperatura ambiente para eliminar quaisquer bolhas.

Para começar, prenda um pedaço de fita adesiva dupla face a uma lâmina de vidro de microscópio. Coloque um silique, cultivado pelo número desejado de dias após a polinização, no lado com o pseudosepto perpendicular à superfície. Usando uma agulha de seringa, divida os carpos em ambos os lados do pseudosepto.

Em seguida, prenda os dois carpos dissecados à lâmina para que os óvulos e a sílica fiquem visíveis sob um estereoscópio. Dispense 70 microlitros da solução de Hoyer na lâmina de vidro. Em seguida, mergulhe uma pinça de ponta fina na solução para umedecer a ponta.

Usando o estereoscópio e a pinça, mova os óvulos para a solução de Hoyer para limpar os embriões. Depois disso, aplique suavemente uma lamínula na lâmina, certificando-se de não gerar bolhas. Colocou a lâmina acabada em uma caixa em uma sala escura por duas a 12 horas em temperatura ambiente.

Após o tempo necessário, use a função DIC do microscópio para examinar os óvulos limpos. Localize os embriões em um campo de baixa potência e, em seguida, mude para um campo de alta potência para observar o padrão celular nos embriões desenvolvidos. Em seguida, examine os embriões em diferentes estágios de desenvolvimento.

Para começar, prepare o plasmídeo DR5 GFP e introduza-o nas plantas do tipo selvagem por transformação mediada por agrobacterium para metassians, conforme descrito no protocolo de texto. Selecione as plantas T1 usando placas médias MS contendo hidrolisina. Em seguida, transfira e cultive as plantas conforme descrito no protocolo de texto para obter plantas T3.

Usando um fio, marque os botões florais da planta homozigótica T3 na posição dos caules das sementes na inflorescência às 20:00. Depois disso, misture três mililitros de glicerol com 47 mililitros de água ultrapura para gerar uma solução de glicerol a 6%. Em seguida, prenda um pedaço de fita adesiva dupla face a uma lâmina de vidro de microscópio. Coloque a sílica de uma planta T3 na lâmina com o pseudosepto perpendicular à superfície.

Usando uma agulha de seringa, divida os carpos em ambos os lados do pseudosepto. Prenda os dois carpos dissecados à lâmina de modo que os óvulos e o silique fiquem visíveis sob um estereoscópio. Em seguida, dispense 30 microlitros de glicerol a 6% na lâmina.

Mergulhe uma pinça de ponta fina na solução para umedecer a ponta. Usando o estereoscópio e uma pinça, mova os óvulos para a solução de glicerol. Coloque delicadamente uma lamínula na corrediça.

Em seguida, bata na lâmina de forma rápida e suave para expulsar o embrião do óvulo. Depois disso, use microscopia confocal de varredura a laser para examinar a lâmina quanto à fluorescência de proteína fluorescente verde. Encontre os embriões isolados em um campo de baixa potência e registre sua localização.

Mude para um campo de alta potência e defina a fonte de luz de excitação para 488 nanômetros para observar a expressão de GR5 GFP nos embriões. Em seguida, detecte a expressão de GFP e caracterize a formação do padrão embrionário conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a embriogênese em Arabidopsis é observada via depuração do óvulo, como pode ser visto.

Após a depuração do óvulo, os embriões em diferentes estágios de desenvolvimento são distinguíveis usando microscopia de contraste de interferência diferencial. O padrão de expressão de GR5 GFP durante a embriogênese é então registrado sob microscopia confocal de varredura a laser. DR5 é visto como expresso no pólo radicular dos embriões globulares e em forma de coração do tipo selvagem.

DR5 é visto expresso nas pontas dos cotilédones embrionários e na vasculatura de embriões maduros do tipo selvagem. Depois disso, o papel do naa10 em Arabidopsis durante a embriogênese está examinando-o. A hipótese observada é dividida de forma anormal, com divisão torta e vertical em naa10 em comparação com a divisão assimétrica transversal em plantas selvagens.

Como visto aqui, os bois têm distribuição quase uniforme na maioria dos embriões naa10 no estágio globular e retêm um sinal mais amplo nas hipóteses em comparação com os embriões do tipo selvagem. Esses resultados indicam que naa10 é necessário para a embriogênese e que pode ser envolvido através da via de sinalização de bois em Arabidopsis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar como cultivar Arabidopsis como material vegetal.

Após este procedimento, outras medidas, como a hibridização in-situ, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como a expressão de genes específicos da célula. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da embriogênese explorarem o mecanismo molecular pelo qual genes específicos medeiam a embriogênese em Arabidopsis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como caracterizar a embriogênese em Arabidopsis.