Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar como sequenciar o DNA metagenômico do solo usando uma metodologia de sequenciamento de nanoporos. Esse método pode ajudar os educadores a introduzir o sequenciamento de DNA em um ambiente de sala de aula e fornecer geração em tempo real de novos dados de sequenciamento de DNA para análise. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, acessível e requer o mínimo de equipamento de laboratório.

Essa técnica também dá aos alunos a oportunidade de usar ferramentas de bioinformática mais sofisticadas que geralmente estão disponíveis nas aulas de laboratório. Este protocolo curto funciona com um kit de sequenciamento rápido. Para começar, adicione 200 nanogramas de DNA de alto peso molecular em um tubo de parede fina de 0,2 mililitro e complete o volume com água destilada para 7,5 microlitros.

Em seguida, adicione 2,5 microlitros de mistura de fragmentação do kit e misture o tubo suavemente usando inversões. Em seguida, use um pulso de centrifugação para girar o conteúdo dos tubos. Agora transfira o tubo para um termociclador para um ciclo de um minuto a 30 graus Celsius, seguido por um segundo ciclo de um minuto a 75 graus Celsius.

Em seguida, gire o tubo novamente. Para completar a biblioteca adaptada e amarrada, adicione um microlitro de adaptador rápido e 0,2 microlitros de master mix de ligase sem corte/TA. Em seguida, use a inversão para misturar o tubo, seguida por outro giro de pulso e armazene o tubo no gelo.

Primeiro, configure o sequenciador, remova a célula de fluxo de sua embalagem e conecte-a ao sequenciador portátil em tempo real. Em seguida, conecte o sequenciador a um computador usando o cabo USB e inicie o software de sequenciamento. No software, selecione o comando iniciar dispositivo e escolha a opção para plataforma QC.

Em seguida, pressione executar para executar o controle de qualidade. Após cerca de sete minutos, a execução do controle de qualidade estará concluída. O realce verde na leitura indica que existem poros ativos disponíveis para sequenciamento de DNA.

São necessários pelo menos 800 poros ativos. Agora vá para a caixa de diálogo. No campo ID da amostra, insira o nome da amostra a ser sequenciada.

Para o ID da célula de fluxo, insira o código encontrado no adesivo anexado à parte superior da célula de fluxo. Agora abra a tampa do sequenciador e deslize a tampa da porta de escorva para a esquerda para acessar a porta. Agora remova alguns microlitros de buffer, incluindo uma pequena bolha que está frequentemente presente.

Agora faça buffer suficiente para preencher a matriz de sensores. Prepare um mililitro de tampão de primer bem misturado feito na hora. Em seguida, adicione 800 microlitros de tampão de escorva e aguarde cinco minutos.

Após cinco minutos, adicione os 200 microlitros restantes de tampão de escorva. Para preparar a biblioteca para carregar, resfrie RBF1 e LLB no gelo junto com a biblioteca adaptada e amarrada. Em seguida, ao novo tubo de centrífuga de 0,2 mililitro, adicione 25,5 microlitros de RBF1 e 12 microlitros de água livre de núcleo à temperatura ambiente.

Em seguida, misture o LLB com a trituração da pipeta, pegue uma alíquota de 26,5 microlitros e adicione-a ao tubo com RBF1 diluído. Misture os reagentes usando mais trituração para evitar que as esferas internas se assentem. Agora adicione 11 microlitros da biblioteca adaptada e amarrada e misture o tubo suavemente usando inversão.

Em seguida, use um giro de pulso para agrupar a amostra. Ao evitar as contas, pegue 75 microlitros da amostra e adicione-a ao local na queda da porta. Certifique-se de que cada gota flua para a porta antes de adicionar a próxima.

Ao carregar a amostra, é vital que cada gota entre na porta antes que a próxima seja adicionada. Também é importante evitar ressuspender os grânulos ao carregar a porta de amostra, o que pode entupir a porta. Agora recoloque a tampa da porta de amostra, certificando-se de que o tampão entre na porta.

Em seguida, recoloque a tampa do dispositivo e prossiga com a execução da opção de execução de sequenciamento de 48 horas selecionada por meio do software. O uso do procedimento descrito fornece um método rápido e barato para sequenciar o DNA do solo para fins educacionais. As execuções normalmente renderam mais de 125.000 leituras, com média de mais de 5.000 pares de bases.

Cada corrida recebeu uma pontuação de qualidade para selecionar as mais úteis para análise posterior. Em seguida, cada aluno submeteu 50 sequências de pelo menos 350 nucleotídeos à análise BLASTN ou BLASTX para identificar o organismo da amostra. Organismos identificados com valores de e inferiores a 0,0004 são considerados correspondências fortes.

Muitas sequências submetidas ao BLASTN foram incomparáveis e feitas relacionadas a novos organismos. O BLASTX revelou várias proteínas de organismos não representados na análise do BLASTN. De interesse: Endopeptidase e proteínas semelhantes à ATPase foram identificadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e analisar o DNA do solo para sequenciamento usando a tecnologia de sequenciamento de nanoporos. Este protocolo pode ser concluído em duas horas e meia, requer equipamento mínimo de laboratório ou conhecimento técnico e pode ser concluído em sala de aula. Ao tentar e concluir este procedimento, é importante lembrar de canalizar os reagentes com cuidado, misturar bem as amostras e centrifugar as amostras entre as etapas para evitar a perda de amostras.