Name: Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprenda a gerar grânulos condrogénicos a partir de células iPSCs derivadas de sangue do cordão umbilical. Este protocolo permite a produção em larga escala para modelagem de doenças, triagem de fármacos e estudos em medicina regenerativa.

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Este trabalho foi apoiado por uma doação do projeto de pesquisa e desenvolvimento em tecnologia de saúde da Coréia, Ministério da Saúde, Assistência e Assuntos Familiares, República da Coréia (HI16C2177).

Este protocolo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861). Os CBMCs utilizados para a reprogramação foram obtidos diretamente do Cord Blood Bank do Seoul St. Mary&#39;s Hospital. 1. Diferenciação condrogênica de iPSCs <ol><li> Geração CBMC-iPSC <ol><li> Gerar CBMC-hiPSCs usando o protocolo mostrado em nosso trabalho anterior 23 . </li><li> Colecione as células sanguíneas em um tubo cônico de 15 mL e conte-as usando um hemocitômetro. </li><li> Prepare 3 x 10 5 células e centrifugá-las por 5 minutos a 515 xg e RT. Descarte o sobrenadante por sucção e ressuspenda as células em 0,5 mL de meio de células sanguíneas. </li><li> Transfira as células para um poço de uma placa não revestida de 24 poços e adicione a mistura de vírus Sendai, seguindo as recomendações do fabricante. </li><li> Centrifugue a placa por 30 min a 1.150 xg e 30 ° C. </li><li> AtrásPor centrifugação, incubar as células durante a noite (O / N) a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> No dia seguinte, transfira as células transduzidas para um poço revestido com matriz. Centrifugue a placa a 1.150 xg durante 30 min a 30 ° C. </li><li> Após a centrifugação, remova o sobrenadante, adicione 1 mL de meio iPSC e mantenha as células O / N a 37 ° C em 5% de CO 2 . </li><li> Manter as células anexadas a 37 ° C e 5% de CO 2 . Mude o meio diariamente, substituindo-o por meio de iPSC fresco. NOTA: As colônias aparecerão no dia 14-21 após a transdução. </li></ol></li><li> Geração EB <ol><li> Manter o hiPSCs a 37 ° C e 5% de CO 2 . Mude o meio diariamente, substituindo-o pelo meio essencial Essential 8 (E8). </li><li> Prepare 2 x 10 6 hiPSCs em uma placa revestida de vitronectina de 100 mm em meio E8. </li><li> Retire o meio E8 do prato de cultura e lave com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). </li><li> Adicione 1ML de ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (EDTA) e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Colher as células com 3 mL de meio E8 e transferi-las para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 250 xg à temperatura ambiente (RT) durante 2 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular e ressuspender as células em 5 mL de meio E8. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro e preparar 2 x 10 6 células para cada 100 mm de placa de Petri. Ressuspender as células preparadas em uma mistura de 10 mL de meio E8 e EB (1: 1) com 10 μM de inibidor de quinase associada a rho (ROCK). </li><li> Incube as células O / N para agregação a 37 ° C e 5% de CO 2 . </li><li> No dia seguinte, colhe os EBs agregados por pipetagem. Centrifugar as células a 250 xg durante 1 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda os EBs em 10 mL de meio E8 fresco. </li><li> Amplie os EBs gerados por 5 dias, realizando mudanças diárias com fresH E8 médio. Para uma maior maturação, mude o meio de cultura para o meio E7. Manter os EBs a 37 ° C e 5% de CO 2 por mais 5 dias, realizando mudanças médias diárias com meio E7 fresco. NOTA: O meio E7 é meio E8 sem FGF2. </li></ol></li><li> Indução de células de crescimento de EBs <ol><li> Adicionar 6 mL de gelatina a 1% a uma placa de 100 mm e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 min. </li><li> Retire a gelatina e retire o prato completamente por 2-3 h antes de usar. </li><li> Transfira os EBs para um tubo cônico de 50 mL. Permita que os EBs se instalem na parte inferior do tubo cônico. Remova o sobrenadante sem perturbar os EBs. </li><li> Ressuspender os EBs em 10 mL do Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 20% de soro bovino fetal (FBS). Transfira os EBs para o prato 100 mm revestido com gelatina. Adicionar 10 μM ROCK inibidor. </li><li> Incubar e manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 7 dias. Mudar temaDiariamente, sem adição de inibidor de ROCK. </li></ol></li><li> Formação de grânulos condrogénicos <ol><li> Aspirar o meio de cultura do prato e lavar as células três vezes com PBS. </li><li> Aplicar 1 mL de EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Colher as células usando 5 mL de DMEM com 20% de FBS e transferi-las para um novo tubo cônico de 15 mL. </li><li> Centrifugar as células por 2 minutos a 250 xg e RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o grânulo em 10 mL de DMEM com FBS a 20%. </li><li> Filtre e descarte os aglomerados de células usando um filtro de células de 40 μm e colhe as células individuais. Contar as células individuais usando um hemocitômetro. </li><li> Centrifugar as células por 2 minutos a 250 xg e RT. Remova o sobrenadante e semeie 3 x 10 5 células por pelotização em um tubo cônico de 15 mL com 300 μL de meio de diferenciação condrogênica (MDL). </li><li> Para a formação de pelozes, centrifugar as células por 5 min a680 xg e RT. NOTA: Os grânulos são mantidos em tubos cônicos de 15 mL durante a diferenciação dos grânulos condrogénicos. </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2 . </li><li> Altere o MDL a cada 2-3 dias. Dentro de 3 dias, os grânulos exibirão morfologias esferóides achatadas e esferoidais. Manter as pastilhas por 21 dias a 37 ° C e 5% de CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. Caracterização de pelozes condrogénicas por coloração <ol><li> Incorporação condrogênica <ol><li> Antes de incorporar, preparar e derreter a parafina a 58 ° C. </li><li> Corrigir os grânulos em 1 mL de paraformaldeído a 4% durante 2 h à TA em um tubo de 1,5 mL. Atenção: o paraformaldeído é altamente tóxico. Evite o contato com os olhos, a pele ou as mucosas. Minimize a exposição e evite a inalação enquanto a prepara. </li><li> Coloque uma camada de gaze na cassete e transfira as pastilhas fixas usando uma pipeta. Cubra a pelota dobrandoFaça uma gaze e feche a tampa da cassete. </li><li> Inicie a desidratação em 100 mL de etanol a 70% (EtOH) duas vezes, 10 min cada. Desidratar os grânulos através de lavagens sequenciais de 10 minutos em 80% e EtOH a 95%. </li><li> Transfira os grânulos para 100% de EtOH durante 10 min. Repita três vezes com EtOH fresco. </li><li> Para &quot;limpeza&quot;, troque a solução para uma mistura de 100 mL, 1: 1 de EtOH e xileno, seguido de uma mistura 1: 2 de EtOH e xileno durante 10 min cada. Limpe o EtOH restante incubando os grânulos duas vezes em 100% de xileno, 10 min cada. </li><li> Para infiltração de parafina, incubar os grânulos em misturas sequenciais de xileno e parafina. Execute todo o processo de infiltração de parafina a 58 ° C. Incubar os grânulos em 100 mL de uma mistura 2: 1 de xileno e parafina durante 30 min. </li><li> Troque a solução para 100 mL de uma mistura 1: 1 de xileno e parafina e incube durante 30 min. </li><li> Troque a solução para 100 mL de uma mistura 1: 2 de xileno e parafina e incube por 30 min. </li><li> Para a infiltração final, transfira os grânulos para o primeiro banho de parafina 100% e incube durante 2 h. </li><li> Transferir os grânulos para o segundo banho de parafina 100% e incubar O / N a 58 ° C. </li><li> No dia seguinte, transfira suavemente os grânulos para um molde usando uma pinça. Adicione a parafina ao molde do dispensador de parafina. Solidifique a parafina durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Cortar as secções a 7 μm e transferir as seções para o slide. Deixe as lâminas secar durante a noite e guarde as lâminas na RT até que estejam prontas para uso. </li></ol></li><li> Preparação da corrediça <ol><li> Desparafinize as lâminas movendo-as através de 100 mL de 100%, 90%, 80% e 70% de EtOH sequencialmente durante 5 minutos cada. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 5 min. </li></ol></li><li> Coloração azul alcian <ol><li> Incubar as lâminas em 50 mL de solução alcian azul a 1% durante 30 min. NÃOE: Azul alcalino é diluído em solução a 3% de ácido acético. Ajuste o pH para 2,5 usando ácido acético. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 2 min. </li><li> Enxágüe as lâminas em água desionizada (DW) e compareça com solução nuclear rápida por 2 min. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 1 min. </li><li> 2.3.5) Proceda para desidratar e montar as lâminas no passo 2.6. </li></ol></li><li> Mancha de azul de toluidina <ol><li> Incubar lâminas em 50 mL de solução de azul de toluidina durante 4 min. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 5 min. </li><li> Proceda para desidratar e montar as lâminas no passo 2.6. </li></ol></li><li> Coloração imuno-histoquímica <ol><li> Incubar as lâminas em 3% de H 2 O 2 durante 15 min para o bloqueio da peroxidase endógena. </li><li> Aplicar 200 μL de anticorpo primário (anti-COL1A1 e -COL2A1) diluído 1: 100 em tris-buSoro férreo (TBS) contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de cabra normal (NGS) para as lâminas e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, coloque as lâminas em uma jarra de vidro e lave-os com 50 mL de TBS contendo 0,1% de polissorbato 20 (TBST) três vezes por 5 minutos cada. </li><li> Aplicar 200 μL de anticorpo secundário (anticorpo IgG de cabra anti-coelho, diluído 1: 200 em TBS contendo 1% de BSA e 5% NGS) para as lâminas e incubar à TA durante 40 min. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e lave-as três vezes com 50 mL, 5 minutos cada. </li><li> Para amplificação de sinal, aplique solução de estreptavidina conjugada com HRP para as lâminas e incube durante 10 min. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e lave-as três vezes com 50 mL, 5 minutos cada. </li><li> Misture a solução de substrato DAB-peroxidase, aplique 200 μL de solução a cada lâmina e incube durante 1 min. </li><li> Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 5 min. </li><li> CounterstainCom hematoxilina de Mayer durante 1 min. </li><li> Lave as lâminas com DW. </li><li> Proceda para desidratar e montar as lâminas no passo 2.6. </li></ol></li><li> Desidratação e montagem <ol><li> Desidratar os slides movendo-os sequencialmente através de 100 mL de 70%, 80%, 90% e 100% EtOH, 30 s cada. </li><li> Mergulhe os slides em duas mudanças de xileno durante 1 min cada. </li><li> Adicione 50 μL de solução de montagem aos lamínulas e coloque as lâminas na parte superior. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo gerou com êxito hiPSCs de CBMCs. Nós reprogramamos CBMCs para HiPSCs usando um vetor viral Sendai contendo fatores Yamanaka 24 . Três casos foram utilizados na diferenciação, e todas as experiências geraram com sucesso grânulos condrogénicos usando este protocolo. Numerosos estudos relataram protocolos para a diferenciação de hiPSCs em condrócitos 25 , 26 , 27 , <sup class="xref...

O uso de hiPSCs representa uma nova estratégia para rastreamento de drogas e estudos mecanicistas de várias doenças. Do ponto de vista regenerativo, os hiPSCs também são uma fonte potencial para a substituição de tecidos danificados que têm capacidade de cura limitada, como a cartilagem articular 1 , 2 . A regeneração da cartilagem articular nativa tem sido um desafio há várias décadas. A cartilagem articular é um tecido macio e branco que abaixa a extremidade dos ossos, protegendo-os da fricção. No entanto, tem habilidade regenerativa limitada quando danificada, o que torna o auto-reparo quase impossível. Portanto, as pesquisas voltadas para a regeneração da cartilagem estão em curso há várias décadas. Anteriormente, a diferenciação in vitro na linhagem condrogênica geralmente era realizada com BMSC ou condrocitos nativos isolados da articulação do joelho 3 . Devido tO seu potencial condrogênico, BMSCs e condrócitos nativos têm inúmeros méritos que suportam seu uso na condrogênese. No entanto, devido à sua expansão limitada e fenótipo instável, essas células enfrentam várias limitações na reconstrução de defeitos da cartilagem articular. Sob condições de cultura in vitro , essas células tendem a perder suas próprias características após 3-4 passagens, o que eventualmente afeta suas habilidades de diferenciação 4 . Além disso, no caso de condrócitos nativos, danos adicionais na articulação do joelho são inevitáveis ​​na obtenção dessas células. Ao contrário de BMSCs ou condrócitos nativos, os hiPSCs podem expandir-se indefinidamente in vitro . Com as condições de cultura adequadas, os hiPSCs têm um grande potencial como fonte de substituição para a diferenciação condrogênica. No entanto, é um desafio mudar as características intrínsecas dos hiPSCs 5 . Além disso, é necessário vários in vitro complicadosPs para direcionar o destino dos hiPSCs para um tipo de célula específico. Apesar dessas complicações, o uso de HiPSCs ainda é recomendado devido às suas altas habilidades de auto-renovação e sua capacidade de se diferenciar em células específicas, incluindo condrócitos 6 . A diferenciação condrogénica é geralmente feita com sistemas de cultura tridimensionais, como a cultura de pelotização ou a cultura de micromassas, usando células progenitoras semelhantes a MSC. Se estiver usando o HiPSCs, o protocolo para gerar células progenitoras do tipo MSC difere dos protocolos existentes. Alguns grupos usam cultura monocamada de hiPSCs para converter diretamente o fenótipo em células tipo MSC 7 . No entanto, a maioria dos estudos usa EBs para gerar células de crescimento que se assemelham aos MSC 8 , 9 , 10 , 11 . Vários tipos de fatores de crescimento são usados ​​para induzir ChondrogeNesis. Geralmente, as proteínas da família BMP e TGFβ são usadas, sozinhas ou em combinação. A diferenciação também foi induzida com outros fatores, como GDF5, FGF2 e IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . Foi demonstrado que TGFβ1 estimula a condrogênese de uma maneira dose-dependente em MSCs 16 . Comparado com o outro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induz condrogênese, aumentando a condensação da célula pré-cartilagea mesenquimatosa.TGFβ3 induz condrogênese aumentando significativamente a proliferação celular mesenquimatosa 17 . No entanto, o TGFβ3 é utilizado mais frequentemente por pesquisadores do que TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 aumenta a expressão de genes relacionados aos componentes da matriz condrogênica em humanosCondrócitos articulares sob condições in vitro 20 . BMP2 aumenta a expressão de genes críticos para a formação de cartilagem em MSCs em combinação com proteínas TGFβ 21 . Também foi demonstrado que BMP2 melhora sinergicamente o efeito do TGFβ3 através das vias Smad e MAPK 22 . Neste estudo, os CBMC-hiPSCs foram agregados em EBs usando meio EB em uma placa Petri de baixo valor. As células de ultrapassagem foram induzidas ao unir os EBs a um prato revestido com gelatina. A diferenciação condrogénica utilizando células secundárias foi realizada por cultura de pelota. O tratamento com BMP2 e TGFβ3 condensou com sucesso as células e induziu a acumulação de proteína da matriz extracelular (ECM) para a formação de grânulos condrogénicos. Este estudo sugere um protocolo de diferenciação condrogénica simples, mas eficiente, usando CBMC-hiPSCs.

<table><tbody><tr><td><forte>Plásticos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Prato</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cornical de 50 mL</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cornical de 15 mL</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Descartável de 10 mL</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta descartável</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Descrição</td></tr><tr><td>E8 Materiais médios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Médio (500 mL)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Médio (Conc.: 543 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Selenito de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Médio&nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Meio Transfferin Sigma</td><td>Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Humano (Conc.: 10.7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Médio (Conc.: 20 &mu; g/mL)</td></tr> <tr><td>TGF humano&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Médio (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Médio&nbsp; (Conc.: 64 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Descrição</td></tr><tr><td>< forte> materiais de controle de qualidade< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>18 mm Vidro de cobertura</td><td>superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Inovação</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr>Laboratório <td>de vetor</td> de<td>albumina de soro bovino</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo IgG (H+L) de cabra Ponta</td> de <td>prova molecular</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo IgG (H+L) de cabra anti-coelho</td><td>Sonda molecular</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr>A <td>ponta de prova molecular</td><td>D1306</td><td></td>de <td>DAPI</td></tr><tr><td>prolonga a</td> tecnologia de <td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td> do reagente do antifade <td>do ouro & Inovação</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr>Laboratório <td>de Vetor</td> de<td>Albumina de Soro Bovino</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Colágeno II</td><td>anticorpo abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alcian azul</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear vermelho rápido</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>xileno</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina de Mayer</td><td>Indústrias químicas puras wako</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Vidro da corrediça, revestido</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Isopripílico</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Síntese de cDNA de Fita RevertAid First Strand</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td> Descrição</td></tr><tr><td>Materiais de diferenciação condrogênica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Componente de mídia condrogênica (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Componente de meio condrogênico (Conc.: 64 &mu; g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 100 ng / ml)</td></tr> <tr><td>Hman TGF-beta3 recombinante</td><td>R & D</td><td>243-B3-002</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 10 ng / ml)</td></tr> <tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)</td></tr> <tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)</td></tr> <tr><td>Dexametasona-Solúvel em água&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.:10-7 M)</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Mídia condrogênica componente (40 &mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

A cartilagem articular humana não possui a capacidade de se reparar. A degeneração da cartilagem é assim tratada não por curativo, mas por tratamentos conservadores. Atualmente, estão sendo feitos esforços para regenerar a cartilagem danificada com condrócitos expandidos ex vivo ou células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs). No entanto, a viabilidade restrita e a instabilidade destas células limitam a sua aplicação na reconstrução da cartilagem. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) receberam atenção científica como uma nova alternativa para aplicações regenerativas. Com capacidade de auto-renovação ilimitada e multipotência, os hiPSCs foram destacados como uma nova fonte celular de substituição para o reparo da cartilagem. No entanto, a obtenção de uma grande quantidade de grânulos condrogénicos de alta qualidade é um desafio importante para a sua aplicação clínica. Neste estudo, utilizamos células de crescimento indireto do corpo embrionário (EB) para diferenciação condrogênica. A condrogênese bem sucedida foi confirmada por PCR eD coloração com azul alciano, azul de toluidina e anticorpos contra os tipos de colágeno I e II (COL1A1 e COL2A1, respectivamente). Nós fornecemos um método detalhado para a diferenciação de iPSCs derivadas de células mononucleares de sangue do cordão umbilical (CBMC-hiPSCs) em pellets condrogênicos.

Neste estudo, geramos grânulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs induzindo células de crescimento de EBs. A diferenciação condrogênica foi induzida usando CBMC-hiPSCs com alta pluripotência confirmada 11 . Um esquema simples de nosso protocolo é mostrado na Figura 1A . Antes da diferenciação, as colônias iPSC foram expandidas ( Figura 1B ). Os iPSC expandidos foram montados como EBs para iniciar a diferenciaçã...

Aqui, propomos um protocolo para a diferenciação condrogênica das células-tronco pluripotentes induzidas por células derivadas de células mononucleares do sangue do cordão umbilical.

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar pelotas condrogênicas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de sangue do cordão umbilical. Com este protocolo, podemos gerar uma quantidade relativamente grande de pelotas condrogênicas. As pelotas condrogênicas geradas podem ser utilizadas em estudos ou modelagem de doenças, triagem de fármacos e pesquisa translacional para aprimorar nossa compreensão da natureza da cartilagem.A cartilagem humana do ano passado atrasou-se na reparação. Portanto, a degeneração da cartilagem deve ser tratada por meio de tratamento conservador. Com capacidade ilimitada de autorrenovação e pluripotência, as iPSCs humanas têm sido destacadas como uma nova fonte celular de substituição para a reparação da cartilagem.Quem demonstrará o procedimento serão Eugene Nam e Arie Alice Ream, alunos de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar o protocolo, colete as células sanguíneas em um tubo cônico de 15 mililitros e conte-as utilizando um hemocitômetro. Prepare três vezes 10 à quinta células e centrifugue-as por cinco minutos a 515 vezes G, em temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante por sucção e re-suspenda as células em 0,5 mililitros de meio para células sanguíneas. Em seguida, transfira as células para um poço de uma placa de 24 poços não revestida e adicione a mistura do vírus Sendai seguindo as recomendações do fabricante. Centrifugue a placa por 30 minutos a 1.150 × g e 30 °C.Após a centrifugação, incubar as células durante a noite. No dia seguinte, transferir as células do transudato para um poço codificado com matriz. Centrifugar a placa.Após a centrifugação, remova o sobrenadante, adicione um mililitro de meio iPSC e mantenha as células. Troque o meio diariamente e substitua-o por meio iPSC fresco. Mantenha as células-tronco pluripotentes induzidas humanas, ou HIPSCs.Troque o meio diariamente, substituindo-o por meio essencial oito fresco, ou meio E8. Prepare duas vezes 10 à 6ª potência de HIPSCs em um meio E8 de 100 mililitros codificado com vitronectina. Em seguida, remova o meio E8 da placa de cultura e lave as células com solução salina tamponada com fosfato estéril, ou PBS.Adicione um mililitro de um milimolar de EDTA e incube a placa por dois minutos. Em seguida, recolha as células com três mililitros de meio E8 e transfira-as para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 250 vezes G, à temperatura ambiente, por dois minutos.Aspire o sobrenadante sem perturbar o palato celular e re-suspenda as células em cinco mililitros de meio E8. Após contar as células com um hemocitômetro, prepare duas vezes 10 à 6ª potência de células para cada placa de Petri de 100 milímetros. Re-suspenda as células preparadas em 10 mililitros de uma mistura um para um de meio E8 e meio EB, contendo 10 micromolar de inibidor de rock (row associated carnase, ou inibidor de rock).Incube as células durante a noite para agregação. No dia seguinte, colete os EBs agregados por pipetagem. Remova o sobrenadante e re-suspenda os EBs em 10 mililitros de meio E8 fresco.Aumente os EBs gerados por cinco dias, realizando trocas diárias com meio E8 fresco. Para maturação adicional, mude o meio de cultura para o meio E7. Mantenha os EBs a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por mais cinco dias, realizando trocas diárias do meio com meio E7 fresco.Adicione seis mililitros de gelatina 1% a uma placa de 100 milímetros e incube a placa por 30 minutos. Remova a gelatina e seque completamente esta placa por duas a três horas antes do uso. Transfira os EBs para um tubo cônico de 50 mililitros.Deixe os EBs sedimentarem no fundo do tubo cônico. Remova o sobrenadante sem perturbar os EBs. Em seguida, re-suspenda os EBs em 10 mililitros de meio essencial modificado de Dulbecco, ou DMEM, pré-aquecido, contendo 20% de soro bovino fetal, ou FBS.Transfira os EBs para a placa de 100 milímetros com revestimento de gelatina. Adicione 10 micromolar do inibidor de rock. Incube e mantenha as células por sete dias.Troque o meio a cada dois dias sem adicionar inibidor de rock. Aspire o meio de cultura do recipiente. Aplique imediatamente um mililitro de EDTA de um milimolar no recipiente e incube as células por dois minutos.Em seguida, recolha as células utilizando cinco mililitros de DMEM com 20% de FBS e transfira-as para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células por dois minutos a 250 × g, à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM com 20% de FBS.Filtre e descarte os agregados celulares utilizando um filtro celular de 40 micrômetros e recolha as células isoladas. Conte as células isoladas usando um hemocitômetro. Centrifugue as células.Remova o sobrenatante e seme três vezes 10 à quinta células por pellet em um tubo cônico de 15 mililitros com 300 microlitros de meio de diferenciação condrogênica, ou CDM. Para a formação do pellet, centrifugue as células e, em seguida, incube-as durante a noite. Em até três dias, os pellets exibirão morfologias esferoidais achatadas.Mantenha os pellets por 21 dias. Antes da inclusão, prepare e derreta parafina a 58 graus celsius. Fixe os pellets em um mililitro de paraformaldeído 4% por duas horas à temperatura ambiente em um tubo de 1,5 mililitro.Coloque uma camada de gaze sobre a cassete e transfira os pellets fixados usando uma pipeta. Cubra o pellet dobrando a gaze e fechando a tampa da cassete. Inicie a desidratação em 100 mililitros de etanol 70%.Desidrate os pellets mediante lavagens sucessivas com etanol a 80% e 95%. Transfira os pellets para etanol a 100% por 10 minutos. Para a clareação, substitua a solução por uma mistura de 100 mililitros, na proporção um para um, de etanol e xilol, durante 10 minutos.Em seguida, substitua a solução de um para um por uma mistura de um para dois de etanol e xilol por 10 minutos. Remova o etanol remanescente incubando os pellets em xilol a 100%. Para a infiltração com parafina, incube os pellets em misturas sequenciais de xilol e parafina.Realize todo o processo de infiltração com parafina a 58 graus celsius. Incube os pelotes em 100 mililitros de uma mistura dois para um de xilol e parafina durante 30 minutos. Em seguida, substitua a solução por 100 mililitros de uma mistura um para um de xilol e parafina e incube por 30 minutos.Em seguida, substitua a solução por 100 mililitros de uma mistura de xilol e parafina na proporção de um para dois e incube por 30 minutos. Para a infiltração final, transfira os pellets para o primeiro banho de parafina a 100% e incube o pellet por duas horas. Transfira os pellets para o segundo banho de parafina a 100% e incube durante a noite a 58 graus Celsius.No dia seguinte, use pinças para transferir suavemente os pelotas para um molde. Adicione parafina ao molde a partir do dispensador de parafina. Solidifique a parafina por 30 minutos a quatro graus Celsius.Corte as seções com sete micrômetros e transfira as seções para a lâmina. Deixe as lâminas secarem durante a noite e armazene-as em temperatura ambiente até que estejam prontas para uso. Antes da diferenciação, as colônias de iPSC foram expandidas.Os iPSCs expandidos foram agrupados como EBs para iniciar a diferenciação. Os EBs gerados foram aderidos a placas revestidas com gelatina para induzir células de crescimento. Após 21 dias de diferenciação, foram obtidos pequenos agregados com aspecto de contas com características condrogênicas, que foram utilizados para caracterização adicional.A qualidade dos pellets condrogênicos foi avaliada histologicamente no dia 21, utilizando-se pellets condrogênicos de BMSC como controle positivo. O acúmulo de proteínas da matriz extracelular secretadas pelos condrócitos diferenciados foi confirmado pela coloração com azul de Alcian e com azul de Toluidina. Os pellets condrogênicos gerados a partir de CDMC HIPSCs expressaram COL2A1 em níveis mais altos do que os pellets derivados de CBMSC HIPSCs.A expressão de colágeno tipo um, um marcador para cartilagem fibrosa, foi menor em pelotas derivadas de CBMC HIPSC em comparação com a expressão de COL2A1. A expressão gênica de proteínas da matriz extracelular da cartilagem em pelotas condrogênicas no dia 21 foi confirmada por PCR em tempo real. A expressão de agregacano em pelotas derivadas de CBMC HIPSC foi semelhante à de pelotas derivadas de BMSC.Apresentamos um método detalhado para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de células mononucleares do sangue do cordão em pelotas condrogênicas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois meses, se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar pelotas condrogênicas a partir de iPSCs.

chondrogenic-pellet-formation-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, fornecendo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Apresentamos um protocolo para induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) usando gravidade centrífuga (CG). A regulação positiva de SOX9 induzida por CG resulta no desenvolvimento de fenótipos condrogênicos.

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Apresentamos um protocolo para gerar uma linhagem condrogênica de sangue periférico humano (PB) através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um método livre de integração, que inclui a formação de corpo embrionóide (EB), expansão de células fibroblásticas e indução condrogênica.

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.

Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

Este protocolo detalha o isolamento de condrócitos, condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs) e condroprogenitores migratórios (MCPs) da cartilagem articular humana. Abrange digestão enzimática, adesão de fibronectina e ensaios baseados em migração para isolar e caracterizar essas células.

Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Aprenda a gerar grânulos condrogénicos a partir de células iPSCs derivadas de sangue do cordão umbilical. Este protocolo permite a produção em larga escala para modelagem de doenças, triagem de fármacos e estudos em medicina regenerativa.

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

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