Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas

Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.

O objetivo geral deste método de imagem de células vivas é estudar aspectos críticos dos mecanismos de ação das defensinas antifúngicas de plantas em células fúngicas. Com o advento de técnicas avançadas de microscopia confocal, a imagem de células vivas tornou-se uma ferramenta poderosa para estudar os modos de ação das defensinas antifúngicas de plantas. Fazendo uso dessa tecnologia, apresentamos aqui um método para ajudar a responder a perguntas-chave na compreensão dos modos de ação das defensinas antifúngicas de plantas.

Nossos focos são como esses peptídeos são internalizados nas células fúngicas e como esses peptídeos são localizados nas organelas celulares ou difundidos no citoplasma. Para fazer uma suspensão conidial da cepa PH-1 de Fusarium graminearum, primeiro configure culturas da cepa em placas contendo meio completo. Cultive-os a 28 graus Celsius durante cinco dias.

Para produzir conídios, inocular quatro tampões de 10 milímetros de diâmetro da cultura de cinco dias em 50 mililitros de meio carboximetilcelulose. Cultive esses plugues por quatro a sete dias a 28 graus Celsius em um agitador rotativo ajustado para 180 rpm. Quando as culturas têm uma cor vermelha, os conídios se formam.

Para coletar os conídios em suspensão, vórtice a cultura líquida e filtre um mililitro através de duas camadas de material de filtração, em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Centrifugar a suspensão durante dois minutos e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet com um mililitro de água estéril e repita a centrifugação.

Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de 2x SFM. Em seguida, conte os conídios usando um hemocitômetro e ajuste a densidade da suspensão para 100.000 conídios por mililitro. Para fazer uma suspensão de conídios de Neurospora crassa, transfira os conídios das culturas de estoque para um tubo inclinado contendo o meio de ágar de Vogel e incube os tubos em temperatura ambiente sob luz constante por cinco dias.

Após cinco dias, transfira uma pequena quantidade de cultura em crescimento, usando um loop de inoculação, para um tubo de microcentrífuga contendo dois mililitros de meio líquido de Vogel. Certifique-se de misturar os conídios fora do loop. Em seguida, filtre a suspensão, centrifugue-a e ressuspenda o pellet de conídios no meio de Vogel sem uma etapa de lavagem.

Finalmente, ajuste a suspensão final para 100.000 conídios por mililitro. Para fazer uma preparação de germinação para microscopia confocal, pipete 50 microlitros de suspensão de conídios em uma placa de cultura de 35 milímetros e deixe os conídios germinarem por três a seis horas em temperatura ambiente. Para microscopia confocal, pipete 50 microlitros de suspensão de conídios em um micropoço de 10 milímetros de prato com fundo de vidro.

Em seguida, na concentração inibitória mínima predeterminada, adicione 50 microlitros de defensinas marcadas com fluorescência à suspensão e incube os conídios com as defensinas marcadas por 2,5 horas em temperatura ambiente. Após a incubação, adicione dois microlitros do corante seletivo de membrana FM4-64, para uma concentração final de cinco micromolares. Em seguida, incube a cultura por 30 minutos em temperatura ambiente antes de examinar os conídios.

Para configurar o microscópio confocal, selecione o laser de luz branca. Use os lasers de 488 nanômetros e 550 nanômetros para excitar as defensinas marcadas com rodamina e o corante FM4-64, respectivamente. Defina esses lasers para uma intensidade de 1% Em seguida, defina os comprimentos de onda de detecção para 580 a 700 nanômetros para a defensina marcada com rodamina e de 690 a 800 nanômetros para o corante FM4-64.

Agora, colete as imagens. Para imagens de lapso de tempo, adicione 50 microlitros de suspensão de conídios em um prato de micropoços com fundo de vidro. Em seguida, monte a placa de micropoços no microscópio e encontre as células com baixa potência.

Em seguida, mude para uma objetiva de óleo de 100x, 1,44. Para observar as defensinas marcadas com DyLight550, defina a linha de laser para 550 nanômetros para excitação e de 560 a 600 nanômetros para detecção. Em seguida, defina o modo de varredura para xyzt.

Em seguida, defina a posição Z, o zoom, a frequência de captura de imagem e assim por diante, conforme necessário. Agora, à suspensão de conídios, adicione 50 microlitros de defensinas marcadas com fluoróforo na concentração inibitória mínima de três micromolares e adicione dois microlitros de corante seletivo de membrana FM4-64 para uma concentração final de cinco micromolares. Em seguida, refoque a ótica, se necessário.

Antes de capturar imagens, coloque pequenos pedaços de papel de filtro úmido no prato de micropoços para evitar a evaporação. Em seguida, processe com a captura de uma imagem a cada 3,5 minutos durante 2,5 horas. Imagens de células vivas foram realizadas para rastrear e comparar a internalização e localização subcelular de duas defensinas de Medicago truncatula.

A defensina quatro marcada com rodamina sintetizada quimicamente foi trafegada de forma diferente em Neurospora crassa e Fusarium graminearum. FM4-64 marcou as membranas plasmáticas de ambos os fungos. No entanto, em Fusarium, a defensina quatro é difundida no citoplasma.

Considerando que, em Neurospora, é transportado para corpos vesiculares. Para comparação, a defensina cinco foi visualizada usando um marcador DyLight550 em Neurospora crassa, juntamente com a marcação da membrana plasmática por FM4-64. A imagem de lapso de tempo mostra que essa defensina entra nas células dentro de 30 a 40 minutos e depois se difunde pelo citoplasma.

Isso difere do tráfego de defensina quatro, que entra nas células e permanece preso dentro dos corpos vesiculares mesmo após três horas. Em resumo, a imagem de células vivas é uma ferramenta poderosa para aumentar nossa compreensão dos modos de ação das diferenças de plantas antifúngicas. Com outros corantes fluorescentes vitais e marcadores celulares, tem a flexibilidade de ser modificado para outros peptídeos antimicrobianos.

Em última análise, essa técnica pode ajudar a desenvolver novas estratégias para o uso de peptídeos antimicrobianos como agente antifúngico na agricultura e na medicina.