Localização de quantitativa de uma proteína de Golgi por imagem sua massa centro de fluorescência

O objetivo geral desse método baseado em imagem é localizar quantitativamente uma proteína de Golgi com resolução nanométrica. Esse método pode ajudar a responder às questões-chave no estudo do aparelho de Golgi, como a organização do Golgi e seu funcionamento. A principal vantagem desse método é que ele utiliza um microscópio óptico convencional e ferramentas de software.

Para começar, cultive células HeLa em um frasco de T25 em DMEM suplementado com 10% de FBS e incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, aspire o meio de cultura e adicione um mililitro de 25% de Tripsina EDTA ao frasco. Incube as células a 37 graus Celsius por dois minutos.

Remova as células da incubadora e adicione um mililitro de meio completo para limpar suavemente as células da parede do frasco. Transfira as células destacadas para um tubo de centrifugação estéril e gire o tubo a 500 g por dois minutos para fazer pellets nas células. Após aspirar o sobrenadante, use um mililitro de meio completo para suspender a pastilha celular.

Remova o meio do poço de uma placa de 24 poços contendo uma tampa de vidro esterilizada e semeie aproximadamente 100.000 células no poço. Use meio completo para aumentar o volume do poço para 5 mililitros. Depois, incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Quando as células atingirem 80% de confluência, utilize 80 nanogramas de GalT-mCherry e 320 nanogramas de DNA plasmídico TPST1-EGFP e reagente de transfecção para transfectar as células conforme o protocolo do fabricante. Após incubar as células por quatro a seis horas, troque o meio e retorne as células à incubadora por 12 horas. Aspire o meio no poço e adicione 5 mililitros de 33 micromoldes Nocodazol contendo meio completo e então incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas.

Após limpar as tampas de vidro conforme o protocolo de texto, use uma vez PBS contendo 1 micrograma por microlitro de BSA para diluir esferas fluorescentes multicoloridas de 110 nanômetros 80 vezes. Faça um vórtice breve no tubo para dispersar os agregados de contas. Usando uma ponta de pipeta, espalhe 60 microlitros de contas diluídas sobre uma capa limpa.

No escuro, coloque a capa em uma placa de 35 milímetros e cubra com papel alumínio. Seque a lâmina da tampa no escuro em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo. Depois, use 50 microlitros de meio de montagem para montar o encaixe da tampa em uma lâmina de vidro.

As lâminas de cobertura limpas corretamente são essenciais para eliminar detritos fluorescentes. Para visualizar contas multicoloridas nos canais verde, vermelho e vermelho distante, no início da sessão de imagem, adquira pilhas 3D de imagens, tomando três seções acima e abaixo do melhor plano focal. Salve as pilhas como arquivos TIFF.

Para imagear mini-pilhas de Golgi, use TPST1-EGFP e GalT-mCherry transfectados em slides marcados fluorescentemente para encontrar células que expressam TPST1-EGFP e um GalT-mCherry de baixo ou médio tesouro. Adquira pilhas de imagens 3D como acabei de demonstrar. Para analisar as imagens, abra a imagem J, escolha Arquivo, Imagem, Aberto, para abrir um conjunto de imagens de contas composto por três arquivos TIFF.

Escolha Imagem, Stacks, Z Project, para fazer uma média de três seções consecutivas ao redor da seção mais focada no canal vermelho. Insira o número de seção do corte inicial e do corte de parada e, entre as opções do tipo de projeção, selecione intensidade média. Desenhe retornos de investimento em fundo que não contenham miçangas na imagem.

Depois, em Analisar, Definir Medidas, verifique apenas o valor cinza médio e o Desvio Padrão ou SD. Execute, analise, meça, para obter a intensidade média de fundo e o desvio padrão. Escolha Processo, Matemática, Subtrair, para subtrair a imagem com os valores correspondentes da intensidade média de fundo mais seis vezes o desvio padrão. Depois, insira o valor calculado correspondente a esse canal.

Repita a média e a subtração para as pilhas de imagens de canais verde e vermelho distante usando o mesmo fatio inicial e final e o mesmo retorno do investimento em fundo. Misture as três imagens processadas usando Imagem, Cor, Molhar Canais, selecionando o canal R como vermelho, canal G como verde e canal B como azul. Inicie o Gerenciador de ROI escolhendo Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI.

Desenhe ROIs quadrados ao redor de contas individuais. Depois, adicione o ROI ao Gerenciador de ROI pressionando T no teclado. Em Analisar, Definir Medidas, verifique apenas o centro de massa.

No Gerenciador de ROI, selecione o canal R e clique em Medir para obter as coordenadas X e Y dos centros de ROIs na janela de resultados. Copie e cole as duas colunas em uma planilha. Obtenha as coordenadas dos centros de retorno dos retornos do canal G e do canal B. Salve a planilha como beads.csv.

Na imagem J, use plugins instalados para instalar as duas macros, macro Golgi ROI inspection e macro output três canais de dados. Limpe a janela de ROI Manager e de resultados. Abra um conjunto de imagens mini-pilha de Golgi compostas por três arquivos TIFF.

Gerar imagens subtraídas de fundo, como demonstrado anteriormente neste vídeo, para uso posterior. Depois, duplique as imagens. Em Processo, Calculadora de Imagem, adicione as imagens do canal G, canal R e canal B subtraídos em fundo.

Para a imagem resultante em Imagem, Ajustar, Limiar, selecione Definir para inserir um como o nível de limiar mais baixo. Em Analisar, Analisar Partículas, insira também a faixa de tamanho para o pixel de tamanho. Insira 50 até o infinito, marque exclusão nas arestas e adicione ao gerenciador.

Em seguida, use Imagem, Cor, Molhar Canais, para mesclar as três imagens de fundo subtraídas geradas anteriormente, selecionando o canal R como vermelho, canal G como verde e canal B como azul. Depois, execute a macro macro Golgi ROI inspection selecionando Plugins, Macro, Golgi ROI Inspection. É importante selecionar o máximo possível de ROIs que contenham mini-pilhas de Golgi individuais em um conjunto de imagens.

Em Analisar, Definir Medidas, verifique apenas área, valor médio cinza e centro de massa. Adquira dados lançando a ferramenta macro e saia dados de três canais. Copie as coordenadas dos centros em uma planilha na ordem indicada aqui.

Depois salve a planilha como ministacks.csv. Prossiga para a correção de deslocamento cromático dos centros e o cálculo do Quociente de Localização ou LQ de acordo com o protocolo de texto. O microscópio óptico moderno de grau de pesquisa equipado com a lente apocromática simples, como a usada aqui, apresenta um deslocamento cromático mínimo.

No entanto, um exame cuidadoso da imagem multicolorida da conta revela isso. Centros de fluorescência vermelha são definidos como as verdadeiras posições das contas. Os deslocamentos cromáticos relativos da fluorescência verde e vermelha distante podem ser representados por vetores.

O deslocamento cromático dentro do plano de imagem é ilustrado pelo vetor verde e azul para cada conta. Como ilustrado aqui, a correção de deslocamento cromático reduz significativamente o deslocamento cromático. Em células de mamíferos, o complexo de Golgi é agregado na área perinuclear, o que geralmente não é resolvível sob um microscópio óptico convencional.

Após o tratamento com Nocodazol, o complexo perinuclear de Golgi desaparece e dezenas de mini-pilhas de Golgi se formam nos locais de saída do retículo endoplasmático por todo o citoplasma. Uma imagem de exemplo gerada usando a análise demonstrada neste vídeo é mostrada aqui. Usando a ferramenta de inspeção macro golgi ROI, 40 mini-pilhas de Golgi selecionadas foram listadas.

Após aplicar os três critérios, 21 mini-pilhas de Golgi foram analisáveis para o cálculo dos LQs do TPST1-EGFP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora após a marcação por fluorescência. Após seu desenvolvimento, esse método abriu caminho para que pesquisadores que estudam o aparelho de Golgi localizassem quantitativamente uma proteína de Golgi com resolução equivalente à da microscopia imunoeletrônica.