Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

O objetivo geral deste protocolo de imagem é visualizar múltiplas proteínas em uma célula T ativada, utilizando microscopia de localização de molécula única. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de ativação de células T, como, por exemplo, a distribuição de moléculas únicas de componentes de TC ou microagregados. A principal vantagem desta técnica é que ela permite maior multiplexação do que a alcançada pelos métodos atuais de microscopia de solução supervisionada.

Para começar, conjugue diretamente os anticorpos com o corante Alexa 647, utilizando o kit de marcação de anticorpos Alexa 647, seguindo o protocolo de marcação fornecido pelo fabricante. Centrifugue os anticorpos marcados por cinco minutos a 20.800 × g. Após a centrifugação, colete o sobrenadante para remover os anticorpos agregados. Em seguida, recubra as câmaras com lamínulas A12 com 250 microlitros de poli-L-lisina 0,1% por 15 minutos.

Em seguida, aspire a solução sem enxaguar e seque as câmaras a 65 graus Celsius por 30 minutos. Prepare uma diluição de diamantes nanométricos fluorescentes de 100 nanômetros, ou FNDs, em um PBS, testando várias diluições para garantir que um número suficiente de FNDs seja visível em cada campo. Vortexe os FNDs diluídos por um minuto.

Em seguida, sonique o sobrenadante de FND por 30 segundos em potência alta. Incube o sobrenadante de FND sonicado em uma câmara com lamínula A12 revestida com poli-l-lisina por 30 minutos à temperatura ambiente. Após lavar a câmara cinco vezes com PBS 1x, visualize a câmara revestida com FND utilizando excitação a laser de 647 nanômetros no microscópio turf.

Utilize um objetivo de 100x com um campo de visão de 61 por 61 mícrons. Idealmente, quatro a dez FNDs individuais devem ser visíveis no campo de visão, dada a diluição apropriada dos FNDs, com pelo menos um FND presente em cada quadrante do campo de imagem. Uma vez alcançada a densidade adequada de FNDs, adicione 250 microlitros de anticorpo anti-CD3 a cada poço.

Incube a câmara por uma hora a 37 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, remova a solução dos poços e adicione PBS 1x por 30 segundos. Repita este passo de lavagem cinco vezes.

Centrifugue um mililitro de células T Jurkat a 800 × g durante seis minutos. As células T Jurkat devem ter, idealmente, uma concentração de 0,5 a um milhão de células por mililitro antes da centrifugação. Re-suspenda as células em 300 microlitros de solução HBS 1x.

Enquanto isso, adicione 150 microlitros de solução HBS 1x em cada poço da câmara e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione 50 microlitros das células T Jurkat re-suspensas em cada poço e incube por três minutos a 37 graus Celsius. A seguir, adicione 300 microlitros de paraformaldeído 4% em cada poço e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Após lavar três vezes com PBS 1x, permeabilize as células adicionando 250 microlitros de solução de Triton X 0,1% por cinco minutos à temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais com PBS 1x, adicione 250 microlitros de solução de gelatina de peixe 1% a cada poço durante 30 minutos à temperatura ambiente. Por fim, lave as células mais três vezes com PBS 1x.

Adicione 200 microlitros de anticorpo marcado a 0,1 a 0,5 microgramas por mililitro às células fixadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavar as células cinco vezes com PBS 1x, adicione um mililitro de tampão STORM e cubra a câmara com uma lamínula de vidro para limitar a exposição. Use grampos na platina do microscópio para manter a câmara com lamínula fixada em posição.

Esta etapa é crítica para a multiplexação em larga escala, já que o mesmo campo de visão deve estar presente após várias rodadas de lavagem e incubação. Usando uma baixa potência do laser de 647 nanômetros no modo turf, localize uma célula corada com pelo menos três FNDs no campo de visão. Aumente a potência do laser de 647 nanômetros e adquira as imagens.

Os parâmetros típicos podem ser encontrados no protocolo descrito no texto. Lave as células cinco vezes com solução salina tamponada com tris 1x ou TBS 1x. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de eluição e incube à temperatura ambiente por um minuto.

Repita a eluição três vezes. Utilize as condições exatas de eluição e o número de lavagens de eluição necessárias para remover o sinal, conforme especificado para cada anticorpo. Em seguida, lave as células três vezes com TBS 1x e adicione um mililitro de PBS 1x.

A execução adequada desta etapa de eluição resultará na remoção do anticorpo previamente ligado e permitirá maior eficiência na marcação subsequente com anticorpos. É importante utilizar TBS nas lavagens para minimizar a precipitação entre as etapas de eluição. Realize o branqueamento fotográfico das células usando um laser de 647 nanômetros em alta potência, juntamente com um laser de 405 nanômetros a dois a cinco miliwatts, para ativar fotoquimicamente os corantes Alexa 647 no estado escuro.

Aguarde até que todo o sinal remanescente do anticorpo não eluído seja fotoabolido. Normalmente, isso leva de dois a cinco segundos de exposição ao laser. Adquira imagens da amostra, utilizando as configurações de STORM após a ilusão e a fotoablação, para confirmar a remoção do sinal.

Em seguida, adicione 250 microlitros de paraformaldeído a 4% durante 15 minutos. Isso impede a reticulação reversa de moléculas fixadas na célula. Lave as células três vezes com PBS 1x.

Repita esses passos para a marcação sequencial de múltiplos alvos. Por fim, realize a correção de deslocamento e o alinhamento das pilhas de imagens multiplex conforme descrito no protocolo textual. O método sequencial de ilusão e montagem foi utilizado para produzir a imagem multiplex MET STORM de microagregados e outras estruturas em uma célula T Jurkat ativada.

A imagem final do MET STORM foi corrigida quanto à deriva e alinhamento, utilizando correção média por marcadores fiduciais e marcadores fiduciais FND. São mostradas aqui imagens de microscopia de localização de molécula única de um FND individual localizado em 30.000 quadros de imagem, antes e depois da correção de deriva com correção fiducial média. Da mesma forma, aqui estão imagens de microscopia de localização de molécula única de uma célula T Jurkat ativada marcada com anticorpo anti-SLP76 fosforilada e marcadores futuais FND, antes e depois da correção de deriva com correção futual média.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a imagem de super-resolução multiplexada de proteínas em uma célula T ativada, utilizando MET STORM. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três horas para cada rodada de multiplexação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter o espécime na mesma posição na platina do microscópio.

Isso pode ser feito usando grampos de estágio. Não se esqueça de que trabalhar com nosso tampão STORM modificado pode ser extremamente perigoso, e precauções como respiradores e óculos de proteção devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.