Name: Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a técnica madSTORM para imagem de super resolução e multiplexação de proteínas em células T ativadas. Este método permite visualizar componentes de microclusters com precisão molecular única.

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Agradecemos ao Xufeng Wu o acesso ao microscópio STORM. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Câncer (NCI) Center for Cancer Research e do National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).

Cuidado: consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Vários dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos e cancerígenos. Use todas as práticas de segurança adequadas ao executar o protocolo, incluindo o uso de controles de engenharia (exaustor, porta-luvas) e equipamento de proteção pessoal (óculos de segurança, luvas, bata de laboratório, calças completas, sapatos fechados). 1. Imagem multiplexada de células T ativadas <ol><li> Conjugar conjuntamente anticorpos com o corante Alexa-647 (A647) usando o kit de rotulação de anticorpos Alexa 647. Siga o protocolo de rotulagem fornecido pelo fabricante. NOTA: Recomenda-se a diálise da solução de anticorpos em 1x PBS antes deste passo para aumentar a eficiência da rotulação de anticorpos. </li><li> Anticorpos rotulados por rotação durante 5 min a 20,800 rcf e coletar o sobrenadante para remover anticorpos agregados. </li><li> Preparação de lâminas fluorescentes com revestimento em nano-diamante <ol&gt; <li> Cubra as câmaras de lamínula de 8 poços (ver lista de reagentes / materiais) com 250 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% durante 15 minutos, aspirar e secar a 65 ° C durante 30 min. (Não lavar antes de secar). </li><li> Prepare uma diluição de FND de 100 nm em 1x PBS. Teste várias diluições para garantir que FNDs suficientes sejam visíveis em cada campo de visão no passo 1.2.7 (estamos usando uma diluição de FND de 1: 200 fornecida pelo fabricante). </li><li> Vortex as FND diluídas por 1 min. </li><li> Sonicate o sobrenadante FND por 30 s em uma configuração de alta potência. </li><li> Incubar o sobrenadante de FND sonicado em uma câmara de lamínula de 8 poços revestida com PLL por 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5x com 1x PBS e visualizar a câmara revestida com FND usando excitação a laser de 647 nm no microscópio TIRF. Idealmente, 4-10 FNDs individuais devem ser visíveis em um campo de visão dada a diluição adequada de FNDs no passo 1.2.2 (estamos usando um objetivo 100X com configuração de pixel de câmera 256 x 256 para produzir um campo de visão de 61 x 61 μm) Com emPelo menos um FND presente em cada quadrante do campo de imagem. Se os FNDs parecem estar agrupados ( ou seja, FNDs com sinal significativamente maior do que os FND circundantes e uma função de propagação do ponto maior que 200 nm), centrifugem FNDs a 6,800 rcf por 1 min e repitam o procedimento de revestimento usando o sobrenadante FND. </li><li> Adicionar 250 μl de anticorpo anti-CD3 (10 μg / mL) em cada poço e incubar durante 1 hora a 37 ° C, ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova a solução e adicione 1x PBS por 30 segundos. Repita este passo de lavagem 5 vezes (lavar 5x). </li></ol></li><li> Ativação de células T Jurkat <ol><li> Girar 1 ml de células Jurkat T a 800 rcf durante 6 min e ressuspender em 300 μl de solução 1x HBS. As células T Jurkat devem, idealmente, estar em uma concentração de 0,5-1,0 x 10 6 células / ml antes da centrifugação. A solução 1x HBS consiste em solução salina tampão HEPES com 1% de albumina de soro bovino como descrito anteriormente 22 . </li><li> Adicionar 150 μLDe solução 1x HBS em cada poço e incuba a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Adicionar 50 μL de células Jurkat T ressuspendidas a cada poço e incubar durante 3 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 300 μL de Paraformaldeído a 4% a cada poço e incubar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lave 3x com 1x PBS. </li><li> Permeabilize as células adicionando 250 μL de solução de Triton-X a 0,1% durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lave 3x com 1x PBS. </li><li> Adicionar 250 μL 1% de solução de gelatina de peixe em 1x PBS a cada poço durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Lave 3x com 1x PBS. </li></ol></li><li> Imaging ativou células Jurkat T usando madSTORM <ol><li> Adicionar 200 μL de anticorpo marcado a 0,1-0,5 μg / mL a células fixas durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5x com 1x PBS. </li><li> Adicione 1 ml de tampão STORM e cubra a câmara com uma lamínula de vidro para limitar a exposição ao ar. O buffer STORM foi descrito anteriormente 10 . Recomendamos maKing novo buffer STORM para cada rodada de imagem e girando o buffer STORM a 20,800 rcf durante 2 min para remover precipitados. </li><li> Usando baixa potência de laser de 647 nm no modo TIRF, localize uma célula corada com pelo menos 3 FNDs no campo de visão. Para ajudar a localizar FNDs, a excitação concomitante com laser de 568 nm pode ser usada para aumentar o brilho do sinal FND. NOTA: O desempenho da correção fiducial média descrita na seção 2.1 melhora com a inclusão de mais FNDs. </li><li> Aumente o poder laser de 647 nm e adquira imagens. Normalmente, nós adquirimos 10.000 quadros com exposição de 200 ms, laser de 125 mW 647 nm, lente de objetivo TIRF 100X (1,49 NA), ganho EM 100X (5 MHz em 16 bits, ganho de conversão 1). Os detalhes de nossa configuração de imagem foram descritos anteriormente 10 . </li><li> Lavar 5x com 1x TBS. </li><li> Adicione 1 ml oO tampão de eluição (MgCl2 3,5 M, PIPES 20 mM, Tween-20 a 0,1%, pH 6,5) e incuba à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Repita a eluição 3 vezes. (As condições exactas de eluição e o número de enxaguamentos de eluição necessários para remover o sinal devem ser verificados para cada anticorpo utilizado). </li><li> Lave 3x com 1x TBS e adicione 1 ml de 1x PBS. </li><li> Photobleach com laser de 647 nm com alta potência (125 mW) com laser de 405 nm a 2-5 mW para foto-ativar corantes A647 em estado escuro. Aguarde até que todo o sinal restante de anticorpos não eluídos seja fotoblechado. Normalmente, isso leva 2-5 s de exposição a laser. A aquisição de imagens de amostra (~ 100 quadros) usando as configurações de TEMPORADA em 1.3.5 após eluição e foto-brilho é recomendável para confirmar a remoção do sinal. Normalmente, removemos 99,8% do sinal usando este método. Recomendamos testar a eficiência de eluição de cada anticorpo antes de usar em madSTORM como mostrado anteriormente 10 . </li><li> Adicionar 250 μL de Paraformaldeído a 4% durante 15 min. Este prOs eventos revertem a reticulação de moléculas fixas na célula. </li><li> Lave 3x com 1x PBS. </li><li> Repita as etapas 1.3.1-1.3.12 para rotulagem seqüencial de múltiplos destinos. A Figura 1 mostra uma imagem composta de múltiplas moléculas em uma célula T Jurkat ativada adquirida usando madSTORM. </li></ol></li></ol> 2. Correção de tração e alinhamento de pilhas de imagens multiplexadas <ol><li> Correção de deriva de pilhas de imagem madSTORM <ol><li> Abra imagens usando o ImageJ. Recomendamos converter os arquivos de imagem em um formato TIFF antes de abrir no ImageJ. Use ROI do retângulo para selecionar um único FND. Jogue o lapso de tempo para se certificar de que o FND está visível em cada quadro da pilha de imagens. Use Run Analysis no plugin ThunderSTORM para localizar o FND. Para o método de correção fiducial calculado em 2.1.5, é importante que um FND único seja localizado em cada quadro de imagem ( ou seja, o número de picos identificados deve ser eQual o número de quadros). </li><li> Se o FND não for identificado em cada quadro, selecione outro FND. Se vários picos estiverem localizados em um único quadro, remova o pico que se desvia mais dos picos anteriores. </li><li> Repita 2.1.2 para cada FND na pilha de imagens. Tenha em mente que alguns FNDs não devem ser incluídos no processo de correção de deriva para que eles possam servir como um indicador independente para a precisão de correção de deriva como descrito no passo 2.1.7. </li><li> Para uma correção de deriva mais rápida e menos precisa, use os algoritmos de correção cruzada ou de correção fiduciária incluídos no ThunderSTORM para corrigir as imagens do FND. Normalmente, usamos 100 lâminas, 5 ampliação e 0,1 fator de alisamento da trajetória para correlação cruzada e 10 distância máxima, relação de visibilidade do marcador de 0,1 min e fator de alisamento da trajetória 0,01 para correção fiducial. A correlação cruzada e a correção fiducial renderão um arquivo de correção que pode ser aplicado a outros FNDs para testar a precisão da correção de deriva. </li><li> Para uma correção de deriva mais rigorosa e mais precisa, use o algoritmo de correção fiducial (AFC), conforme descrito anteriormente 10 . Este processo não requer otimização de parâmetros e produz maior precisão de localização do que o previsto pelos algoritmos de localização SMLM. No entanto, a correção de deriva média requer pelo menos 4 FNDs e para que os FNDs sejam localizados em cada quadro da pilha de imagens. A correção de deriva AFC funciona melhor com a inclusão de mais FNDs porque um grande número de FNDs localizadas diminuirá o efeito de distorção de um pico outlier em uma determinada moldura. </li><li> Localize todas as funções de propagação de pontos dentro da pilha de imagens usando ThunderSTORM como descrito anteriormente 10 . Normalmente, usamos tamanho de pixel de 100 nm, fotoelétrons por contagem A / D de 4,28, contagem A / D de nível básico de 100, ganho EM de 100, PSF: localização Gaussiana integrada, raio de ajuste de 5 pixels, método de ajuste de máxima verossimilhança e 1,3 Sigma inicial de pixel.</li><li> Aplique o fator de correção de deriva adquirido de FNDs para localizações de toda a pilha de imagens. Inspecione visualmente a imagem final para garantir correção adequada da deriva ( Figura 2 ). O fator de correção de deriva resultante deve ser testado independentemente em FNDs não incluídos no procedimento AFC para medir o nível de precisão de correção de deriva. A precisão de FNDs corrigidos por deriva e independente deve ser próxima do valor médio de precisão / incerteza calculado a partir do algoritmo de localização utilizado no passo 2.1.6. </li><li> Repita as etapas 2.1.1-2.1.7 para as pilhas de imagem madSTORM de anticorpos marcados sequencialmente. Tenha em mente que localizar o mesmo conjunto de FNDs em cada pilha de imagem madSTORM é crítico para o seguinte procedimento de alinhamento. </li></ol></li><li> Alinhamento de imagens madSTORM <ol><li> Calcule a posição centróide das FND corrigidas por derivação em cada imagem madSTORM. Para fazer isso, encontre o eixo médio x e y poPara cada FND localizado e média das posições médias x e y de todos os FNDs em cada imagem madSTORM. O algoritmo detalhado para este passo foi descrito anteriormente 10 . Alinhe imagens sequST madSTORM utilizando as posições centroid de marcadores fiduciais FND. Para realizar o alinhamento, calcule o deslocamento entre duas imagens de madSTORM localizadas, subtraindo a posição centroid de FNDs na segunda imagem madSTORM a partir do primeiro. Então, subtrai a quantidade de deslocamento de todas as localizações na segunda imagem do madSTORM. </li><li> Recomendamos usar a primeira imagem madSTORM como uma imagem de referência e repetir este passo de alinhamento entre o primeiro eo terceiro, primeiro e quarto, etc. Teste a precisão do alinhamento medindo o deslocamento entre FNDs não incluídos no processo de alinhamento. Grandes deslocamentos podem indicar que diferentes conjuntos de FNDs foram usados ​​ao calcular as posições centroides de imagens sequST madSTORM. </li><li> Em caso afirmativo, as etapas 2.2.1-2.2.2 shouPode ser repetido usando o mesmo conjunto de FNDs para realizar o alinhamento. NOTA: São fornecidos códigos personalizados para a correção de deriva AFC e procedimentos de alinhamento. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Não temos nada a revelar.

Os procedimentos de multiplexagem seqüencial, correção de deriva e alinhamento em madSTORM permitem uma visualização precisa e altamente multiplexada de estruturas heterogêneas nas células. 10 Além disso, madSTORM evita as limitações de STORM multicolor, como a aberração cromática e as propriedades de troca / troca de fotos sub-ótimas de corantes vermelhos não distantes 9 , 12 . À medida que o passo de eluição reduz significativamente a i...

Uma variedade de técnicas de microscopia de super resolução foi desenvolvida para superar o limite de difracção do microscópio de luz (~ 200 nm). Entre estas, uma categoria de técnicas denominada microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM), que inclui microscopia de localização foto-ativação (PALM) e microscopia estocástica de reconstrução óptica (STORM). As técnicas SMLM compartilham o uso de fluoróforos que podem ser alternados entre os estados fluorescentes (offs) e off (dark / photo-switched), permitindo a localização sequencial da fluorescência a partir de moléculas únicas 1 , 2 , 3 . Devido à sua compatibilidade com corantes e microscópios comercialmente disponíveis, o STORM direto (dSTORM) tornou-se uma técnica SMLM amplamente adotada 4 . DSTORM pode normalmente atingir uma precisão de localização de ~ 10 nm, definida como a incerteza no cálculo do centro de uma difraçãoFunção de espalhamento de ponto limitado a iões (PSF). No entanto, apesar da alta precisão estimada usando os algoritmos de localização 5 , 6 , 7 , a determinação precisa da localização real de moléculas únicas foi prejudicada por uma série de problemas. Primeiro, o movimento mecânico do estágio do microscópio durante a aquisição da imagem aumenta a incerteza significativa na precisão da localização. À medida que as imagens SMLM são obtidas através de milhares de quadros de lapso de tempo, os movimentos de nano-escala do estágio do microscópio podem comprometer significativamente a precisão da imagem super-resolução final 8 . Para compensar o movimento do palco durante a aquisição da imagem, a derivação do estágio é geralmente estimada a partir de ajustes baseados em regressão de localizações binadas da própria imagem (correlação cruzada) ou localizações seqüenciais de marcadores fiduciais (correção fiducial) 1 , 9 . HowevEsses métodos requerem a otimização de vários parâmetros para cada pilha de imagens e não podem ser considerados movimentos de estágio em escalas de curta duração, como a vibração mecânica. As nanopartículas de ouro e as esferas fluorescentes multicoloridas foram usadas como marcadores fiduciários no SMLM, mas não são estáveis ​​em fotos e resultam em precisão significativamente menor após a correção da deriva do que os nano-diamantes fluorescentes de centro de vacância de nitrogênio (FNDs) utilizados Em madSTORM 10 . Além do limite de difracção, o microscópio de luz é ainda restringido por limites espectrais. A visualização simultânea de múltiplos alvos requer sondas fluorescentes com perfis espectrais não sobrepostos, geralmente restringindo o microscópio de luz à base de fluorescência a 6 cores e SMLM a 2-3 cores 4 , 11 , 12 . Além disso, a aberração cromática não linear provoca desalinhamento de imagens multicoloridas, wQue exigem extensos procedimentos de alinhamento usando marcadores fiduciários multicoloridos 8 , 13 . Para superar esses limites, estudos anteriores criaram imagens de múltiplos alvos usando fotobloco repetitivo ou extinção química de fluoróforos 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Embora estes métodos possam superar os limites espectrais da microscopia, o branqueamento com fluorescência é conhecido por ser um processo tóxico 20 , e o branqueamento prolongado ou a extinção pode causar efeitos colaterais indesejáveis, como perda de reticulação. Além disso, o acúmulo de sondas fluorescentes poderia levar ao bloqueio estérico de locais de ligação na amostra, evitando a multiplexação em grande escala e a segmentação robusta de epítopos. Para evitar tais interferências estéticas, uma recente sTudy conseguiu a multiplexação usando a troca estocástica de fragmentos de proteínas que difundem livremente 21 . Considerando que este método permite rotulagem densa de estruturas celulares, requer uma preparação bioquímica extensa para isolar fragmentos de péptidos, não pode localizar posições de moléculas únicas e não prontamente facilita a multiplexação em larga escala usando sondas comercialmente disponíveis. Apresentamos um protocolo de vídeo detalhado que descreve a ligação seqüencial e a eluição de anticorpos fluorescentes para imagens multiplexadas, tamanho limitado de anticorpos dSTORM (madSTORM) e uso de nano-diamantes fluorescentes para obter correção e alinhamento preciso da deriva.

<table><tbody><tr><td>Câmara de lamínula de 8 poços</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>solução de poli-L-lisina a 0,1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Nano-diamante fluorescente</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon; anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, Fração V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldeído</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Gelatina cancerígena</td></tr><tr><td>de pele de peixe de água doce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 kit de rotulagem de anticorpos</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Cisteamina altamente tóxica e sensível ao ar</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Ciclooctatetraeno altamente tóxico 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Altamente tóxico, sensível ao ar</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD </td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>médico 10x TBS</td><td>KD</td><td>RGF-3385</td><td></td> médico</tr></tbody></table>

imagem altamente multiplexada e de super resolução de células t usando madstorm

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

A imagem de estruturas celulares heterogêneas usando microscopia de localização de molécula única foi dificultada por precisão de localização inadequada e capacidade de multiplexação. Usando marcadores fiduciários de nano-diamante fluorescentes, descrevemos os procedimentos de correção e alinhamento da deriva necessários para obter alta precisão em microscopia de localização única de moléculas. Além disso, uma nova estratégia de multiplexação, madSTORM, é descrita em que moléculas múltiplas são direcionadas na mesma célula usando ligação seqüencial e eluição de anticorpos fluorescentes. MadSTORM é demonstrado em uma célula T ativada para visualizar as localizações de diferentes componentes dentro de uma estrutura de múltiplas proteínas ligada à membrana chamada de microcluster do receptor de células T. Além disso, a aplicação de madSTORM como uma ferramenta geral para a visualização de estruturas multi-proteínas é discutida.

O método de eluição e coloração seqüencial foi utilizado para produzir a imagem madSTORM multiplexada de microclusters e outras estruturas em uma célula T Jurkat ativada ( Figura 1 , verifique os alinhamentos das figuras). Cada imagem pseudo-colorida representa uma rodada de imagens madSTORM adquiridas nas etapas 1.1.1 a 1.3.13. Conforme descrito anteriormente 10 , o campo de visão deve ser monitorado quanto ao sinal residual de antic...

Demonstamos um método para imagem de múltiplas moléculas dentro de nanoestruturas heterogêneas com precisão de molécula única usando ligação sequencial e eluição de anticorpos marcados fluorescentemente.

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

O objetivo geral deste protocolo de imagem é visualizar múltiplas proteínas em uma célula T ativada, utilizando microscopia de localização de molécula única. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de ativação de células T, como, por exemplo, a distribuição de moléculas únicas de componentes de TC ou microagregados. A principal vantagem desta técnica é que ela permite maior multiplexação do que a alcançada pelos métodos atuais de microscopia de solução supervisionada.Para começar, conjugue diretamente os anticorpos com o corante Alexa 647, utilizando o kit de marcação de anticorpos Alexa 647, seguindo o protocolo de marcação fornecido pelo fabricante. Centrifugue os anticorpos marcados por cinco minutos a 20.800 × g. Após a centrifugação, colete o sobrenadante para remover os anticorpos agregados. Em seguida, recubra as câmaras com lamínulas A12 com 250 microlitros de poli-L-lisina 0,1% por 15 minutos.Em seguida, aspire a solução sem enxaguar e seque as câmaras a 65 graus Celsius por 30 minutos. Prepare uma diluição de diamantes nanométricos fluorescentes de 100 nanômetros, ou FNDs, em um PBS, testando várias diluições para garantir que um número suficien

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Descreve-se a preparação de três amostras de teste e de como eles podem ser utilizados para optimizar e avaliar o desempenho dos microscópios tempestade. Usando esses exemplos que mostram como a aquisição de dados brutos e, em seguida, processá-lo para adquirir imagens de super-resolução em células de aproximadamente 30-50 nm resolução.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

O objetivo geral desta metodologia é dar as condições experimentais ideais de preparação da amostra para aquisição de imagem e reconstrução para realizar imagens de dSTORM 2D cor dupla de microtúbulos e filamentos intermediários em células...

Filamentos intermediários e microtúbulos com microscopia 2-dimensional direta estocástico reconstrução óptico de imagem

O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

Microscopia óptica baseada em chip é uma nova abordagem à microscopia de fluorescência e oferece vantagens na relação custo-eficácia e taxa de transferência. Aqui, os protocolos de preparação e imagem de chips são mostrados para microscopia tirf e microscopia de super-resolução baseada em localização.

Fluorescência de reflexão interna total de alta taxa de transferência e microscopia de reconstrução óptica estocástica direta usando um chip fotônico

Aqui, descrevemos uma estratégia simples e acessível para visualizar, quantificar e mapear células imunes em seções de tecido tumoral parafina fixada em formalina. Essa metodologia combina técnicas de imagem e análise digital existentes com o objetivo de ampliar a capacidade de multiplexação e a análise multiparâmetro de ensaios de imagem.

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A análise de imagens multiplexadas com código de barras tem melhorado recentemente a caracterização do microambiente tumoral, permitindo estudos abrangentes da composição celular, estado funcional e interações célula-célula. Neste artigo, descrevemos um protocolo de coloração e imagem usando o código de barras de anticorpos conjugados a oligonucleotídeos e imagens cíclicas, que permite o uso de uma técnica de análise de imagens de alta dimensão.

Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Aprenda a técnica madSTORM para imagem de super resolução e multiplexação de proteínas em células T ativadas. Este método permite visualizar componentes de microclusters com precisão molecular única.

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

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