Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a quimeria no contexto do transplante de células-tronco. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transplantes, como a enxertia do transplante de células-tronco hematopoiéticas em pacientes com hemoglobinopatias. A principal vantagem deste método é que combina a triagem celular baseada em citometria de fluxo, ensaio de informação em coluna e subsequente análise de repetições em sequência curta para avaliar a proliferação e diferenciação de progenitores no compartimento eritróide.

A implicação desta técnica se estende ao tratamento da rejeição subclínica de enxertos, pois pode ajudar a identificar pacientes suscetíveis à recorrência da doença e a iniciar estratégias imunomodulatórias subsequentes. Além disso, ela também pode ser aplicada a estudos clínicos futuros, pesquisa com células-tronco e ao planejamento de ensaios clínicos de terapias cutâneas. A demonstração visual deste método é essencial, pois o processo é difícil de aprender e precisa ser realizado por pessoal treinado.

Para demonstrar este procedimento, contaremos com Elisabeth Hoflehner, uma técnica do meu laboratório. Para começar, gere uma suspensão de células isoladas da amostra de medula óssea para coloração de gordura. Para isso, coloque um filtro celular contendo a medula óssea e rosqueie-o na parte superior de um tubo de centrífuga.

Use o êmbolo da seringa para forçar os pedaços de tecido através da malha. Para coletar todo o material, lave com alguns mililitros de tampão de suspensão. Adicione três mililitros de meio de gradiente a um tubo de centrífuga e sobreponha cuidadosamente a suspensão de células isoladas.

Centrifugue o tubo a 550 G a 20 graus Celsius por 30 minutos, com aceleração ajustada em nove e desaceleração em zero. Remova a camada superior contendo plasma e plaquetas com a pipeta, certificando-se de deixar a camada de células mononucleares intacta na interface. Transfira esta camada de células mononucleares para um tubo de centrífuga.

Em seguida, lave as células com 10 mililitros de tampão de suspensão. Centrifugue o tubo a 250 ×g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em dois mililitros de meio de Dulbecco modificado de Isokov completo, por pipetagem.

Para determinar a concentração celular com um hemocitômetro, coloque 95 microlitros de corante azul de tripano 2% em uma placa de 96 poços. Adicione cinco microlitros de suspensão celular, misture bem e incube por um curto período em temperatura ambiente. Preencha o hemocitômetro e observe-o sob microscópio.

Conte apenas as células viáveis coradas. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 250 G a 25 graus Celsius por 10 minutos. Para bloquear o receptor FC, utilize 2,5 microgramas de bloqueador por 100 microlitros.

Incube em gelo por 10 a 15 minutos. Adicione a combinação de anticorpos monoclonais pré-titulados apropriada para o volume utilizado para corar as células. Incube a quatro graus Celsius, no escuro, por 20 minutos.

Lave as células com três mililitros de tampão de marcação e, em seguida, centrifugue. Após ajustar a concentração celular, transfira a suspensão celular para um tubo padrão de citometria de fluxo, pipetando-a através de um filtro celular de 70 microlitros para remover agregados. Em seguida, configure e otimize o classificador de células e o software de acordo com as instruções do fabricante.

Configure um modelo que inclua um gráfico bivariado para exibir a dispersão para frente ou FSC e a dispersão lateral ou SSC. Para posicionar a população celular de interesse na escala, execute as células no classificador e ajuste FSC e SSC. Comece registrando os dados do tubo controle negativo; em seguida, registre os dados de cada tubo controle de compensação com coloração simples e calcule a compensação.

Em seguida, represente as amostras experimentais em um gráfico de dispersão bivariado FSC, SSC para incluir tanto células linfocitárias quanto mieloides. Comparando os diferentes sinais de FSC, exclua dupletos e agregados. Em seguida, visualize as células singletas que exibem CD45 e CD36 em um gráfico de dispersão bivariado.

Eventos positivos para CD45 representam leucócitos e seus progenitores. Eventos negativos para CD45 e positivos para CD36 representam progenitores eritroides. Para definir células positivas para CD36 e positivas para CD45, utilize ferramentas de seleção de população (gating) e, em seguida, visualize os eventos positivos para CD45 e outro gráfico de dispersão exibindo os parâmetros CD34 e SSC.

Em seguida, utilize ferramentas de seleção para definir as células positivas para CD34 ou progenitores de leucócitos e células com alta dispersão lateral (SSC) ou células mieloides em diversos estágios de diferenciação. Depois disso, selecione as janelas para ordenação em tubos de coleta externos. Por fim, prossiga com a separação celular a quatro graus Celsius até obter o número desejado de células.

Dilua as células adicionando meio IMDM completo suplementado com eritropoietina recombinante humana ou EPO. Transfira 300 microlitros das células diluídas para três mililitros de meio H4434 e incube sob agitação à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, plaque três placas de 35 milímetros com um mililitro de suspensão celular cada.

Coloque dois dos recipientes de cultura juntos com um terceiro preenchido com água em uma placa de 100 milímetros. Incube essas células em um incubador umidificado a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, por 14 dias. Utilize um microscópio invertido com aumento de 40x e o recipiente de cultura marcado com uma grade de contagem para avaliar as colônias de acordo com sua morfologia.

Classifique as unidades formadoras de colônias ou UFC em células progenitoras multpotenciais, células progenitoras de granulócitos e monócitos, unidades formadoras de eritróides em aglomerados e unidades formadoras de colônias eritróides. Para começar, recupere as células do fax ou da placa de ensaio de UFC de acordo com o protocolo descrito no texto e prossiga com a extração de DNA. Após a centrifugação das células, utilize um instrumento automatizado de isolamento de DNA sanguíneo para isolar o ácido nucleico do precipitado.

Meça a concentração de DNA utilizando um fluorímetro. Prepare as amostras de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, coloque a amostra na câmara de amostra do fluorímetro. Adicione o DNA diluído a uma mistura de polimerase de DNA, o conjunto de iniciadores e a mistura de reação para montar uma reação de PCR conforme o manual.

Inclua DNA pré-transplante do doador e do receptor, bem como água livre de nucleases, como controle negativo, e 9947A como controle positivo. Para analisar os resultados da PCR, adicione 10 microlitros das amostras de DNA desnaturado aos poços de uma placa de reação de 96 poços. Selle a placa, centrifugue brevemente e coloque a placa sobre gelo.

Progenitores megacariocíticos eritróides classificados como população positiva para CD36 e negativa para o antígeno CD45. Além disso, células positivas para CT45 e células positivas para CD34 são identificadas como precursores linfoides mieloides e células positivas para CD45, com sinal elevado de SSC como células mieloides maduras. A pureza das células progenitoras eritróides após a triagem foi superior a 85%, e a pureza das células mieloides foi superior a 95%. Células da medula óssea separadas por microesferas magnéticas específicas para CD34 foram cultivadas por 14 dias.

Algumas dessas células parecem proliferar, diferenciar-se e formar colônias. A estimulação com várias concentrações de EPO aumentou a formação de colônias eritroides acentuadamente vermelhas. A análise por PCR de repetições em tandem curtas ou STRs específicas para o DNA do receptor e do doador pode detectar quimerismo nas células.

Este método determinou com sucesso a quantidade de DNA de receptor versus doador em células obtidas do fracionamento celular de células da medula óssea, bem como em células obtidas do ensaio clonogênico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que esta técnica precisa ser padronizada e realizada por pessoal devidamente treinado.

Após este procedimento, as células progenitoras eritroides derivadas do doador residuais podem ser analisadas adicionalmente para responder perguntas complementares, como a vantagem seletiva de células-tronco eritroides geneticamente corrigidas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de transplante de células-tronco explorarem a proliferação e diferenciação de progenitores no compartimento eritoide. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar o enxerto após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias.