Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro
July 31st, 2017
Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .
O objetivo geral dessa tecnologia é usar a visão computacional para detectar automaticamente células fluorescentes e realizar o patch clamp automatizado dessas células em fatias cerebrais agudas. Este método pode ajudar a superar as principais dificuldades no campo da eletrofisiologia do patch clamp, como identificação, direcionamento e patch clamp de células marcadas com fluorescência. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode detectar automaticamente pipetas de remendo, células fluorescentes e integrar as etapas com o patch clamp automático.
Essa inovação aumenta significativamente o rendimento experimental. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de distúrbios neurológicos, porque o patch clamp automático guiado por imagem de alto rendimento pode ser usado para triagens farmacológicas em preparações neuronais mais fisiológicas. Este método também pode ser aplicado a outras preparações in vitro, como organelas neuronais típicas, ou culturas de fatias, dissolvem neurônios, bem como quaisquer células não neuronais.
Para iniciar este procedimento, ligue o amplificador, o controlador do microscópio e o controlador do manipulador. Em seguida, execute o Autopatcher IG com python a partir de um terminal de linha de comando, alterando primeiro o diretório onde o Autopatcher IG está instalado. Em seguida, digite Python Autopatcher_IG.
PYW no terminal de linha de comando e pressione a tecla Enter. Depois disso, encha toda a pipeta de vidro com solução interna e carregue-a no estágio principal. Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a em foco.
Se o teclado do mostrador for usado para mover os manipuladores no microscópio stage, atualize as coordenadas pressionando Z no teclado. A calibração primária converte o ângulo e a distância de movimento do manipulador para o sistema de coordenadas do microscópio. O manipulador se desloca em três direções com distância predefinida e o software detecta as coordenadas da ponta da pipeta dentro do campo visual do microscópio.
Clique no botão iniciar calibração na GUI principal da unidade correspondente na qual a pipeta está carregada. Em seguida, salve a calibração clicando em salvar calibração na parte inferior da GUI principal. Esta calibração primária só precisa ser realizada uma vez, a menos que a organização física da plataforma seja alterada.
Nesta etapa, coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de gravação. Estabilize a fatia do cérebro com uma fatia pressionada ou uma harpa. Para detectar a célula fluorescente, encontre a área de interesse sob a ampliação de quatro vezes.
Em seguida, mova a platina do microscópio ativando o modo clique para mover e clique no centro da área de interesse. Como alternativa, use o teclado para mover a platina do microscópio. Em seguida, mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo Z usando RF no teclado.
O software direciona o microscópio e a câmera para capturar uma série de imagens em diferentes profundidades. Em seguida, essas imagens são submetidas a processamento de visão computacional para encontrar células marcadas com fluorescência. A saída final é uma lista de coordenadas de células detectadas.
Clique no botão detectar célula na unidade de coluna principal da GUI zero. Se o LED ou a fonte de luz laser da configuração não puder ser controlado pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED ou o laser. Desligue o LED ou o laser, se necessário.
Uma lista de coordenadas de células aparecerá na GUI de posições de memória. Remova as células indesejadas da lista clicando no botão X ao lado das coordenadas. Como alternativa, se as células-alvo não estiverem marcadas com fluorescência, clique no modo de mouse na GUI principal.
Em seguida, clique na célula de interesse, um ponto amarelo com um número aparecerá na célula e as coordenadas da célula aparecerão na GUI de posições de memória. Para realizar a calibração secundária a fim de detectar as coordenadas de deslocamento da pipeta, preencha 1/3 de uma pipeta de vidro com solução interna. Em seguida, carregue a pipeta no suporte da pipeta preso ao cabeçote.
Em baixa ampliação, use um e dois no teclado para alternar entre a unidade um e a unidade dois. Em seguida, traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco usando o teclado. Em seguida, carregue a calibração primária clicando em calibração de carga.
Mude a lente do microscópio para alta ampliação e clique 40 vezes na GUI principal. Traga a ponta da pipeta para o centro. Em seguida, clique no botão de calibração secundária na GUI principal, abaixo da unidade que está em uso.
Para corrigir uma célula de destino, clique no botão de controle de patch para abrir a GUI de controle de patch. Clique no botão ir para ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na GUI da posição da memória. Em seguida, clique no botão CTM da unidade na GUI principal para habilitar o movimento.
Clique na célula de interesse para mover a ponta da pipeta para a célula. Devido à limitação mecânica do manipulador, ao percorrer uma distância superior a 500 micrômetros, pode haver um pequeno erro de posicionamento. Para evitar um grande erro de posicionamento mecânico, a calibração secundária deve ser realizada perto da célula-alvo.
Em seguida, use o botão selecionado da unidade um para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades. Clique no botão de patch na GUI de controle de patch. O patch automático começará e a pressão e a resistência podem ser monitoradas na GUI de controle do patch.
O algoritmo de patch automático monitora a resistência e controla a pressão por meio de uma série de loops lógicos, para formar um gigaseal. Uma janela pop-up notifica a formação de um gigaseal. O sistema utiliza a mudança de resistência para reconhecer o contato célula-superfície.
Na situação em que o contato célula-superfície não é detectado a tempo, use o botão Avançar para avançar o estágio de patching enquanto permanece no mesmo teste de patch automático. Manipule o processo automático a qualquer momento clicando nos respectivos botões na GUI de controle de patch. Em seguida, selecione sim para interromper com Zap e sucção combinados.
Como alternativa, selecione não para interromper apenas com sucção. Em seguida, salve o log de patch do experimento. Esta figura mostra os locais selecionados carregados na GUI da sequência de comandos.
A coluna da esquerda mostra a lista de coordenadas e a coluna da direita mostra a lista de comandos na forma de sinais TTL para cada local. Aqui estão as capturas de tela durante o experimento de aplicação de drogas, correspondentes aos três locais selecionados. A solução de KCL foi misturada com corante fluorescente vermelho para fins de visualização.
A unidade um era a pipeta contendo KCL e a unidade dois era a pipeta de patch. Nesta figura, as injeções de corrente de degrau mostram um neurônio de pico regular. Aqui são mostrados os traços de registro de grampo de tensão da aplicação local de solução de cloreto de potássio 500 milimolar em três locais.
O traço vermelho com corrente interna foi registrado no ensaio quando a aplicação de cloreto de potássio estava próxima à célula de contato. A seta vermelha indica o momento da aplicação do cloreto de potássio. Usando esse método, pode-se realizar um teste de patch clamp em quatro minutos sem treinamento extensivo em comparação com o patch manual.
Após este procedimento, outros métodos como optogenética, quimiogenética e manipulações farmacológicas, podem ser realizados para responder a perguntas relacionadas ao seu projeto de pesquisa. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para que pesquisadores no campo da neurociência explorem estudos de alto rendimento de receptores sinápticos e canais iônicos em diferentes preparações in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos automatizados de patch clamp guiados por imagem.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para conduzir experimentos de patch-clamp guiados por imagem automática usando tecnologia avançada de visão computacional. Esta abordagem melhora a eficiência de identificação e direcionamento de células marcadas fluorescentemente em fatias cerebrais agudas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Eletrofisiologia
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
Fundamentos
- A eletrofisiologia de patch-clamp é crucial para estudar a atividade neuronal.
- Identificar e direcionar células específicas pode ser desafiador.
- Técnicas automatizadas podem melhorar o rendimento experimental.
- O marcação fluorescente auxilia na identificação de células.
Propósito do Estudo
- Automatizar a detecção de células fluorescentes para experimentos de patch-clamp.
- Aumentar a eficiência das gravações eletrofisiológicas.
- Facilitar triagens farmacológicas em preparações neuronais.
Métodos Utilizados
- Tecnologia de visão computacional para detecção de células.
- Configuração automatizada de patch-clamp para gravação.
- Integração dos processos de detecção e gravação.
- Aplicação a várias preparações neuronais in vitro.
Principais Resultados
- Automatização bem-sucedida da identificação de células e patch-clamp.
- Aumento do rendimento para experimentos eletrofisiológicos.
- Aplicações potenciais em pesquisa farmacológica.
- Versatilidade na aplicação a diferentes tipos celulares.
Conclusões
- Esta técnica melhora significativamente a eficiência experimental.
- Ela aborda desafios-chave nos métodos tradicionais de patch-clamp.
- A abordagem tem implicações para a pesquisa de distúrbios neurológicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
