Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro
31 de julho de 2017
Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .
O objetivo geral dessa tecnologia é usar a visão computacional para detectar automaticamente células fluorescentes e realizar o patch clamp automatizado dessas células em fatias cerebrais agudas. Este método pode ajudar a superar as principais dificuldades no campo da eletrofisiologia do patch clamp, como identificação, direcionamento e patch clamp de células marcadas com fluorescência. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode detectar automaticamente pipetas de remendo, células fluorescentes e integrar as etapas com o patch clamp automático.
Essa inovação aumenta significativamente o rendimento experimental. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de distúrbios neurológicos, porque o patch clamp automático guiado por imagem de alto rendimento pode ser usado para triagens farmacológicas em preparações neuronais mais fisiológicas. Este método também pode ser aplicado a outras preparações in vitro, como organelas neuronais típicas, ou culturas de fatias, dissolvem neurônios, bem como quaisquer células não neuronais.
Para iniciar este procedimento, ligue o amplificador, o controlador do microscópio e o controlador do manipulador. Em seguida, execute o Autopatcher IG com python a partir de um terminal de linha de comando, alterando primeiro o diretório onde o Autopatcher IG está instalado. Em seguida, digite Python Autopatcher_IG.
PYW no terminal de linha de comando e pressione a tecla Enter. Depois disso, encha toda a pipeta de vidro com solução interna e carregue-a no estágio principal. Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a em foco.
Se o teclado do mostrador for usado para mover os manipuladores no microscópio stage, atualize as coordenadas pressionando Z no teclado. A calibração primária converte o ângulo e a distância de movimento do manipulador para o sistema de coordenadas do microscópio. O manipulador se desloca em três direções com distância predefinida e o software detecta as coordenadas da ponta da pipeta dentro do campo visual do microscópio.
Clique no botão iniciar calibração na GUI principal da unidade correspondente na qual a pipeta está carregada. Em seguida, salve a calibração clicando em salvar calibração na parte inferior da GUI principal. Esta calibração primária só precisa ser realizada uma vez, a menos que a organização física da plataforma seja alterada.
Nesta etapa, coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de gravação. Estabilize a fatia do cérebro com uma fatia pressionada ou uma harpa. Para detectar a célula fluorescente, encontre a área de interesse sob a ampliação de quatro vezes.
Em seguida, mova a platina do microscópio ativando o modo clique para mover e clique no centro da área de interesse. Como alternativa, use o teclado para mover a platina do microscópio. Em seguida, mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo Z usando RF no teclado.
O software direciona o microscópio e a câmera para capturar uma série de imagens em diferentes profundidades. Em seguida, essas imagens são submetidas a processamento de visão computacional para encontrar células marcadas com fluorescência. A saída final é uma lista de coordenadas de células detectadas.
Clique no botão detectar célula na unidade de coluna principal da GUI zero. Se o LED ou a fonte de luz laser da configuração não puder ser controlado pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED ou o laser. Desligue o LED ou o laser, se necessário.
Uma lista de coordenadas de células aparecerá na GUI de posições de memória. Remova as células indesejadas da lista clicando no botão X ao lado das coordenadas. Como alternativa, se as células-alvo não estiverem marcadas com fluorescência, clique no modo de mouse na GUI principal.
Em seguida, clique na célula de interesse, um ponto amarelo com um número aparecerá na célula e as coordenadas da célula aparecerão na GUI de posições de memória. Para realizar a calibração secundária a fim de detectar as coordenadas de deslocamento da pipeta, preencha 1/3 de uma pipeta de vidro com solução interna. Em seguida, carregue a pipeta no suporte da pipeta preso ao cabeçote.
Em baixa ampliação, use um e dois no teclado para alternar entre a unidade um e a unidade dois. Em seguida, traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco usando o teclado. Em seguida, carregue a calibração primária clicando em calibração de carga.
Mude a lente do microscópio para alta ampliação e clique 40 vezes na GUI principal. Traga a ponta da pipeta para o centro. Em seguida, clique no botão de calibração secundária na GUI principal, abaixo da unidade que está em uso.
Para corrigir uma célula de destino, clique no botão de controle de patch para abrir a GUI de controle de patch. Clique no botão ir para ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na GUI da posição da memória. Em seguida, clique no botão CTM da unidade na GUI principal para habilitar o movimento.
Clique na célula de interesse para mover a ponta da pipeta para a célula. Devido à limitação mecânica do manipulador, ao percorrer uma distância superior a 500 micrômetros, pode haver um pequeno erro de posicionamento. Para evitar um grande erro de posicionamento mecânico, a calibração secundária deve ser realizada perto da célula-alvo.
Em seguida, use o botão selecionado da unidade um para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades. Clique no botão de patch na GUI de controle de patch. O patch automático começará e a pressão e a resistência podem ser monitoradas na GUI de controle do patch.
O algoritmo de patch automático monitora a resistência e controla a pressão por meio de uma série de loops lógicos, para formar um gigaseal. Uma janela pop-up notifica a formação de um gigaseal. O sistema utiliza a mudança de resistência para reconhecer o contato célula-superfície.
Na situação em que o contato célula-superfície não é detectado a tempo, use o botão Avançar para avançar o estágio de patching enquanto permanece no mesmo teste de patch automático. Manipule o processo automático a qualquer momento clicando nos respectivos botões na GUI de controle de patch. Em seguida, selecione sim para interromper com Zap e sucção combinados.
Como alternativa, selecione não para interromper apenas com sucção. Em seguida, salve o log de patch do experimento. Esta figura mostra os locais selecionados carregados na GUI da sequência de comandos.
A coluna da esquerda mostra a lista de coordenadas e a coluna da direita mostra a lista de comandos na forma de sinais TTL para cada local. Aqui estão as capturas de tela durante o experimento de aplicação de drogas, correspondentes aos três locais selecionados. A solução de KCL foi misturada com corante fluorescente vermelho para fins de visualização.
A unidade um era a pipeta contendo KCL e a unidade dois era a pipeta de patch. Nesta figura, as injeções de corrente de degrau mostram um neurônio de pico regular. Aqui são mostrados os traços de registro de grampo de tensão da aplicação local de solução de cloreto de potássio 500 milimolar em três locais.
O traço vermelho com corrente interna foi registrado no ensaio quando a aplicação de cloreto de potássio estava próxima à célula de contato. A seta vermelha indica o momento da aplicação do cloreto de potássio. Usando esse método, pode-se realizar um teste de patch clamp em quatro minutos sem treinamento extensivo em comparação com o patch manual.
Após este procedimento, outros métodos como optogenética, quimiogenética e manipulações farmacológicas, podem ser realizados para responder a perguntas relacionadas ao seu projeto de pesquisa. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para que pesquisadores no campo da neurociência explorem estudos de alto rendimento de receptores sinápticos e canais iônicos em diferentes preparações in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos automatizados de patch clamp guiados por imagem.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para realizar experimentos automatizados de patch-clamp guiados por imagem, utilizando tecnologia avançada de visão computacional. Esta abordagem aumenta a eficiência na identificação e no direcionamento de células marcadas com fluorescência em fatias cerebrais agudas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Eletrfisiologia
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- A eletrofisiologia com eletrodo de patch é fundamental para o estudo da atividade neuronal.
- A identificação e o direcionamento de células específicas podem ser desafiadores.
- Técnicas automatizadas podem melhorar a produtividade experimental.
- A marcação fluorescente auxilia na identificação de células.
Objetivo do Estudo
- Automatizar a detecção de células fluorescentes para experimentos de patch-clamp.
- Aumentar a eficiência de gravações eletrofisiológicas.
- Facilitar triagens farmacológicas em preparações neuronais.
Métodos Utilizados
- Tecnologia de visão computacional para detecção de células.
- Configuração automatizada de patch-clamp para gravação.
- Integração dos processos de detecção e gravação.
- Aplicação a diversos preparos neuronais in vitro.
Resultados Principais
- Automação bem-sucedida da identificação celular e do patch-clamp.
- Aumento da produtividade em experimentos eletrofisiológicos.
- Aplicações potenciais em pesquisas farmacológicas.
- Versatilidade na aplicação a diferentes tipos celulares.
Conclusões
- Essa técnica aumenta significativamente a eficiência experimental.
- Aborda desafios fundamentais dos métodos tradicionais de patch-clamp.
- A abordagem tem implicações para a pesquisa de distúrbios neurológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A técnica automatizada de patch clamp guiada por imagem resolve as limitações de produtividade na eletrofisiologia neuronal, permitindo a validação funcional escalonável de canais iônicos e receptores sinápticos. Essa capacidade apoia fluxos de trabalho de descoberta precoce ao reduzir a variabilidade técnica e aumentar a densidade de dados em campanhas de identificação de compostos líderes. O método aumenta a confiabilidade preditiva na validação de alvos ao fornecer leituras eletrofisiológicas quantitativas e reprodutíveis a partir de preparações neuronais fisiologicamente relevantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da medição direta da excitabilidade neuronal e das propriedades sinápticas em células marcadas com fluorescência.
- Valor Operacional: Reduz a dependência de operadores especializados, padronizando a execução do patch clamp entre diferentes usuários e locais.
- Valor Preditivo: Aumenta o rendimento de dados por experimento, apoiando o rigor estatístico em estudos de engajamento de alvo e mecanismo de ação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão para Ensaios: Gera preparações neuronais padronizadas adequadas para campanhas downstream de triagem farmacológica e genética.
- Saída Quantitativa: Fornece métricas automatizadas de resistência e pressão em tempo real, permitindo a detecção de formação de selamento e a otimização do processo.
- Escalabilidade: Permite o direcionamento multiplexado de múltiplas células por fatia, aumentando a densidade experimental sem aumentos proporcionais no tempo de operador.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Facilita o estudo de fenótipos neuronais em fatias cerebrais agudas, mantendo a circuitria nativa e o contexto fisiopatológico.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a eletrofisiologia de descoberta com a validação pré-clínica, permitindo leituras consistentes entre sistemas modelo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação direta dos efeitos de compostos sobre a função de canais iônicos e padrões de disparo neuronal em tecido intacto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta como uma etapa de validação funcional após a identificação do alvo e anterior à otimização do composto líder, fornecendo confirmação eletrofisiológica do engajamento do alvo em ambientes neuronais nativos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir o registro automatizado e de alta fidelidade da atividade neuronal em resposta a perturbações farmacológicas ou genéticas.
- Triagem: Melhora a reprodutibilidade e a produtividade do ensaio, permitindo a avaliação sistemática de bibliotecas de compostos quanto à excitabilidade neuronal e à transmissão sináptica.
- Análises: Fornece leituras eletrofisiológicas quantitativas (por exemplo, frequência de disparos, resistência de entrada, relações corrente-voltagem) que informam relações estrutura-atividade e seletividade de alvo.
- Pesquisa Translacional: Mantém a relevância fisiológica ao registrar neurônios em fatias cerebrais agudas, preservando perfis de expressão nativos e sinais do microambiente.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de eletrofisiologia reutilizável, aplicável em diversos programas de descoberta em neurociência voltados a canais iônicos, RCPGs e proteínas sinápticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança na validação de alvos por meio da medição direta e quantitativa da função neuronal em preparações fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Aumenta a produtividade experimental e reduz a variabilidade por meio da automação da detecção de células, direcionamento e execução do patch.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de avançar/não avançar ao gerar dados funcionais robustos no início do processo de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na modulação eletrofisiológica confirmada em circuitos neuronais relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia, integração de visão computacional e operação de micromanipuladores para configuração e solução de problemas do sistema.
- Depende de marcação fluorescente estável, preparação adequada de pipetas de patch e controle ambiental para manutenção saudável de fatias.
- Necessita de protocolos de software padronizados e procedimentos de calibração para garantir reprodutibilidade entre experimentos e usuários.
- A adaptação a tipos celulares não neuronais ou dissociados pode exigir ajustes nos algoritmos de detecção e nos parâmetros de selamento.
- As limitações práticas incluem erros de posicionamento mecânico em distâncias longas de deslocamento e dependência de razões ótimas de sinal fluorescente-ruído para detecção confiável de células.
