Name: Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a técnica de patch-clamp automatizado guiado por imagem para detectar neurônios fluorescentes em fatias de cérebro. Este método aumenta significativamente a eficiência experimental em estudos eletrofisiológicos.

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Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Whitehall. Gostaríamos de agradecer Samuel T. Kissinger pelos valiosos comentários.

1. Configuração do sistema <ol><li> Construa a unidade de controle de pressão. <ol><li> Monte a unidade de controle de pressão de acordo com o mapa de circuitos ( Figura 1 ). Solde as peças necessárias na placa de circuito impresso (PCB) fabricada de acordo com os esquemas do circuito elétrico ( Figura 1b ). Use resistências padrão, LEDs, Transistores de Efeito de Campo-Óxido de Metal-Óxido (MOSFETs), capacitores e conectores (veja a Tabela de Materiais ). Solde as válvulas de solenóide na PCB. Conecte a bomba de ar e o sensor de pressão de ar à PCB com fio elétrico. NOTA: Deve demorar cerca de 2 h para construir a unidade de controle de pressão com todas as peças necessárias disponíveis. </li></ol></li><li> Conecte a placa de aquisição de dados secundária (DAQ). <ol><li> Conecte as saídas de dados da placa de circuito impresso à placa DAQ, seguindo a Tabela 1 . NOTA: A placa DAQ iráEu estou correndo em &quot;Modo single-ended&quot;. O mapa de portas pode ser encontrado no manual do usuário (veja a Tabela de Materiais ). </li><li> Conecte &quot;AIn Pr S&quot; a um dos canais de entrada analógica (AI) e &quot;R-Gr&quot; a um dos motivos analógicos na placa DAQ secundária. </li><li> Conecte a saída primária do amplificador a um dos canais AI e o chão ao solo analógico da placa DAQ secundária. NOTA: Um cabo BNC padrão pode ser usado para conectar a saída primária do amplificador. </li><li> Tire a outra extremidade e conecte o sinal positivo ( ou seja, o núcleo de cobre) ao canal AI e ao solo ( ou seja, o fio fino ao redor do núcleo) ao solo analógico. Repita esta etapa para um segundo canal se for utilizado mais de um canal de patch. NOTA: A entrada analógica para a placa DAQ será configurada em etapas posteriores. </li><li> Conecte a alimentação à saída de energia da placa DAQ secundária. Use uma energia separada de 12 V paraPara a bomba. </li></ol></li><li> Conecte a tubulação. <ol><li> Conecte a bomba de ar e as duas válvulas de acordo com a Tabela 2 . Use um conector de 3 vias para conectar a tubagem macia da porta superior da válvula 2, do sensor de pressão e do suporte da pipeta na última etapa. </li><li> Adicione outro conector de 3 vias à tubulação conectada ao suporte da pipeta se forem usadas duas pipetas. Alternar manualmente entre as válvulas e as pipetas em uso ao corrigir. </li></ol></li><li> Instale o Autopatcher IG. NOTA: Requisito do sistema: O Autopatcher IG só foi testado em um PC com o Windows 7. Não foi validado para outros sistemas operacionais. O procedimento descrito aplica-se especificamente ao hardware listado na Tabela de Materiais. <ol><li> Faça o download do Autopatcher-IG do GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Instale o Python (veja a Tabela de Materiais para a versão e o endereço de download). </li><li> Desinstale o PyQt4Biblioteca digitando &quot;pip desinstalar PyQt4&quot; em um terminal de linha de comando. NOTA: O sistema usa uma versão mais antiga da biblioteca PyQt4 para obter compatibilidade com as bibliotecas Qwt e Opencv. </li><li> Instale bibliotecas Python a partir de arquivos de roda históricos (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encontre os seguintes arquivos: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Para instalar os arquivos de roda, vá para o diretório onde os arquivos são salvos e digite &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl&quot;. Substitua &quot;*** wheelfilename ***&quot; com o nome real do arquivo. NOTA: &quot;cp27&quot; no nome do arquivo da roda indica Python 2.7 e &quot;win32&quot; indicou Windows 32-bit. Se &quot;win32&quot; não funcionar, tente &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Para controlar a câmera CCD, baixe e instale o instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Em seguida, baixe o MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar a câmera em Python. </li><li> Para controlar os manipuladores e o estágio do microscópio, instale o software de controle fornecido pelo fabricante. NOTA: Ao fazer isso, o driver necessário para controlar os manipuladores também está instalado. O pacote de instalação geralmente é fornecido em um CD-ROM. </li><li> Para controlar a placa DAQ secundária, instale a Biblioteca Universal a partir do CD-ROM, com a compra da placa DAQ. </li></ol></li><li> Configure o hardware para Autopatcher IG. <ol><li> Conecte os controladores do palco do microscópio e do manipulador ao computador via portas USB. </li><li> Atribua números de porta COM à unidade 0: etapa do microscópio, unidade 1: manipulador esquerdo e unidade 2: manipulador direito, nesta ordem, no arquivo de configuração &quot;ports.csv&quot; na pasta &quot;configuração&quot;. euEave os outros parâmetros no arquivo ports.csv ( ou seja, &quot;SCI&quot; ​​e &quot;1&quot;) inalterados. NOTA: As informações do número da porta COM podem ser encontradas executando o software de configuração do manipulador fornecido pelo fabricante. Vá para a guia &quot;configurações&quot;, selecione &quot;configurações&quot; e a página &quot;Movimento&quot;, e leia as etiquetas para cada guia na parte superior. Alternativamente, esta informação pode ser encontrada no PC Device Manager. </li><li> Atribua números de canais de entrada analógicos na placa DAQ para um sensor de pressão e canal de parches 1 e 2 (correspondente às unidades 1 e 2). Digite o número do canal no arquivo &quot;DAQchannels.csv&quot; na pasta &quot;configuração&quot;. NOTA: Recomenda-se abrir os arquivos .csv com o aplicativo Notepad em vez de uma planilha, pois pode alterar as informações ao salvar as alterações. </li></ol></li><li> Execute o Autopatcher IG. <ol><li> Ligue o amplificador, controlador de microscópio e controlador de manipulador. EnsuRe que o software do amplificador está funcionando. </li><li> Execute Autopatcher IG com Python a partir de um terminal de linha de comando da seguinte maneira: primeiro, altere o diretório (comando &quot;cd&quot; para os terminais mais comuns) onde Autopatcher IG está instalado, digite &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; no terminal da linha de comando e pressione o botão &quot;Tecla Enter. NOTA: Não execute o software de controle do manipulador antes de executar o Autopatcher IG porque ele ocupará o estágio do microscópio e manipulador, fazendo com que o Autopatcher IG não consiga encontrar o hardware. O software de controle do manipulador pode ser executado depois que o Autopatcher IG é totalmente iniciado se houver módulos adicionais a serem controlados ( por exemplo, o aquecedor em linha). </li></ol></li><li> Calibre a pipeta primária. <ol><li> Puxe as pipetas de remendo como descrito anteriormente 9 . Preencha uma pipeta de vidro puxada com solução interna e carregue-a na fase principal. NOTA: as pipetas de vidro vazias têm diferentes contrastesO microscópio e pode levar a uma calibração imprecisa. </li><li> Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a no foco. Se o teclado de discagem for usado para mover os manipuladores e / ou o estágio do microscópio, atualize as coordenadas pressionando &quot;z&quot; no teclado. NOTA: Esta ação não é necessária se o teclado (etapa do microscópio: A / D - eixo x, eixo W / S-y, eixo R / F-z; manipuladores: H / K - eixo x, U / O eixo J-Y, O / L - eixo z, número de 1/2 unidade) é usado para controlar o movimento porque as coordenadas serão atualizadas em tempo real. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar calibração&quot; na interface gráfica do usuário principal (GUI) para a unidade correspondente na qual a pipeta está carregada ( Figura 2 ). NOTA: Uma janela pop-up aparecerá quando a calibração estiver concluída. NOTA: A calibração será realizada automaticamente, o que levará cerca de 3,5 min. Clicando no mesmo botão (comutado agora para &quot;cancelar calibração&quot; afCalibração iniciadora) abortará a tentativa de calibração. </li><li> Salve a calibração clicando em &quot;Salvar calibração&quot; na parte inferior da GUI principal (economiza a calibração atual para ambos os manipuladores e pode ser carregada no futuro). NOTA: O campo de exibição sob ampliação baixa (4 ou 10X) e alta (40X) deve ser alinhado para que a calibração secundária funcione corretamente. Consulte o manual do usuário do sistema óptico em uso para os procedimentos de alinhamento. </li></ol></li></ol> 2. Procedimento automático de grampeamento de patch <ol><li> Prepare fatias cerebrais agudas, como descrito anteriormente 10 . </li><li> Prepare pipetas de vidro para o grampo de patch. </li><li> Coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de gravação. Estabilize a fatia com uma fatia de retenção ou &quot;harpa&quot;. </li><li> Detectar a célula fluorescente. <ol><li> Encontre a área de interesse sob a lente 4X. Mova a fase do microscópio ativando o cliModo ck-to-move (&quot;CTM&quot;) e clique no centro da área de interesse. Alternativamente, use o teclado para mover o estágio do microscópio (A / D - eixo dos x, eixo W / S-y, eixo R / F-z). </li><li> Mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo z, usando R / F no teclado. NOTA: Recomenda-se ajustar o nível do banho de água para que o plano focal sob as lentes de alta e alta ampliação seja o mesmo ou similar no eixo z. </li><li> Clique no botão &quot;Detectar célula&quot; na coluna GUI principal, &quot;Unidade 0.&quot; Se o LED ou a fonte de luz laser da configuração não puderem ser controlados pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED / laser; Uma janela pop-up aparecerá quando a detecção da célula estiver concluída. <ol><li> Desligue o LED / laser, se necessário; Uma lista de coordenadas de célula aparecerá na GUI de &quot;posições de memória&quot;. Remova as células indesejadas da lista clicando no botão &quot;X&quot; ao lado das coordenadas. </li><li>Alternativamente, se as células-alvo não estiverem rotuladas de forma fluorescente, clique em &quot;Modo do mouse&quot; na GUI principal. Clique na célula de interesse; Um ponto amarelo com um número aparecerá na célula, e as coordenadas da célula aparecerão na GUI das &quot;posições de memória&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibre a pipeta secundária. <ol><li> Preencha 1/3 de uma pipeta de vidro com solução interna. Coloque a pipeta no suporte da pipeta anexada ao estágio da cabeça. </li><li> Use a lente de baixa ampliação. Traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco usando o teclado (H / K - eixo x, eixo U / J - y, eixo O / L - Z). Use &quot;1&quot; e &quot;2&quot; para alternar entre a unidade 1 ea unidade 2. </li><li> Carregue a calibração primária clicando em &quot;Carregar calibração&quot;. Clique no botão &quot;Calibração secundária&quot; na GUI principal sob a unidade que está em uso. Por exemplo, se a unidade 2 estiver em uso, clique no botão &quot;Calibração secundária&quot; no &quot;Unidade 2&quot; coLumn. Siga as instruções da janela pop-up para alternar para a lente de alta ampliação. </li></ol></li><li> Remova uma célula alvo. <ol><li> Verifique se o software &quot;MultiClamp&quot; ( ou seja, amplificador) está sendo executado. Clique no botão &quot;Patch Control&quot; para abrir a GUI &quot;Patch Control&quot;; Pode demorar até alguns minutos para abrir esta GUI. </li><li> Use a lente de ampliação 40X, verificando &quot;40X&quot; na coluna GUI principal &quot;Unidade 0&quot;. Clique no botão &quot;ir para&quot; ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na GUI da &quot;posição de memória&quot;; O microscópio se moverá para a célula. </li><li> Clique no botão CTM da unidade em uso na GUI principal para ativar o movimento após o clique do mouse. Clique na célula de interesse; A ponta da pipeta vai se mover para a célula. </li><li> Clique no botão &quot;Patch&quot; na GUI &quot;Patch Control&quot;. NOTA: Parágrafo automático começará, e a pressão e a resistência podem ser monitoradasA GUI &quot;Patch Control&quot;. <ol><li> Use o botão &quot;Unidade 1 selecionada&quot; para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades. NOTA: O sistema abordará a célula alvo, aplicará pressão negativa, combinará o potencial da membrana celular e detectará a formação de gigasea com base em uma série de limiares e lógica de pressão e resistência. </li><li> Manipule o processo automático em qualquer ponto clicando nos respectivos botões na GUI &quot;Patch Control&quot;. Por exemplo, clique no botão &quot;Patch&quot; novamente para cancelar o teste do patch e clique em &quot;Próxima etapa&quot; para avançar o processo de correção para o próximo passo, independentemente do limite. NOTA: Uma janela pop-up notificará o usuário quando um gigaseal se formou, e a opção de aplicar zap juntamente com grande pressão negativa será apresentada. </li></ol></li><li> Selecione &quot;Sim&quot; para entrar com zap combinado e sucção. Alternativamente, selecione &quot;Não&quot; para entrar apenas com sucção. <br/&gt; NOTA: Quando um patch completo de células inteiras for concluído, uma janela pop-up lembrará o usuário de salvar o log de patch da experiência. </li><li> Salve o log de patch do experimento. NOTA: se um teste de patches não for bem sucedido, uma janela pop-up notificará o usuário e o processo de patch será reiniciado. </li><li> Volte para a etapa 2.4 e repita as etapas com uma célula diferente. </li></ol></li><li> Refinar os limites de patches (opcional). NOTA: Limiares para a faixa inicial de resistência à pipeta, pressão positiva e negativa, resistência gigaseal, etc. Pode ser modificado a partir de um arquivo de configuração. <ol><li> Abra o arquivo &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; na pasta &quot;Configuração&quot; no destino onde o sistema está instalado. Altere os números correspondentes a cada valor de limiar. Não altere os nomes dos valores; Isso resultará em entradas irreconhecíveis no sistema. </li><li> Implementar os novos valores de limiar imediatamente pressionando &quot;CtRl + L &quot;sem reiniciar o programa; o reinício do programa implementará o valor de limiar mais recente do arquivo. </li></ol></li></ol> 3. Realizar gravações NOTA: O modo no amplificador de microeletrodos controlado pelo computador será ajustado automaticamente para a Clamp atual (&quot;IC&quot;) pelo software autopatcher uma vez que um patch bem-sucedido tenha sido alcançado. As gravações de grampos de patch de células inteiras podem ser feitas usando o software de gravação de eleição (este sistema não inclui uma função de gravação). Se várias células alvo foram identificadas, depois de terminar uma gravação, volte para o passo 2.4 e tente outra célula. <ol><li> Execute experimentos de aplicação de medicamentos locais automáticos usando um picospritzer (opcional). NOTA: Aqui, um experimento de aplicação de medicamento local é usado como um exemplo para descrever como usar a função adicional de &quot;seqüência de comando&quot; para controlar hardware externo através de sinais TTL. <ol><li> Conecte a porta A chaNnel 0 e o chão na placa DAQ secundária para a entrada de disparo inicial no digitalizador usando um cabo BNC despojado (conforme descrito no passo 1.2.3). Conecte um canal de saída digital no digitalizador ao gatilho externo no picospritzer. </li><li> Prepare o picospritzer de acordo com o manual do usuário. Conecte a saída de ar de picospritzer ao suporte de pipeta de droga-puff anexado a um micromanipulador. </li><li> Carregue uma pipeta preenchida com uma droga de escolha. Anexe-o ao titular da pipeta. Calibre a pipeta, conforme descrito no passo 1.7. </li><li> Depois de corrigir uma célula conforme descrito no passo 2.6, selecione um local desejado para entrega de drogas clicando com o mouse na GUI de visualização da câmera em &quot;modo mouse&quot; (comutação da GUI principal). Alternativamente, use a GUI &quot;Grid&quot; para projetar uma grade, com cada pixel na grade como um dos locais alvo. NOTA: A grade pode ser manipulada na GUI de visualização da câmera arrastando com o mouse. </li><li> No comando &quot;SequGUI, selecione a unidade de manipulação em que a pipeta do medicamento está montada. Clique em &quot;carregar pontos do mouse&quot; ou &quot;carregar pontos da grade&quot; para importar todas as coordenadas para a entrega do medicamento. <ol><li> Clique em cada entrada de coordenadas para editar o sinal TTL do comando específico na coluna da direita. Na primeira entrada do comando, clique no dígito mais à direita para ativá-lo de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, enviando um sinal TTL de + 5-V. Defina o tempo (T) para a duração desejada do sinal TTL, em ms. </li><li> Na segunda entrada de comando, ajuste todos os dígitos para &quot;0&quot; e ajuste T para a duração do tempo de gravação do teste. Edite comandos para todas as entradas de coordenadas. Adicione entradas de comando clicando em &quot;+&quot; se forem necessários vários sinais TTL. NOTA: Os bits de 8 dígitos representam os canais da porta A 0-7 no DAQ secundário (as portas 1 a 3 são ocupadas pela bomba e duas válvulas) podem ser comutadas, se necessário. </li></ol></li><li> Crie um protocolo de gravação no módulo de aquisição de dados paraQue o início de uma varredura é desencadeado pelo gatilho de início externo. Edite o protocolo para entregar o medicamento no horário desejado. </li><li> Na GUI do &quot;Sequência de Comando&quot;, clique em &quot;Executar&quot; à esquerda para executar todas as coordenadas. Alternativamente, clique em &quot;Executar&quot; à direita para executar apenas a seqüência selecionada. NOTA: A pipeta se moverá para cada coordenada e executará o sinal TTL conforme definido para iniciar a varredura de gravação. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Um pedido de patente não provisório &quot;SISTEMAS E MÉTODOS PARA A ELECTROFISIOLOGIA DE PATCH-CLAMP PATCH GUIADA AUTOMÁTICA EM VITRO&quot;, US Número de Série: 15 / 353.719, foi arquivado em 16 de novembro de 2016, Ref. No.: PRF 67270-02.

Aqui, descrevemos um método para gravações automáticas de grampos de patch guiados por imagem in vitro . Os passos principais neste processo estão resumidos da seguinte forma. Primeiro, a visão computacional é usada para reconhecer automaticamente a ponta da pipeta usando uma série de imagens adquiridas através de um microscópio. Esta informação é então utilizada para calcular a função de transformação de coordenadas entre o microscópio e os sistemas de coordenadas do manipulador. A visão computacional é usada ...

A técnica de grampos de parches foi desenvolvida pela primeira vez por Neher e Sakmann na década de 1970 para estudar os canais iônicos de membranas excitáveis 1 . Desde então, o aperto de patch foi aplicado ao estudo de vários assuntos diferentes a nível celular, sináptico e de circuito - tanto in vitro como in vivo - em vários tipos de células diferentes, incluindo neurônios, cardiomiócitos, oócitos Xenopus e lipossomas artificiais 2 . Este processo envolve a identificação correta e a segmentação de uma célula de interesse, o controle intrincado de micromanipulador para mover a pipeta de remendo próxima à célula, a aplicação de pressão positiva e negativa para a pipeta no momento adequado para estabelecer um patch gigaseal apertado, E uma invasão para estabelecer uma configuração de patch de células inteiras. O aperto do patch normalmente é conduzido manualmente e requer treinamento extensivo para dominar. Mesmo para um pesquisador com o patchClamp, a taxa de sucesso é relativamente baixa. Mais recentemente, várias tentativas foram feitas para automatizar experiências de patch-clamp. Duas estratégias principais evoluíram para realizar a automação: aumentando o equipamento padrão de grampo de patch para fornecer controle automático do processo de correção e o design de novos equipamentos e técnicas desde o início. A estratégia anterior é adaptável ao hardware existente e pode ser usada em uma variedade de aplicações de grampos patch, incluindo grampos de patch cegos in vivo 3 , 4 , 5 , grampo de patch in vitro de fatias de cérebro agudo, culturas de fatia organotípicas e neurônios dissociados cultivados 6 . Ele permite a interrogação de circuitos locais complexos usando múltiplos micromanipuladores simultaneamente 7 . O método de patch planar é um exemplo da nova estratégia de desenvolvimento, que pode atingir o alto desempenho simultâneo pBraçadeira de grampo de células em suspensão para fins de triagem de drogas 8 . No entanto, o método de patch plano não é aplicável a todos os tipos de células, particularmente neurônios com processos longos ou circuitos intactos contendo conexões extensas. Isso limita sua aplicação ao mapeamento dos intrincados circuitos do sistema nervoso, que é uma vantagem fundamental da tecnologia tradicional de grampos de patch. Desenvolvemos um sistema que automatiza o processo de grampeamento manual in vitro , aumentando o hardware padrão de grampos de parafusos. Nosso sistema, Autopatcher IG, fornece calibração automática de pipeta, identificação de alvo de célula fluorescente, controle automático de movimento de pipeta, patches automáticos completos e registro de dados. O sistema pode adquirir automaticamente múltiplas imagens de fatias de cérebro em diferentes profundidades; Analise-os usando a visão por computador; E extrair informações, incluindo as coordenadas de células com marcação fluorescente. Esta informação pode então serUsado para segmentar e corrigir automaticamente células de interesse. O software está escrito em Python - uma linguagem de programação livre e de código aberto - usando várias bibliotecas de fonte aberta. Isso garante a sua acessibilidade a outros pesquisadores e melhora a reprodutibilidade e o rigor das experiências de eletrofisiologia. O sistema possui um design modular, de modo que o hardware adicional pode ser facilmente interagido com o sistema atual demonstrado aqui.

<table><tbody><tr><td>Câmera CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Inclui microscópio e manipuladores. O software de controle do manipulador fornecido pelo fabricante demonstrado neste manuscrito é " Linlab2".</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>amplificador de microeletrodo controlado por computador Digitalizador</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz LED</td><td>LED frio</td><td>pE-100 Comprimento de</td><td>onda de 488 nm</td></tr><tr><td>Placa de aquisição de dados</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ. Consulte o manual em: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Válvulas solenóides</td><td>A Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>Bomba de ar</td><td>Indústria virtual</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de pressão de ar</td><td>Semicondutor Freescale</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>versão 2.7 (32 bits para windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Terminais de Parafuso</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Terminais de Parafuso 3,5 mm Passo (2 Pinos</td></tr><tr><td>) (2 Pinos)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>Soquetes DIP Solda Cauda - 8 Pinos</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Vermelho Básico 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Alimentação de Parede - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Fio de Conexão - Sortimento (Núcleo Sólido, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Trava Macho x Fêmea x Fêmea Torneira</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Flexíveis Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Fisher</td><td>scientific</td><td>14-171-129</td><td>Diâmetro externo: 1/8 pol. Diâmetro interno: 1/16 pol.</td></tr><tr><td>Cabo coaxial macho BNC para cabo coaxial macho</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>Resistor de 560 Ohms (tolerância de 5%)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Válvula Geral</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

O grampo de patch de células inteiras é o método padrão de ouro para medir as propriedades elétricas de células isoladas. No entanto, o grampo de patch in vitro continua a ser uma técnica desafiadora e de baixo débito devido à sua complexidade e alta dependência da operação e controle do usuário. Este manuscrito demonstra um sistema de grampo de correção automático guiado por imagem para experiências in vitro de grampos de grampos de células inteiras em fatias agudas do cérebro. Nosso sistema implementa um algoritmo baseado em visão computacional para detectar células marcadas com fluorescência e direcioná-las para o patch totalmente automático usando um micromanipulador e controle de pressão interna da pipeta. Todo o processo é altamente automatizado, com requisitos mínimos para a intervenção humana. As informações experimentais em tempo real, incluindo a resistência elétrica e a pressão interna da pipeta, são documentadas eletronicamente para análise futura e para otimização para diferentes tipos de células. Embora o nosso sistema seja descrito no contexto do brai agudoN grava gravações, também pode ser aplicada à braçadeira automatizada de patch guiada por imagem de neurônios dissociados, culturas de fatias organotípicas e outros tipos de células não neuronais.

<html> Nosso sistema foi testado em sua capacidade de remendar células em fatias agudas do cérebro, células tumorais pluripotentes induzidas por mouse (iPSCs) diferenciadas em neurônios e células HEK 293 que expressam artificialmente canais de interesse. A Figura 3 mostra uma experiência utilizando ratinhos transgênicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) visando os neurônios piramidais da camada 5 marcados fluorescentemente no córtex visua...

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

O objetivo geral desta tecnologia é utilizar a visão computacional para detectar automaticamente células fluorescentes e realizar o patch clamp automatizado dessas células em fatias cerebrais agudas. Este método pode ajudar a superar dificuldades importantes no campo da eletrofisiologia por patch clamp, como a identificação, o direcionamento e o patch clamp de células marcadas com fluorescência. A principal vantagem desta técnica é que ela pode detectar automaticamente pipetas de patch, células fluorescentes e integrar os passos com o patch clamp automático.Essa inovação aumenta significativamente a produtividade experimental. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de distúrbios neurológicos, pois o registro de potencial por patch clamp automático guiado por imagem de alto rendimento pode ser utilizado em triagens farmacológicas em preparações neuronais mais fisiológicas. Este método também pode ser aplicado a outras preparações in vitro, como organelas neuronais típicas, culturas de fatias, neurônios dissociados, bem como quaisquer células não neuronais.Para iniciar este procedimento, ligue o amplificador, o controlador do microscópio e o controlador do manipulador. Em seguida, execute o Autopatcher IG com o Python a partir de um terminal de linha de comando, primeiro alterando o diretório onde o Autopatcher IG está instalado. Depois, digite Python Autopatcher_IG.PYW no terminal de linha de comando e pressione a tecla enter. Em seguida, encha completamente a pipeta de vidro com a solução interna e carregue-a no estágio. Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a em foco.Se o teclado numérico for usado para mover os manipuladores no estágio do microscópio, atualize as coordenadas pressionando Z no teclado. A calibração primária converte o ângulo e a distância de movimento do manipulador para o sistema de coordenadas do microscópio. O manipulador se desloca em três direções com distância predefinida e o software detecta as coordenadas da ponta da pipeta dentro do campo visual do microscópio.Clique no botão iniciar calibração na interface gráfica principal para a unidade correspondente na qual a pipeta está carregada. Posteriormente, salve a calibração clicando em salvar calibração na parte inferior da interface gráfica principal. Essa calibração primária só precisa ser realizada uma vez, a menos que a organização física do equipamento seja alterada.Nesta etapa, coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de registro. Estabilize a fatia de cérebro com um suporte para fatias ou um harp. Para detectar a célula fluorescente, localize a área de interesse sob ampliação de quatro vezes.Em seguida, mova a platina do microscópio ativando o modo de clique para mover e clique no centro da área de interesse. Alternativamente, use o teclado numérico para mover a platina do microscópio. Depois, mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo Z utilizando o RF no teclado numérico.O software orienta o microscópio e a câmera a capturar uma série de imagens em diferentes profundidades. Em seguida, essas imagens são submetidas a um processamento por visão computacional para identificar células marcadas com fluorescência. A saída final é uma lista de coordenadas das células detectadas.Clique no botão detectar célula na unidade da coluna principal zero da interface gráfica. Se a fonte de luz LED ou laser do equipamento não puder ser controlada pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED ou o laser. Desligue o LED ou o laser, se necessário.Uma lista de coordenadas celulares aparecerá na interface gráfica de posições na memória. Remova as células indesejadas da lista clicando no botão X ao lado das coordenadas. Alternativamente, se as células-alvo não estiverem marcadas com fluorescência, clique em modo de mouse na interface gráfica principal.Em seguida, clique na célula de interesse; um ponto amarelo com um número aparecerá sobre a célula e as coordenadas da célula serão exibidas na interface gráfica de posições de memória. Para realizar a calibração secundária com o objetivo de detectar as coordenadas do deslocamento da pipeta, preencha 1/3 de uma pipeta de vidro com a solução interna. Em seguida, coloque a pipeta no suporte de pipeta acoplado ao estágio de cabeça.Em baixa ampliação, use um e dois no teclado numérico para alternar entre a unidade um e a unidade dois. Em seguida, traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco utilizando o teclado numérico. Depois, carregue a calibração primária clicando em carregar calibração.Altere a lente do microscópio para alta ampliação e clique 40 vezes na interface gráfica principal. Posicione a ponta da pipeta no centro. Em seguida, clique no botão de calibração secundária na interface gráfica principal, abaixo da unidade em uso.Para realizar o patch em uma célula alvo, clique no botão de controle de patch para abrir a interface gráfica de controle de patch. Clique no botão ir para ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na interface de posição na memória. Posteriormente, clique no botão CTM da unidade na interface principal para habilitar o movimento.Clique na célula de interesse para mover a ponta da pipeta até a célula. Devido à limitação mecânica do manipulador, ao percorrer distâncias superiores a 500 micrômetros, pode haver um pequeno erro de posicionamento. Para evitar um grande erro mecânico de posicionamento, uma calibração secundária deve ser realizada próximo à célula-alvo.Em seguida, use o botão da unidade selecionada para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades. Clique no botão de patch na interface gráfica de controle de patch. O patch automático será iniciado e a pressão e a resistência poderão ser monitoradas na interface gráfica de controle de patch.O algoritmo de selamento automático monitora a resistência e controla a pressão por meio de uma série de laços lógicos, para formar um gigasselo. Uma janela pop-up notifica a formação do gigasselo. O sistema utiliza a mudança de resistência para reconhecer o contato com a superfície celular.No caso de o contato com a superfície celular não ser detectado a tempo, use o botão próximo para avançar para a etapa de selamento, permanecendo no mesmo ensaio de selamento automático. Manipule o processo automático a qualquer momento clicando nos botões respectivos na interface gráfica de controle de selamento. Em seguida, selecione sim para romper com a combinação de choque elétrico e sucção.Alternativamente, selecione não para interromper apenas com sucção. Em seguida, salve o registro do experimento do patch. Esta figura mostra os locais selecionados carregados na interface gráfica da sequência de comandos.A coluna à esquerda mostra a lista de coordenadas e a coluna à direita mostra a lista de comandos na forma de sinais TTL para cada localização. Abaixo estão as imagens capturadas durante o experimento de aplicação do fármaco, correspondentes aos três locais selecionados. A solução de KCL foi misturada com um corante fluorescente vermelho com a finalidade de visualização.A unidade um era a micropipeta contendo KCl e a unidade dois era a micropipeta de patch. Nesta figura, as injeções de corrente em degrau mostram um neurônio com disparo regular. São apresentados aqui os traçados de gravação em regime de tensão constante decorrentes da aplicação local de solução de cloreto de potássio 500 milimolar em três locais.O tra&ccedil;o vermelho com corrente interna foi registrado no ensaio em que a aplica&ccedil;&atilde;o de cloreto de pot&aacute;ssio estava pr&oacute;xima &agrave; c&eacute;lula em patch. A seta vermelha indica o momento da aplica&ccedil;&atilde;o de cloreto de pot&aacute;ssio. Com este m&eacute;todo, &eacute; poss&iacute;vel realizar um ensaio de patch clamp em at&eacute; quatro minutos, sem necessidade de treinamento extensivo, em compara&ccedil;&atilde;o ao patching manual.Após este procedimento, outros métodos como optogenética, quimigenética e manipulações farmacológicas podem ser realizados para responder perguntas relacionadas ao seu projeto de pesquisa. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem estudos de alto rendimento de receptores sinápticos e canais iônicos em diferentes preparações in vitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de patch clamp automatizado guiados por imagem.

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra uma técnica para gravação de patch-clamp da superfície da membrana dendrítica. Isso ajuda a examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e dos canais iônicos dependentes de voltagem subjacentes em neurônios dopaminérgicos.

Gravações de Patch-Clamp do Dendrito de um Neurônio Dopaminérgico em uma Fatia de Cérebro

Este vídeo demonstra o posicionamento de uma pipeta pontiaguda perto de fatias de cérebro, formando um selo com uma célula neuronal. A sucção quebra a membrana celular, criando assim um grampo de remendo de célula inteira que permite medições de corrente para experimentos de eletrofisiologia.

Estabelecendo uma configuração de grampo de voltagem de célula inteira para registros eletrofisiológicos em fatias cerebrais

Este vídeo descreve um método para obter imagens e registrar simultaneamente a atividade elétrica de fatias cerebrais transgênicas que contêm proteínas fluorescentes específicas de neurônios. O procedimento envolve a manutenção da fatia do cérebro em uma câmara de perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial aerado, usando uma fonte de luz para excitar células marcadas com fluorescência e registrando os sinais elétricos com uma sonda multicanal e um grampo de remendo.

Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

Neste vídeo, fatias de cérebro são imobilizadas em uma câmara de gravação e as células de interesse são localizadas e focadas no uso de um microscópio controlado por computador. O sistema automatizado de processamento de imagem posiciona com precisão uma pipeta de remendo para selar a membrana celular e monitorar os sinais elétricos.

Técnica automatizada de patch clamp guiada por imagem para estudar neurônios em fatias cerebrais

Este vídeo demonstra o procedimento para mapear conexões sinápticas protegendo uma fatia de cérebro, posicionando pipetas para obter configurações de células inteiras e estimulando neurônios pré-sinápticos a registrar respostas pós-sinápticas, elucidando assim a conectividade neuronal.

Registro de grampo de patch emparelhado das conexões neuronais em fatias cerebrais agudas

Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.

Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Aprenda a técnica de patch-clamp automatizado guiado por imagem para detectar neurônios fluorescentes em fatias de cérebro. Este método aumenta significativamente a eficiência experimental em estudos eletrofisiológicos.

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

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