Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

O objetivo geral dessa captura otimizada de interactoma de mRNA é isolar e identificar um proteoma ligado a mRNA de células vegetais. Este método é aplicado a protoplastos mesófilos de folhas de arabidopsis thaliana, um tipo de célula usado como uma ferramenta versátil em vários ensaios celulares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos implantes de regulação gênica pós-transcricional, como descobrir e compreender o papel das proteínas de ligação ao RNA mensageiros das plantas.

A principal vantagem dessa técnica é que ela pode isolar e identificar um mensageiro da planta em um proteoma ligado diretamente do ambiente fisiológico. Portanto, este método pode fornecer informações sobre a proteína ligada ao RNA mensageiro dos protoplastos mesófilos da folha de aribidopse. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como protoplastos ou tecidos de outras plantas.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que ele havia sido aplicado com sucesso a linhagens celulares de leveduras e mamíferos. Isole protoplastos de mesófilos de folhas de arabidopsis para duas amostras diferentes, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha a amostra de controle que não será reticulada por UV ou amostra não CL no gelo.

Transfira a suspensão de protoplasto a ser reticulada ou a amostra CL para uma placa de Petri grande. Adicione 30 mililitros de solução MMG gelada ao prato para cobrir a superfície e espalhar as células por pipetagem suave. Cubra a placa de Petri com papel alumínio quando transportada para o aparelho de reticulação UV.

Coloque a placa de Petri aberta em um aparelho de reticulação UV imediatamente. Certifique-se de que a distância entre o prato e a lâmpada UV seja de oito centímetros e, em seguida, irradie a amostra por um minuto. Depois disso, alíquota rapidamente a suspensão de protoplastos da placa de Petri em dois novos tubos de fundo redondo de 50 mililitros.

Lave o fundo do prato com mais cinco mililitros da solução MMG gelada para coletar o restante dos protoplastos. Divida a suspensão entre os dois tubos. Em seguida, centrifugue os tubos de amostra não-CL e dois tubos de amostra CL a 100 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Depois de descartar o sobrenadante, coloque o tubo com o pellet não-CL de volta no gelo. Adicione 10 mililitros de solução MMG gelada a cada tubo de amostra CL e agite suavemente os tubos para ressuspender os pellets. Depois de combinar as duas amostras em um tubo de fundo redondo de 50 mililitros, centrifugue a 100 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Depois de descartar o sobrenadante, mantenha o pellet no gelo. Em seguida, adicione nove mililitros de tampão de ligação de lise gelada ao pellet celular de cada amostra. Lise os protoplastos pipetando para cima e para baixo aproximadamente vinte vezes, até que a solução fique homogênea de cor verde claro.

Para homogeneização, passe o lisado de protoplasto duas vezes por uma seringa de vidro de 50 mililitros com uma agulha estreita e, em seguida, incube o lisado no gelo por dez minutos. Congele as amostras em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos por até três semanas. Depois de descongelar o tubo com lisado de protoplasto congelado à temperatura ambiente, mantenha o tubo no gelo.

Alíquota de 1,8 mililitros de esferas magnéticas de oligo-d(T) em seis novos tubos de microcentrífuga de fundo redondo de dois mililitros colocados no gelo. Lave a suspensão do talão em cada tubo com 600 microlitros de tampão de ligação de lise pipetando brevemente para cima e para baixo e gire suavemente os grânulos em um rotador por dois minutos. Mantenha as contas no gelo.

Em seguida, coloque todos os seis tubos contendo as contas em um rack magnético por pelo menos três minutos para permitir tempo suficiente para a captura magnética completa. Quando as contas estiverem completamente capturadas, a suspensão ficará clara. Em seguida, descarte o sobrenadante de todos os seis tubos e imediatamente alíquota nove mililitros de lisado de protoplasto neles.

Misturar os grânulos com lisado pipetando até que a suspensão fique marrom e homogênea. Incube os tubos a quatro graus Celsius por uma hora com rotação suave. Após a incubação, coloque os tubos de volta no rack magnético por três minutos.

Quando todos os grânulos forem capturados na lateral dos tubos, colete o sobrenadante contendo o lisado de protoplasto em seis novos tubos de microcentrífuga de fundo redondo de dois mililitros. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão de lavagem gelada a cada tubo contendo grânulos e ressuspenda os grânulos pipetando. Após uma rotação suave por um minuto, coloque os tubos de volta no rack magnético por três minutos.

Descarte o sobrenadante e repita esta etapa de lavagem uma vez. Usando 1,5 mililitros de tampão de lavagem a frio dois, repita o mesmo procedimento de lavagem duas vezes. Se os mRNPs foram eficientemente isolados do lisado de protoplasto, deve haver um halo visível ao redor do grânulo na amostra de CL.

Por fim, repita o procedimento de lavagem uma vez com 1,5 mililitros de tampão com baixo teor de sal gelado. Após a lavagem, adicione 500 microlitros de tampão de eluição a cada tubo e ressuspenda suavemente os grânulos pipetando. Incube a 50 graus Celsius por três minutos para liberar os RNAs com cauda poli-A.

Ressuspenda suavemente as esferas pipetando uma vez e coloque os tubos de volta no rack magnético a quatro graus Celsius por cinco minutos. Transferir e combinar os eluentes dos seis tubos para um tubo de fundo cónico de 15 mililitros colocado sobre gelo. Isso produzirá aproximadamente três milímetros do eluente.

A qualidade e a quantidade de RNA podem ser determinadas imediatamente usando um espectrofotômetro. Preparar as esferas de oligo-d(T)para serem reutilizadas, lavando-as duas vezes com um mililitro de tampão de eluição gelada. Depois disso, lave-os com um mililitro de tampão de ligação de lise gelada para ajustar a concentração de sal de volta para 500 milimolares.

Use esses grânulos de oligo-d(T)lavados para repetir os procedimentos de ligação, lavagem e eluição por mais duas rodadas. Isso esgotará o RNA com cauda poli-A do lisado de protoplasto e produzirá um total de nove milímetros de eluente para cada amostra. As contas podem ser armazenadas e usadas para outro experimento por no máximo três vezes.

Para testar a qualidade do RNA, digerir as proteínas reticuladas por UV com solução de proteinase K de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, purifique o RNA usando o kit de purificação de RNA para remover quaisquer contaminantes residuais. Após a purificação, as amostras estão prontas para o teste de qualidade do RNA usando qRT-PCR.

Comece tratando oito mililitros de cada amostra com 100 unidades de coquetel de RNAse contendo RNAse A e RNAse T1. Após breve vórtice, incubar as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Para concentrar as proteínas de ligação ao mRNA, ou mRBPs, filtre as amostras usando unidades de filtro centrífugo. Cada amostra renderá 75 microlitros com dois microgramas de proteína.

Para armazenamento de longo prazo, congele as amostras a menos 80 graus Celsius. Para executar um gel de página SDS, misture 25 microlitros de cada amostra concentrada com 15 microlitros de corante de carga 2X e aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Carregue as amostras em um marcador de proteína em um gel de página SDS com um gel de empilhamento de cinco por cento e um gel de resolução de doze por cento.

Em seguida, lave o gel duas vezes com água ultrapura por cinco minutos por lavagem. Use um kit comercial de coloração de prata para manchar o gel. Se o número suficiente de protoplastos iniciais tiver sido usado, as bandas de proteína aparecerão em cinco minutos.

Para testar ainda mais os mRBPs, purifique os peptídeos de um segundo gel de página 1D, conforme explicado no protocolo de texto. Esses peptídeos purificados agora podem ser analisados por cromatografia líquida nano de fase reversa, espectrometria de massa e proteômica qualitativa e quantitativa. Após a captura de oligo-d(T)bead, qRT-PCR demonstrou níveis significativamente mais altos de mRNA de referência de poliubiquitina 10 versus rRNA 18S.

Como as esferas de oligo-d(T)se ligam apenas ao RNA de cauda poli-A, isso sugere que os mRNAs são enriquecidos no eluente. A captura de mRBPs por oligo-d(T)beads é avaliada por um gel de página SDS corado com prata. O gel mostra uma quantidade de proteína significativamente maior na amostra de CL reticulada por UV em comparação com a amostra não CL não reticulada.

A duração da irradiação UV pode influenciar a eficiência da reticulação. Este gel de página SDS manchado de prata confirma que um ou três minutos de irradiação UV é a condição ideal, com as intensidades de banda mais fortes. Um total de 325 proteínas foram identificadas por análise proteômica quantitativa.

225 dessas proteínas estavam abaixo do nível de significância devido aos peptídeos de baixa abundância presentes para cada proteína, com alta variabilidade de intensidades de peptídeos. No entanto, como todos eles foram detectados qualitativamente apenas em amostras de LC, todos foram considerados resultados positivos. Essas 325 proteínas foram classificadas em três categorias, proteínas ribossômicas, RBPs principais e RBPs candidatas.

Os RBPs candidatos não possuem domínios convencionais de ligação ao RNA e a maioria de seus papéis não foi validada, sugerindo possíveis novas funções na regulação do RNA. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se realizada adequadamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das vias de regulação molecular em plantas explorarem o proteoma ligado ao RNA mensageiro em todo o genoma em células e tecidos de dicotiledôneas e monocotiledôneas.