PCR de fusão de alta resolução para receptor de complemento 1 polimorfismo de comprimento Genotípica: uma ferramenta inovadora para a avaliação da susceptibilidade genética da doença de Alzheimer

O objetivo geral deste método é genotipar polimorfismos de comprimento do receptor 1 do complemento para uso na avaliação da suscetibilidade a doenças, como a doença de Alzheimer, para entender melhor o papel das isoformas CR1 na patogênese da doença. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a patogênese da doença de Alzheimer. As principais vantagens dessa técnica é que ela não requer amostras de sangue fresco e é mais fácil, barata, rápida e, portanto, aplicável a populações maiores.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando reconhecemos os desafios na realização de Western blots em relação ao tempo necessário e à necessidade de amostras de sangue frescas. Pipete 20 microlitros de proteinase K no fundo de um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de amostra ao tubo.

Adicione 200 microlitros de tampão de lise à amostra. Misture por vórtice de pulso por 15 segundos. Após a mistura, incubar a 56 graus Celsius durante 10 minutos em banho-maria.

Centrifugue brevemente o tubo de 1,5 mililitro para remover as gotas do interior da tampa. Em seguida, adicione 100 microlitros de etanol à amostra. Misturar novamente por vórtice de pulso durante 15 segundos antes de centrifugar brevemente o tubo como antes.

Em seguida, aplique cuidadosamente a mistura na coluna de membrana em um tubo de coleta de dois mililitros. Sem molhar a borda, feche a tampa e centrifugue a 6.000 vezes G por um minuto. Colocar a coluna de membrana num tubo de recolha limpo de dois mililitros e rejeitar o tubo que contém o filtrado.

Abra cuidadosamente a coluna de membrana e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem sem molhar a borda. Fechar o tampão e centrifugar a 6 000 vezes G durante um minuto. Em seguida, colocar a coluna de membrana num tubo de recolha limpo de dois mililitros e rejeitar o tubo que contém o filtrado.

Depois de abrir cuidadosamente a coluna da membrana, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem dois sem molhar a borda. Fechar o tampão e centrifugar a 20 000 vezes G durante três minutos. Em seguida, coloque a coluna de membrana em um novo tubo de coleta de dois mililitros e centrifugue novamente.

Após a centrifugação, colocar a coluna de membrana num tubo limpo de 1,5 ml e rejeitar o tubo de recolha que contém o filtrado. Abra cuidadosamente a coluna de membrana e adicione 200 microlitros de água destilada. Incubar a coluna à temperatura ambiente durante cinco minutos antes de centrifugar a 6 000 vezes G durante um minuto.

Para realizar o protocolo HRM-PCR, primeiro dilua as amostras de DNA em tubos de 1,5 mililitro com água até uma concentração de 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, dilua as soluções de primer descongeladas em tubos de 1,5 mililitro com água até a mesma concentração de seis micromolares. Descongele as soluções do kit HRM-PCR e misture cuidadosamente por vórtice para garantir a recuperação de todo o conteúdo.

Gire brevemente os três frascos contendo mistura enzimática com corante de ligação ao DNA, cloreto de magnésio e água em uma microcentrífuga antes de abri-los. Em um tubo de 1,5 mililitro à temperatura ambiente, use os componentes para preparar a mistura de PCR para a reação de 120 microlitros, conforme descrito no protocolo de texto. Misture cuidadosamente por vórtice.

É fundamental que você trabalhe com atenção e aplicação de acordo com as boas práticas em biologia molecular. Pipete 19 microlitros da mistura de PCR em cada poço de uma placa branca de vários poços. Adicione um microlitro do molde de DNA ajustado à concentração e, em seguida, sele a placa branca de vários poços com folha de vedação.

Centrifugue a placa branca de vários poços por um minuto a 1.500 vezes G em uma centrífuga de balde oscilante padrão contendo um rotor para placas de vários poços com adaptadores adequados. Carregue a placa branca de vários poços no instrumento HRM-PCR. Inicie o programa HRM-PCR com as condições de PCR encontradas no protocolo de texto.

Após a reação HRM-PCR, realizar a análise HRM para determinar o polimorfismo de comprimento CR1 conforme descrito no protocolo de texto. As curvas de fusão foram analisadas usando o software após a fusão de alta resolução dos amplicons derivados de PCR do DNA genômico de indivíduos com diferentes isoformas CR1. Os resultados são curvas que discriminam os sujeitos de acordo com seus fenótipos alotípicos de expressão de CR1.

Conforme mostrado pelos dois modos de apresentação, curvas de fusão normalizadas e deslocadas e gráfico de diferença normalizado e com deslocamento de temperatura, os perfis de curva são distribuídos de acordo com a estrela CR1 três, CR1 estrela um grupo, CR1 estrela um, CR1 estrela dois grupo, CR1 estrela um grupo, CR1 estrela dois grupo e CR1 estrela dois, CR1 estrela quatro grupo. Essas curvas correspondem aos alelos do polimorfismo de comprimento CR1. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como genotipar facilmente o polimorfismo de comprimento CR1 de acordo com curvas perfeitas obtidas por HRM-PCR.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à necessidade de amostras de referência de genótipos de comprimento CR1 já conhecidos. Quando dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a mesma concentração para cada amostra de DNA.

Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento cônico de DNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a descoberta de um novo SNP privado conhecido. Após esse desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisas na área de genética populacional explorarem a pressão seletiva de patógenos no polimorfismo de comprimento CR1. Embora esse método possa fornecer informações sobre a suscetibilidade na patogênese da doença de Alzheimer, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como lúpus eritematoso sistêmico e malária.