Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina

O objetivo geral deste procedimento experimental é permitir o preparo de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado, os quais podem então ser utilizados em estudos de imunoprecipitação de cromatina. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais nas áreas de músculo e ritmo circadiano, como estudos genômicos utilizando tecidos e células musculares em contextos circadianos ou outros dependentes do tempo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a reticulação imediata das amostras e o procedimento baseado em filtração pode ser conduzido com confiabilidade para isolar núcleos de alta qualidade com mínima contaminação por miofibrilas.

Embora este método possa fornecer informações sobre o músculo esquelético, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os músculos cardíaco e liso. Pese e pique o músculo esquelético da perna traseira isolado de camundongos machos C57 black six com aproximadamente 20 semanas de idade em solução salina tamponada com fosfato gelada, conforme descrito anteriormente. Coloque o tecido muscular esquelético picado em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS mantido no gelo.

Em seguida, centrifugue a amostra a 300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante de PBS por aspiração. Estime o volume do pellet em cada tubo de 50 mililitros utilizando tubos de referência com um, dois, três e quatro mililitros de água.

Adicione sete volumes de formaldeído a 1% frio em PBS e homogeneíze as amostras em gelo usando um homogeneizador de tecidos com sonda. Em seguida, realize a reticulação da amostra incubando-a à temperatura ambiente por 10 minutos. Interrompa a reação de reticulação pela adição de glicina 1 M até uma concentração final de 0,125 M, seguida de incubação por cinco minutos à temperatura ambiente.

Após centrifugar a amostra a 3.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante por aspiração. Lave o pellet ressuspendendo-o em 10 mililitros de tampão básico gelado contendo inibidores de protease recém-adicionados. Centrifugue a amostra novamente e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.

Em seguida, ressuspenda o pellet em seis mililitros de tampão de lise contendo inibidores de protease recém-adicionados. Transfira a amostra para um homogeneizador Dounce de 15 mililitros previamente resfriado e incube por 10 minutos no gelo. Homogeneize cada amostra no gelo com 15 golpes lentos usando um pistilo solto, seguidos por 15 golpes com um pistilo ajustado, para liberar os núcleos.

As seguintes etapas de filtração são fundamentais para o isolamento de núcleos de alta qualidade. Filtre o homogenato através de um estrainer celular e lave com quatro mililitros de tampão de lise. Em seguida, centrifugue as amostras a 1.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Resuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão básico gelado e homogeneíze 10 vezes com um pistilo ajustado para liberar os núcleos. Em seguida, filtre a suspensão através de um filtro para células e enxague o tubo com dois mililitros de tampão básico, filtrando novamente. Repita a filtração usando filtros para células com tamanho de poro progressivamente menor.

Finalmente, centrifugue a 1.000 × g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão básico antes de centrifugar novamente. Descarte o sobrenadante e armazene o pellet a menos 80 graus Celsius.

Descongele as amostras em 500 microlitros de tampão de lise SDS e ressuspenda com pipetagem suave. Transfira a suspensão de DNA nuclear para um frasco de vidro sobre gelo. Escolher a plataforma e as condições adequadas de sonicação é essencial para a preparação de cromatina a partir de núcleos isolados.

Realize a sonicação com rajadas focadas de energia acústica ultrassônica provenientes de um transdutor com formato de disco, utilizando as configurações descritas no protocolo textual. Transfira a cromatina sonicada para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue a 12.000 × g durante 15 minutos e transfira o sobrenadante para um novo tubo.

Em seguida, transfira 50 microlitros da amostra sonicada para um novo tubo de 1,5 mililitro para descrosslinking reverso durante a noite a 65 graus Celsius. A obtenção das amostras de DNA é descrita na próxima seção. Após avaliação da sonicação e da quantificação conforme descrito no protocolo textual, alíquotas do cromatina descongelado em aproximadamente 100 a 120 microgramas por tubo.

Em seguida, dilua a cromatina de um para 10 com tampão de imunoprecipitação. A seguir, adicione 40 microlitros de uma suspensão a 50% de agarose proteína HE ou microesferas de IgY pré-bloqueadas com BSA e incube em agitador rotativo por três horas a quatro graus Celsius. Após centrifugar a amostra a 1.000 × g por 10 minutos, transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos.

Em seguida, adicione anticorpos na proporção de um micrograma de anticorpo por 25 a 100 microgramas de DNA de cromatina. Incube com rotação suave durante a noite a quatro graus Celsius e aproximadamente 15 rpm. Em seguida, adicione 10 microlitros de agarose HE com proteína pré-bloqueada com BSA ou microesferas de IgY e misture.

Rotacione a suspensão de microesferas na câmara fria durante duas horas. Em seguida, lave as microesferas com tampão RIPA, seguido de tampão de sal alto, tampão de cloreto de lítio e tampão Tris EDTA, conforme detalhado no protocolo descrito no texto. Após a lavagem, elua o DNA das microesferas primeiramente centrifugando a 1.000 × g durante um minuto e removendo cuidadosamente o sobrenadante.

Resuspenda as microesferas com 50 microlitros de tampão de eluição. Em seguida, incube por 10 minutos a 65 graus Celsius. Após a incubação, centrifugue a 12.000 ×g por cinco minutos.

Remova o sobrenatante e adicione outros 50 microlitros de tampão de eluição antes de centrifugar novamente a 12.000 × g durante cinco minutos. O volume final de eluição será de 100 microlitros. Para reverter a ligação cruzada e realizar a eluição do DNA, incube primeiro a cromatina eluída durante a noite a 65 graus Celsius.

Em seguida, adicione um microlitro de RNase A e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Posteriormente, incube com oito microlitros de protease K a 10 miligramas por mililitro por 30 minutos a 55 graus Celsius. Recolha o DNA utilizando um kit de purificação de PCR com um volume de eluição de 50 microlitros, conforme o protocolo do fabricante.

Por fim, analise os perfis por QPCR em tempo real conforme descrito anteriormente. A filtração sequencial removeu efetivamente os detritos teciduais. Imagens representativas de amostras após a filtração inicial e após a filtração em série são apresentadas aqui para comparação.

A fragmentação progressiva da cromatina ao longo de 10 ciclos de sonicação é revelada por meio da eletroforese em gel de agarose. Dez ciclos de sonicação com a cromatina digerida resultaram em DNA de aproximadamente 500 pares de bases. Aqui, são apresentados resultados representativos de PCR quantitativa para machos B, um ensaio de imunoprecipitação da cromatina com amostras de músculo esquelético de camundongo coletadas em ZT6 e ZT18.

Análise dos elementos localizados no gene Dbp revelou que, de acordo com resultados anteriores, os picos de ligação ocorrem por volta de ZT6. Uma vez dominado, o preparo de núcleos pode ser realizado em cinco a seis horas, se for feito corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar métodos baseados em filtração para purificar núcleos de alta qualidade e DNA de cromatina a partir de tecido muscular com ligação cruzada.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as amostras em gelo ou em uma câmara fria e de guardar alíquotas das amostras para análise microscópica antes e após as etapas de filtração. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de músculo e genômica explorassem a dinâmica circadiana ou dependente do tempo das interações cromatina-proteína em diversos tecidos musculares. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de chIP, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como identificar padrões de ligação de fatores de transcrição em tecidos musculares.