Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina
6 de julho de 2017
Apresentamos um protocolo baseado em filtração para isolar núcleos de alta qualidade do músculo esquelético do mouse reticulado em que removemos a necessidade de ultracentrifugação, tornando-o facilmente aplicável. Mostramos que a cromatina preparada a partir dos núcleos é adequada para a imunoprecipitação com cromatina e prováveis estudos de sequenciação de imunoprecipitação com cromatina.
O objetivo geral deste procedimento experimental é permitir a preparação de núcleos de alta qualidade a partir do músculo esquelético reticulado que podem ser usados para estudos de imunoprecipitação da cromatina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo muscular e circadiano, como estudos genômicos usando tecidos e células musculares em circadiano ou outro contexto sensível ao tempo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a reticulação imediata de amostras e o procedimento baseado em filtração pode ser conduzido de forma confiável para isolar núcleos de alta qualidade com contaminação miofibrilar mínima.
Embora esse método possa fornecer informações sobre o músculo esquelético, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os músculos cardíacos e lisos. Pesar e picar o músculo esquelético dos membros posteriores isolado de camundongos C57 pretos de aproximadamente 20 semanas de idade em solução salina tamponada com fosfato gelado, conforme descrito anteriormente. Coloque o tecido muscular esquelético picado em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS no gelo.
Em seguida, centrifugue a amostra a 300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante PBS por aspiração. Estime o volume de pellets em cada tubo de 50 mililitros usando tubos de referência com um, dois, três e quatro mililitros de água.
Adicione sete volumes de formaldeído a 1% gelado e PBS e homogeneize as amostras no gelo usando um homogeneizador de tecido de sonda. Em seguida, reticule a amostra incubando-a em temperatura ambiente por 10 minutos. Extinguir a reação de reticulação através da adição de uma glicina molar a uma concentração final de 0,125 molar, seguida de incubação por cinco minutos à temperatura ambiente.
Depois de centrifugar a amostra a 3 000 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius, remover o sobrenadante por aspiração. Enxágue o pellet ressuspendendo-o em 10 mililitros de tampão de base gelada contendo inibidores de protease recém-adicionados. Centrifugar novamente a amostra e remover cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.
Em seguida, ressuspenda o pellet em seis mililitros de tampão de lise contendo inibidores de protease recém-adicionados. Transferir a amostra para um homogeneizador Dounce de 15 mililitros pré-refrigerado e incubar durante 10 minutos no gelo. Homogeneizar cada amostra no gelo com 15 movimentos lentos usando um pilão solto seguido de 15 golpes com um pilão apertado para liberar os núcleos.
As etapas de filtração a seguir são a chave para o isolamento de núcleos de alta qualidade. Filtrar o homogeneizado através de um filtro de células e enxaguar com quatro mililitros de tampão de lise. Em seguida, centrifugue as amostras a 1.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de base gelada e Dounce 10 vezes com um pilão apertado para liberar os núcleos. Em seguida, filtre a suspensão através de um filtro de células e enxágue o tubo com dois mililitros de tampão de base e filtre novamente. Repita a filtração com filtros de células de tamanho de poro gradualmente reduzido.
Finalmente, centrifugue a 1.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de base antes de centrifugar novamente. Rejeitar o sobrenadante e conservar o sedimento a 80 graus Celsius negativos.
Descongele as amostras em 500 microlitros de tampão de lise SDS e ressuspenda com pipetagem suave. Transfira a suspensão de DNA dos núcleos para um frasco de vidro com gelo. Escolher a plataforma e a condição de sonicação corretas é fundamental para a preparação da cromatina a partir de núcleos isolados.
Execute a sonicação com rajadas focadas de energia acústica ultrassônica de um transdutor em forma de disco usando as configurações descritas no protocolo de texto. Transfira a cromatina sonicada para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugar a 12 000 vezes g durante 15 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
Em seguida, transfira 50 microlitros da amostra sonicada para um novo tubo de 1,5 mililitro para reticulação reversa durante a noite a 65 graus Celsius. A coleta das amostras de DNA é descrita na seção a seguir. Após a avaliação da sonicação e quantificação conforme descrito no protocolo de texto, alíquota da cromatina descongelada para aproximadamente 100 a 120 microgramas por tubo.
Em seguida, diluir a cromatina de um a 10 com tampão de imunoprecipitação. Em seguida, adicione 40 microlitros de uma pasta de 50% de proteína BSA pré-bloqueada HE agarose ou grânulos IgY e incube em um rotador por três horas a quatro graus Celsius. Depois de centrifugar a amostra a 1 000 vezes g durante 10 minutos, transferir cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos.
Em seguida, adicione anticorpos a um micrograma de anticorpo por 25 a 100 microgramas de DNA de cromatina. Gire suavemente durante a noite a quatro graus Celsius e aproximadamente 15 rpm. Em seguida, adicione 10 microlitros de proteína BSA pré-bloqueada HE agarose ou grânulos IgY e misture.
Gire a suspensão do talão na câmara fria por duas horas. Em seguida, lave as esferas com tampão RIPA seguido de tampão com alto teor de sal, tampão de cloreto de lítio e Tris EDTA conforme detalhado no protocolo de texto. Após a lavagem, eluir o ADN das esferas centrifugando primeiro a 1 000 vezes g durante um minuto e removendo cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspenda os grânulos com 50 microlitros de tampão de eluição. Em seguida, incube por 10 minutos a 65 graus Celsius. Após a incubação, centrifugar a 12 000 vezes g durante cinco minutos.
Remover o sobrenadante e adicionar mais 50 microlitros de tampão de eluição antes de centrifugar novamente a 12 000 vezes g durante cinco minutos. O volume final de eluição será de 100 microlitros. Para reverter a reticulação e realizar a eluição do DNA, primeiro incube a cromatina eluída durante a noite a 65 graus Celsius.
Em seguida, adicione um microlitro de RNase A antes de incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, incubar com oito microlitros de 10 miligramas por mililitro de protease K por 30 minutos a 55 graus Celsius. Colha o DNA usando um kit de limpeza de PCR com um volume de eluição de 50 microlitros de acordo com o protocolo do fabricante.
Por fim, analise os perfis por QPCR em tempo real, conforme descrito anteriormente. A filtração sequencial removeu efetivamente os detritos teciduais. Imagens representativas de amostras após a filtração inicial e após a filtração em série são mostradas aqui para comparação.
A trituração progressiva da cromatina através de 10 ciclos de sonicação é revelada através da execução de um gel de agarose. 10 ciclos de sonicação com a cromatina digerida resultaram em DNA de aproximadamente 500 pares de bases. Aqui, são mostrados resultados representativos de QPCR para machos B um chIP com amostras de músculo esquelético de camundongo coletadas em ZT6 e ZT18.
A análise dos elementos de localização de Dbp no gene Dbp revelou que, consistente com os resultados anteriores, a ligação atinge o pico em torno de ZT6. Uma vez dominado, a preparação dos núcleos pode ser feita em cinco a seis horas, se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar os métodos baseados em filtração para purificar núcleos de alta qualidade e DNA de cromatina do tecido muscular reticulado.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as amostras no gelo ou em uma câmara fria e guardar as alíquotas das amostras para verificação microscópica antes e depois das etapas de filtração. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo do músculo e da genômica explorarem a dinâmica circadiana ou sensível ao tempo da interação cromatina-proteína em vários tecidos musculares. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento chIP, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como procurar padrões de ligação do fator de transcrição nos tecidos musculares.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo baseado em filtração para isolar núcleos de alta qualidade de músculo esquelético de camundongos cross-linked. O método elimina a necessidade de ultracentrifugação, tornando-o mais acessível para pesquisadores. A cromatina preparada é adequada para estudos de imunoprecipitação de cromatina.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Fisiologia Muscular
Fundo
- Importância de núcleos de alta qualidade em estudos genômicos.
- Aplicação em pesquisas circadianas e sensíveis ao tempo.
- Potencial para insights em sistemas musculares esquelético, cardíaco e liso.
- Minimização da contaminação por miofibrilas nas amostras.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método confiável para isolar núcleos de músculo esquelético.
- Facilitar estudos de imunoprecipitação de cromatina.
- Aprimoramento da compreensão do tecido muscular em vários contextos biológicos.
Métodos Utilizados
- Músculo esquelético da pata traseira picado de camundongos machos C57 black six.
- Utilização de solução salina tamponada com fosfato gelada para preservação do tecido.
- Implementação de um procedimento baseado em filtração para isolamento do núcleo.
- Objetivo de mínima contaminação durante o processo.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de núcleos de alta qualidade do músculo esquelético.
- Croatina preparada é adequada para estudos de imunoprecipitação.
- O método mostra potencial para aplicações mais amplas na pesquisa muscular.
- Demonstrou confiabilidade e facilidade de uso em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- O protocolo baseado em filtração é eficaz para o isolamento de núcleos.
- Fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores em biologia muscular.
- Estudos futuros podem aproveitar esse método para vários tipos de músculos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Isolation of high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle is a critical bottleneck for chromatin immunoprecipitation (ChIP) and genomic studies in muscle biology. This filtration-based protocol enables reproducible preparation of nuclei with minimal myofibril contamination, supporting robust interrogation of protein-DNA interactions in time-sensitive and circadian contexts. The method enhances predictive confidence and workflow continuity for discovery-stage and translational muscle research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of chromatin-protein interactions in muscle tissue under physiological conditions.
- Supports mechanistic de-risking by preserving native DNA-protein complexes during nuclei isolation.
- Facilitates functional target validation for transcription factors and epigenetic regulators in muscle systems.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-quality nuclei preparations for downstream ChIP and sequencing assays.
- Improves assay reproducibility by minimizing myofibril contamination and sample variability.
- Enables quantitative evaluation of protein-DNA binding dynamics across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by allowing analysis of circadian and time-sensitive chromatin states in muscle tissue.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation for muscle-targeted therapeutics.
- Facilitates integration with next-generation sequencing for biomarker and pathway discovery.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable chromatin analysis from early mechanistic studies to translational research in muscle biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transcription factor binding and chromatin state in muscle tissue.
- Screening: Delivers reproducible nuclei preparations for ChIP and sequencing assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR and sequencing for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Enables time-sensitive studies relevant to circadian biology and muscle disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable nuclei isolation workflow for multiple muscle tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in chromatin-protein interaction studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust, high-quality input for downstream genomic assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle-targeted discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cross-linking, and filtration-based nuclei isolation.
- Needs access to sonication platforms, filtration devices, and qPCR or sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility across studies.
- Adaptable to other muscle types, including cardiac and smooth muscle, with protocol optimization.
- Sample integrity and temperature control are critical for consistent nuclei quality.
