Name: Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a realizar hepatectomia parcial e transplante intrassplênico de hepatócitos em camundongos NOD.SCID. Este protocolo demonstra técnicas cirúrgicas para pesquisa em terapias celulares para insuficiência hepática aguda.

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Este trabalho foi financiado pela subvenção núcleo recebida do departamento de biotecnologia, governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. Endereço atual do Dr. Bhattacharjee é a divisão de Gastroenterologia, Hepatologia e nutrição, Hospital Los Angeles das crianças.

Os procedimentos apresentados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética institucional Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de série de referência da aprovação é IAEC #319/13.
Nota: Existem excelentes recursos em procedimentos de cirurgia geral20 e protocolos específicos para a cirurgia do roedor21. Para aqueles que fazem a cirurgia animal pela primeira vez, é aconselhável extensivamente em prática procedimentos cirúrgicos em bonecos antes de operar em animais.
1. preparação
<ol><li>Antes do experimento, manter estéril tampão fosfato salino (PBS) ou salino pronto.</li>
	<li>Monte um kit de cirurgia contendo tesouras, pinças serrilhadas, fórceps do tecido, algodão, cotonetes, fios de nylon e porta agulhas micro diferentes. O kit de cirurgia de autoclave. Cuidado especial deve ser tomado se um aceno imunológico comprometido. Rato SCID é incluído no protocolo.</li>
	<li>Executar todo o procedimento experimental, desde a preparação para o fim da cirurgia, da bio-segurança classe I do armário.</li>
	<li>Pese um aceno. Rato SCID de 6-8 semanas antes da cirurgia. Ratos com peso entre 14-18 g são utilizados neste estudo.</li>
	<li>Barba superior central e hipocondríaco região abdominal do mouse com o aparador de cabelo. Aplica o cabelo removendo o creme uniformemente em toda a região com uma espátula para remover completamente os pelos aparados. Remova os pelos suavemente com a ajuda de um pedaço de algodão estéril após 2-5 min.</li>
	<li>Posicione o mouse na câmara de isoflurano e desbloquear a válvula do cilindro de oxigênio. Manter o fluxo de oxigênio à taxa de 4 L/min e a vaporização de isoflurano em 4% para induzir anestesia.<ol>
<li>Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado corretamente beliscando suave do dedo do pé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque uma placa de cirurgia dentro uma biossegurança do armário. Coloque o animal no quadro de cirurgia, tal que a porção ventral do mouse é voltada para cima e a porção anterior do rato é colocada dentro do cone de nariz ligado à alimentação de isoflurano e oxigênio.</li>
	<li>Reduzir a vaporização de isoflurano para 2% e mantê-lo durante todo o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Desinfectar a pele do rato e esterilize-limpando com algodão estéril embebida de etanol a 70%.</li>
</ol>2. ato cirúrgico
<ol><li>
Hepatectomy parcial
	<ol>
<li>Fazer uma incisão transversa de cerca de 1 cm na pele logo abaixo do esterno, perpendicular ao processo xifoide e paralelo da caixa torácica, com a ajuda de uma tesoura reta de funcionamento.</li>
		<li>Separe suavemente a pele anexada com a camada muscular abdominal nas imediações da zona da incisão com pinça ou dicas de algodão umedecido estéril para distinguir entre a pele e a camada muscular abdominal. Molhe a região intradérmica com PBS usando dicas de algodão estéril para evitar a dessecação.</li>
		<li>Expor a área do lobo esquerdo suavemente, fazendo uma incisão transversal através da camada peritoneal logo abaixo do xifoide. Use duas dicas de algodão umedecido para expor e levantar o lobo esquerdo do fígado.</li>
		<li>Coloque uma das pontas do algodão do lado abdominal do corte e coloque a outra ponta de algodão do lado do diafragma. Delicadamente pressione a ponta colocada para o diafragma e dar um empurrão deslizando pela outra ponta para levantar o lobo esquerdo do fígado.</li>
		<li>Passar um fio de nylon com um loop através do lóbulo esquerdo levantado e deslize o loop em direção à base do lobo esquerdo perto do hilo, com a ajuda das dicas de microfórceps ou algodão. Empurre para baixo o loop de fio de nylon na base do lobo esquerdo.</li>
		<li>Amarre duas extremidades do fio de nylon por cima do lobo esquerdo usando um porta-agulha microcirurgia e o micro fórceps. Faça dois nós adicionais do outro lado.</li>
		<li>Disse para fora o lóbulo amarrado com a ajuda de uma tesoura. Não tente cortar muito perto o thread. No caso do procedimento dura mais de 5 min, mantenha a cavidade peritoneal e órgãos úmido com PBS estéril para evitar a desidratação devido à perda de líquidos.</li>
		<li>Costure o peritônio por sutura contínua usando uma sutura de Catgut 4-0. Subsequentemente, feche a pele por sutura descontínuos tão rapidamente quanto possível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transplante de células Nota: Os hepatócitos expressando GFP foram isolados de ratos transgénicos GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), de acordo com o procedimento descrito por Lee et al. 22 e Shen et al. 23 hepatócitos células (NeoHep) de origem humana diferenciada de monócitos24 também foram utilizadas para transplante. No entanto, as células derivadas de outras fontes podem também ser utilizadas no protocolo.<ol>
<li>Suspenda a 0,2 milhões de células viáveis em cerca de 50 µ l de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) e Aspire-lo em uma seringa de insulina 1 mL com agulha 30 G. Não deixar a seringa, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Coloque o mouse em uma forma que a parte lateral esquerda enfrenta até em direção a pessoa que realizar a cirurgia. Identificar a área esplênica e transversalmente dissecar a pele perto da região hipocondríaca, seguida por uma incisão pequena através da camada peritoneal apenas para expor o baço.</li>
		<li>Delicadamente Levante o baço e mantenha que fora da cavidade com a ajuda de dois PBS umedecido com pontas de algodão.</li>
		<li>Segure o baço cuidadosamente com duas pontas de algodão com uma mão e coloque a agulha da seringa exatamente vertical para o baço. Delicadamente, perfuram o baço e empurra a agulha muito lentamente por dentro; a agulha não deve ter mais que 2 mm.</li>
		<li>Empurre o êmbolo da seringa lentamente para injetar as células no baço. Após transplante, manter a agulha da seringa estável e retire lentamente o baço para evitar sangramento ou perda de células.</li>
		<li>Depois de colocar o baço volta para a cavidade peritoneal com as pontas de algodão, feche a camada peritoneal por sutura contínua com uma sutura de Catgut 4-0. Costure a pele descontinuamente com a sutura do mesma. Evite usar clipes de ferida para o fechamento da pele; em vez disso, feche-a uma sutura de 4-0. Os clipes de ferida restringem o movimento natural do mouse, e muitas vezes clipes afrouxar-se e sair rapidamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. no pós-operatório cuidados
<ol><li>Depois de fechar a pele, limpe os arredores de ambos os sites de sutura com solução de iodo (betadine) usando uma ponta de algodão estéril.</li>
	<li>Injetar uma dose de antibiótica cefotaxima como 600 mg/kg de peso (tipicamente 12 mg cefotaxima em 100 µ l de solução salina/rato) de corpo intraperitonealmente com uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Dar doses diárias de analgésico Meloxicam como 1 mg/kg peso corporal (tipicamente 12 µ g Meloxicam em 100 µ l de solução salina/rato) ao animal intraperitonealmente, por até três dias após a cirurgia.</li>
	<li>Após a conclusão da cirurgia, interromper o fluxo de gás de isoflurano e posicione o mouse de volta na gaiola ventilada individualmente.</li>
</ol>4. eutanásia e caracterizações
<ol><li>Após os pontos experimentais (1 dia e 10 dias pós cirurgia), eutanásia os ratos de acordo com as orientações institucionais de ética animal.</li>
	<li>Colete sangue por terminal sangria dos animais, puncionando o plexo terminal ocular.</li>
	<li>Isole o soro do sangue.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Hepatectomy parcial é uma técnica estabelecida para investigar regeneração hepática e hepatectomy excessiva é relatado para imitar o modelo de AHF. Entre modelos animais de AHF, roedores, sobretudo ratos, são o modelo mais pesquisado. Para obter um modelo de lesão hepática em ratos, até um 70% hepatectomy tem sido relatado com uma taxa de sobrevivência bom25,26. No entanto em nude e outro rato imunodeficientes, um hepatectomy 70% foi relatado como fatal e animais...

Atualmente, transplante de hepatócitos é proposto como uma alternativa ao transplante de órgão inteiro para tratar pacientes com distúrbios hepáticos graves. Acredita-se que ele pode ponte pacientes de transplante de órgão inteiro1. Além dos hepatócitos alogênico2, hepatócitos xenogénica3 e hepatócitos derivados de células-tronco4 também estão sendo investigados em modelos animais. Neste contexto, a orientação e enxertia potencial das células transplantadas no receptor é um critério importante para a terapia de célula com base na insuficiência hepática aguda (AHF).
Para investigar o transplante de hepatócitos ou células hepatócito5, AHF é criada em um modelo animal por cirúrgica6 ou procedimentos farmacológicos7 , seguidos de transplante de células. Tornar-se um modelo animal de AHF por reagentes farmacológicos, hepatotoxinas muitos como d-galactosamina8, paracetamol9, tetracloreto de carbono10, tioacetamida11, Concanavalina A12, lipopolissacarídeo13 , etc., têm sido utilizados. Desta lista, cada reagente gera um conjunto único de características para AHF, mas infelizmente não reagente único imita as AHF humana. Além disso, a AHF induzida por hepatotoxinas leva um longo tempo, o que coloca os animais sob estresse crônico, e obter resultados reprodutíveis são difíceis de obter.
Por outro lado, o procedimento cirúrgico de hepatectomy parcial (PHx) é dependente de habilidade, e obter resultados reprodutíveis são fáceis de obter depois de desenvolver as habilidades necessárias. Para induzir AHF por intervenção cirúrgica sozinha, ressecção de mais de 70% do fígado é necessária; no entanto, menos do que um hepatectomy 70% ainda pode ser utilizado para estudar a enxertia e proliferação de transplantadas células no fígado para analisar sua capacidade terapêutica durante dano hepático14. O transplante de hepatócitos foram realizados post hepatectomy através do peritônio15, cauda veia16, veia hepática17ou o baço18. Atualmente, infusão de veia hepática e transplante intrasplenic dos hepatócitos são os procedimentos preferenciais, porque são mais fáceis de reproduzir.
Neste trabalho, descrevemos um procedimento para uma hepatectomy parcial de 30% na NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos em que o lobo esquerdo do fígado é extirpado. Ele é seguido por transplante de hepatócitos de rato (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expressando GFP 0,2 milhões, bem como origem humana NeoHep19 no baço. Este procedimento leva a enxertia das células transplantadas no fígado. Este procedimento é menos invasivo e uma técnica minimamente dolorosa.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Anestesia a Gás</td><td>Ugo Basile; Itália</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de pesagem</td><td>Goldtech ; Gabinete</td> de segurança biológica de <td>compras locais</td>da Índia <td></td></tr><tr><td>(Classe I)</td> <td>Kartos internacional; &nbsp; Aparador</td> de cabelo <td>de compras locais</td>da Índia<td></td></tr><tr><td></td><td>, Panasonic; &nbsp; Japão&nbsp;</td><td>ER-GY10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de operação reta com lâminas afiadas / afiadas</td><td>Major Surgicals; </td> Fórceps <td>de Compras Locais</td>da Índia <td></td></tr><tr><td>com Serrilhas</td><td>Principais Cirúrgicas; Compras locais da Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas micro reto e curvo</td><td>Mércia; &nbsp; Inglaterra&nbsp;</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina de 1 ml com 30G *5/16 agulhas&nbsp;</td><td>Dispo Van; Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml com 26 G * 1/2 agulha</td><td>BD; EUA&nbsp;</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Fios de Nylon&nbsp; &nbsp;</td><td>poderoso; Índia</td><td></td> <td>(1-0) Aquisição Local</td></tr><tr><td>MERSUTURES 4-0 Sutura Agulhada Cirúrgica Esterilizada</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, Índia</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>TRUGUT 76 cm 4-0 sutura cirúrgica absorvível</td><td>Suturas Índia Pvt. Ltd; Índia</td><td>SN 5048</td><td>Sutura Agulhada Cirúrgica Esterilizada Catgut Cotonetes Puros</td></tr><tr><td></td><td>Cotonetes Pvt Ltd; &nbsp; Fita</td> Cirúrgica de <td>Compras Locais</td>da Índia <td></td></tr><tr><td></td><td>3M Índia ; Índia</td><td>1530-1</td><td>Micropore Surgical Tape Microtome</td></tr><tr><td></td><td>Histo-Line Laboratories, Itália</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation; Microscópio</td> confocal de varredura a laser dos EUA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss; Alemanha&nbsp;</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Campo Brilhante</td><td>Olympus, Japão</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Analisador automatizado</td><td>Tulip, Alto Santracruz, Índia</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Analisador bioquímico para teste funcional hepático</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD ; EUA&nbsp;</td><td>BD FACSverse</td><td>Avaliação da presença de células pós-transplante</td></tr><tr><td>Creme de depilação Veet&nbsp;</td><td>Reckitt Benckiser, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FORANE</td><td>Abbott; Isoflurano dos EUA</td><td></td><td>USP 99,9%&nbsp;</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>AlKem; Injeção de</td><td>cefotaxima sódica</td>na Índia <td></td></tr><tr><td>Solução de iodo-povidona&nbsp;</td><td>Vitória-Medicare; &nbsp; Índia</td><td></td><td>Betadine</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Himedia; Índia</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life technologies, Thermo Fisher científico; US</td><td>12200-036</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tecido-Tek</td><td>Sakura; US</td><td>25608-930</td><td>O.C.T composto</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Himedia; Índia</td><td>MB 097</td><td></td></tr><tr><td>anti-albumina de cabra Polyclonal</td><td>Thermo Scientific, Pierce, US</td><td>PA126081</td><td></td></tr><tr><td>anti-conexina 32/GJB1 Polyclonal</td><td>abcam, UK</td><td>ab64609-500</td><td></td></tr><tr><td>antiGFP coelho policlonal&nbsp;</td><td>biotecnologia Santa Cruz; US</td><td>SC 8334</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 burro anti-cabra</td><td>&nbsp; Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; &nbsp; US</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-ovelha</td><td>&nbsp; Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; &nbsp; US</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 frango anti coelho</td><td>&nbsp; Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; &nbsp; US</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti coelho IgG HRP</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; EUA&nbsp;</td><td>65-6120</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Ki67</td><td>abcam, Reino Unido</td><td>ab15580</td><td></td></tr><tr><td>Solução de desmascaramento de antígeno, base de ácido cítrico</td><td>Laboratórios de vetores, US</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond mountant antifade</td><td>Life technologies, Thermo Fisher científico; US</td><td>P36966</td><td></td></tr><tr><td>KIT SGOT (ASAT)</td><td>Sistema Clínico de Coral, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Sistema Clínico de Coral, Kit</td> de Fosfatase Alcalina da Índia <td></td><td></td></tr><tr><td>(DEA)</td><td>Sistema Clínico de Coral, Solução de</td> Hematoxilina da Índia<td></td><td></td></tr><tr>, Sigma<td>de Mayer</td><td>; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solução, álcool</td><td>Sigma ; Montagem DPX HT110132</td><td></td><td></td>dos EUA</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>sigma; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Melonex (analgésico)</td> <td>Intas Pharmaceuticals Ltd; Índia</td><td></td><td>Injeção de meloxicam&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de substrato líquido aprimorado DAB tetracloridrato</td><td>Sigma ; E.U.</td><td>D3939</td><td></td></tr></tbody></table>

intrasplenic transplante de hepatócitos após hepatectomy parcial na nod. ratos scid

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Hepatectomy parcial é um método versátil e pode ser reproduzido para estudar a regeneração hepática e o efeito da terapêutica de célula com base em várias condições patológicas. Hepatectomy parcial também facilita a enxertia aumentada e proliferação das células transplantadas por neovascularização acelerada e migração de células para o fígado. Aqui, descrevemos um protocolo simples para executar hepatectomy 30% e o transplante de células no baço de um não-obesos diabéticos/grave combinado NOD imunodeficientes. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) rato.
Neste procedimento, são feitas duas pequenas incisões. A primeira incisão é expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado, e outra pequena incisão para expor o baço para o transplante intrasplenic de células. Este procedimento não requer nenhuma habilidade cirúrgica especializada, e pode ser completado em 5-7 minutos com menos estresse e dor, recuperação mais rápida e melhor sobrevivência. Nós demonstramos que o transplante de hepatócitos isolados de uma proteína verde fluorescente (GFP), expressando o rato (transgénico C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), bem como hepatócito como células de origem humana (NeoHep) em parcialmente hepatectomized NOD. Ratos SCID.

Proliferação hepatocyte após hepatectomy parcial de 30%: A proliferação dos hepatócitos nos restantes fígada após 30% hepatectomy foi examinada por imuno-histoquímica (IHC) mancha para um marcador de proliferação celular, Ki-67. Post um dia hepatectomy, os ratos foram sacrificados, os lóbulos de fígado restantes foram extirpados e cortes de parafina foram obtidos. As seções foram coradas com anticorpo Ki-67, seguido de rotulagem com anticorpo secundário conjugado de horseradish peroxidase (HRP). Di-Amino...

Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.

Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Para o tratamento de pacientes com falência hepática aguda, o transplante de hepatócitos é uma alternativa ao transplante de órgão inteiro. A hepatectomia parcial é utilizada como uma técnica para induzir a FHA. Além disso, também é empregada para investigar o enxerto e a proliferação celular durante a terapia baseada em células.O camundongo é um dos modelos mais estudados para realizar hepatectomia com esses objetivos. Neste vídeo, mostraremos um procedimento de hepatectomia parcial seguido pelo transplante de hepatócitos no baço de um camundongo NOD. SCID.Antes de começar, certifique-se de que possui a aprovação necessária do comitê de ética em experimentação animal apropriado para realizar o experimento. Neste procedimento, faremos dois pequenos cortes. O primeiro corte é para hepatectomia parcial e terá cerca de um centímetro de comprimento, feito logo abaixo do processo xifoide para expor o fígado.Para o transplante de células, é feita outra incisão menor na porção lateral esquerda para expor o baço do animal. As vantagens são que esse procedimento causa menos trauma e dor ao animal, recuperação mais rápida e sobrevivência de quase cem por cento. Além disso, este procedimento não requer habilidades cirúrgicas especializadas e pode ser concluído rapidamente em cinco a sete minutos.Neste vídeo, demonstraremos o transplante de células semelhantes a hepatócitos denominadas NeoHep e hepatócitos isolados de um camundongo transgênico GFP em um camundongo NOD. SCID submetido a hepatectomia parcial. O procedimento não restringe o tipo de células para transplante.Todas as ferramentas cirúrgicas e o PBS foram devidamente autoclavados e mantidos prontos antes da cirurgia. Pese o camundongo. Camundongos NOD.SCID de seis a oito semanas de idade, pesando entre quatorze e dezoito gramas, são incluídos neste procedimento.Apare a região central, superior e esquerda do abdômen do camundongo. Para remover os pelos aparados, aplique creme depilatório sobre a área aparada. Espere de quatro a cinco minutos e remova suavemente os pelos.Abra a válvula do cilindro de oxigênio. Coloque o camundongo na câmara de Isoflurano. Ajuste o fluxo de oxigênio em quatro litros por minuto.Ajuste a vaporização de isoflurano a quatro por cento para induzir a anestesia. Certifique-se de que o camundongo foi adequadamente anestesiado mediante leve pinçamento do dedo do pé. Coloque uma placa cirúrgica dentro de uma cabine de segurança biológica.Posicione o animal sobre a prancha cirúrgica de modo que a porção ventral do camundongo fique voltada para cima e a porção anterior do camundongo seja colocada dentro do cone nasal conectado à fonte de isoflurano e oxigênio. Reduza a vaporização de isoflurano para dois por cento para manter a anestesia. Desinfete a pele passando um cotonete estéril embebido em etanol a setenta por cento.Realize uma incisão transversal de aproximadamente um centímetro na pele logo abaixo do esterno, perpendicular ao processo xifoide e paralela à caixa torácica. Separe suavemente a pele e o peritônio próximo à incisão. Faça uma incisão transversal através da camada peritoneal logo abaixo do processo xifoide para expor o lobo esquerdo do fígado.Dois cotonetes umedecidos serão utilizados. Coloque um dos cotonetes no lado abdominal do corte e posicione outro cotonete no lado do diafragma. Agora, pressione suavemente o cotonete colocado em direção ao diafragma e realize um movimento deslizante com o outro cotonete para levantar o lobo esquerdo do fígado.Coloque um laço de fio de seda na base do lobo lateral esquerdo, próximo ao hilo hepático, utilizando a pinça de microdissecação. Após fechar ligeiramente o nó, deslize o fio de seda o máximo possível até a base do lobo hepático. Aperte o nó e faça dois nós adicionais no outro lado.Corte o lobo amarrado usando uma tesoura de microcirurgia. Esta imagem mostra a parte remanescente do lobo esquerdo após a ressecção. Suture o peritônio com ponto contínuo utilizando sutura absorvível de catgut zero quatro.Fechamento da pele por sutura contínua ou interrompida utilizando o mesmo fio absorvível de catgut quatro zero. Aplicar Betadine na região das suturas. Manter os hepatócitos ou NeoHep suspensos em cinquenta microlitros de IMDM preparados em uma seringa de insulina de um mililitro com agulha de 29 graus.Posicione o camundongo de modo que a porção lateral esquerda fique voltada para cima. Identifique a região do baço e realize uma dissecação transversal da pele. Faça um corte de dois a três milímetros na camada peritoneal para expor o baço.Coloque o baço entre duas pontas de algodão úmidas e levante-o suavemente. Fure suavemente a cápsula do baço com a agulha e libere a suspensão celular dentro do baço. Feche a peritônio com sutura contínua utilizando fio quatro zero e feche a pele com sutura descontínua.Aplicar Betadine nas suturas. Injetar cem microlitros de solução salina intraperitonealmente contendo doze miligramas do antibiótico Cefotaxima. Injetar cem microlitros de solução salina intraperitonealmente contendo doze microgramas do analgésico Meloxicam.Isso deve ser administrado diariamente por três dias após a cirurgia. Feche o vaporizador de isoflurano e coloque o camundongo na gaiola. O animal recuperará a consciência em segundos.A proliferação de hepatócitos no fígado após vinte e quatro horas de hepatectomia de trinta por cento foi examinada por meio de coloração imuno-histoquímica de cortes hepáticos com Ki-67, que é um marcador de proliferação celular. Após a coloração, esses cortes foram incubados com anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano, anti-Ki-67, para detecção, e a diaminobenzidina foi utilizada como substrato para desenvolver a coloração marrom. O núcleo foi contra-colorado com hematoxilina.Nesta imagem, as células de cor marrom são hepatócitos proliferativos positivos para Ki-67. Dez dias após o transplante, o camundongo foi eutanasiado e o fígado foi examinado. Uma imagem representativa é mostrada aqui.Do fígado regenerado, os lobos lateral direito, medial direito e medial esquerdo foram ressecados e obtidas seções de cinco mícrons. Essas seções foram coradas com anticorpo primário policlonal de coelho anti-GFP e anticorpo secundário Alexa Fluor 594 anti-coelho. O núcleo foi contra-colorido com DAPI.Esta imagem mostra a fixação de hepatócitos expressando a proteína verde fluorescente, que é visível como vermelha. Quando células semelhantes a hepatócitos de origem humana, chamadas NeoHep, foram transplantadas, observamos a expressão de Albúmina humana e Conexina 32 humana em cortes hepáticos de camundongos hepatectomizados receptores. Dez dias após a cirurgia, a análise bioquímica de enzimas secretadas pelo fígado no soro confirmou que os níveis de aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase e fosfatase alcalina foram restaurados ao normal.Da mesma forma, o exame histológico de cortes hepáticos corados com hematoxilina e eosina não revelou anormalidades dez dias após a cirurgia, indicando recuperação adequada do fígado. É importante tomar algumas precauções. Tente posicionar o nó do fio de náilon na base do lobo hepático.Não se esqueça de fazer dois nós firmes adicionais no lado oposto e não tente cortar muito próximo ao fio. Para transplantar células no baço, introduza a agulha exatamente na posição vertical e ela não deve penetrar mais do que dois milímetros. Para fechar a pele, evite o uso de grampos cirúrgicos.Em vez disso, feche-o com sutura de quatro zeros. Grampos para feridas restringem o movimento natural do camundongo e frequentemente se soltam e saem em pouco tempo. Após devolver o animal à gaiola, você pode colocar alguns pedaços de flocos de milho estéreis na gaiola e fornecer água estéril contendo cinco por cento de glicose.Se você não tiver experiência prévia com cirurgia em animais, pratique separadamente a hepatectomia parcial e o transplante em camundongos normais imunocompetentes e, em seguida, realize ambos os procedimentos em um único animal. Realize os procedimentos em camundongos imunodeficientes NOD. SCID somente após atingir uma taxa de sobrevida de cem por cento em camundongos imunocompetentes.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O transplante de células-tronco do mouse neural (NSCs) na medula espinhal de ratos com desmielinização estabelecida é detalhado. A preparação de NSCs, a laminectomia de vértebra torácica 9 (T9), e transplante de NSCs é descrito juntamente com os cuidados pré e pós-operatório dos ratos.

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de camundongo humanizado duplo com um sistema imunológico humano e células hepáticas. Envolve o transplante de células hepáticas humanas e células-tronco hematopoiéticas e progenitoras em um camundongo imunodeficiente transgênico por meio de injeção intraesplênica, levando ao enxerto de células hepáticas e ao desenvolvimento de células imunes humanas.

Desenvolvendo um modelo de camundongo humanizado com células hepáticas humanas e células imunológicas

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

Aqui, apresentamos um novo método para ressecção parcial do lobo esquerdo hepático em camundongos neonatais (dia 0). Este novo protocolo é apropriado para estudar a resposta de lesão no cenário neonatal e lesão hepática aguda.

Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de rato quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar, usando hepatócitos de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas. Este é um modelo valioso para testar novas terapias para hipercolesterolemia.

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Aqui, nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo murino clìnica relevante do cancro do fígado que recapitulando as características imunes típicas do cancro hepatocelular (HCC).

Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Neste protocolo, discutimos a implementação de um modelo de transplante ortotópico de fígado (THO) bem-sucedido em camundongos. Além disso, são discutidos também os adjuvantes para analisar melhor a patência do aloenxerto após o sucesso do TOL em camundongos, especificamente utilizando exames de microtomografia computadorizada (microTC).

Transplante Ortotópico de Fígado em Camundongos Utilizando Angiotomografia Microcomputadorizada

O modelo de camundongo de hepatectomia parcial 2/3 (66%) é bem descrito na literatura, mas hepatectomias mais extensas mimetizando a síndrome do pequeno para o tamanho após o transplante de fígado raramente foram usadas. Descrevemos um procedimento de hepatectomia estendida de 78% em um modelo de camundongo que resulta em aproximadamente 50% de letalidade pós-operatória em camundongos saudáveis.

Hepatectomia estendida de 78% em modelo cirúrgico de camundongo

Aprenda a realizar hepatectomia parcial e transplante intrassplênico de hepatócitos em camundongos NOD.SCID. Este protocolo demonstra técnicas cirúrgicas para pesquisa em terapias celulares para insuficiência hepática aguda.

Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID

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