Name: Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de xenotransplante em camundongos para linfoma de células do manto usando células derivadas de pacientes. Este método permite estudar efeitos terapêuticos in vivo e desenvolver estratégias de tratamento personalizadas.

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Este trabalho foi apoiado pela Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 e 2914-02-2012 e o suíço nacional Science Foundation Grant 31003A_156760 e o 310030-153456.

As amostras de sangue humano foram utilizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo local de ética e comissões de experimentação humana do Hospital da Universidade de Genebra.
Animais procedimentos foram realizados em conformidade com o institucional ética Comissão de cuidado Animal em Genebra, na Suíça e o veterinário cantonais (número de autorização: GE/26/15).
1. preparação de células mononucleares do sangue periférico primário (PBMC) pela separação de gradiente de densidade
Nota: obteve-se 3-5 mL de sangue periférico de pacientes que apresentam com MCL numa fase leucêmicas. O diagnóstico foi estabelecido de acordo com critérios de diagnósticos por citometria de fluxo (CD5 +, CD23−, CD200 +, população monoclonal de células B) e posteriormente confirmado pela presença de t(11;14) a translocação cromossômica e superexpressão de ciclina D1. Em todos os casos, o anticorpo monoclonal de células B constituíam para > 90% da população total de células B. As células restantes foram principalmente monócitos e algumas células T.
<ol><li>Diluído (1:1) 5 mL de amostra de sangue do MCL com 5 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (figura 1A).</li>
	<li>Inverta os meios de comunicação de gradiente de densidade (Tabela de materiais) várias vezes antes do uso para assegurar uma mistura completa.</li>
	<li>Adicione 5 mL de mídia gradiente de densidade em um tubo de centrífuga de 15 mL usando um aspirador pipeta.</li>
	<li>Suavemente da camada da amostra de sangue diluído sobre a mídia de gradiente de densidade no tubo de centrífuga de 15 mL, usando um aspirador (o sangue a relação da mídia gradiente de densidade deve ser 2:1, por exemplo, 10 mL de sangue com 5 mL de mídia gradiente de densidade). Deve ter cuidado para não misturar as duas camadas (figura 1B, C).</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 400 x g, durante 40 min à temperatura ambiente com os freios de centrífuga desligados.</li>
	<li>Delicadamente, usando uma pipeta Pasteur estéril, Aspire a camada média (esbranquiçado, fino anel marcado com uma seta (Figura 1, E)) que contém as células mononucleares e transferi-los para um tubo limpo.</li>
	<li>Lavagem de células mononucleares<ol>
<li>Estimar o volume da suspensão celular transferidos e adicione-lhe 3 volumes de estéril 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% albumina de soro bovino (BSA).</li>
		<li>Misture a suspensão pipetando subindo e descendo várias vezes.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de 400-500 x g durante 10-15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante para obter o centrifugado e repetir a etapa de lavagem.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células no volume desejado, por exemplo, 1 ou 2 mL de PBS.</li>
		<li>Conte o número de células por um contador de célula automática ou manualmente usando um hemocytometer (câmara de Neubauer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enriquecimento de células B por células B seleção negativa
<ol><li>Dilua as células em PBS para uma concentração final de 50 x 106 células/mL.</li>
	<li>Transferi as células para um 5 mL redonda poliestireno tubo inferior. Adicione 100 µ l de anticorpo cocktail do kit do enriquecimento da célula B a 2 mL de suspensão de células e misture suavemente pipetando acima e para baixo (Figura 2-1).</li>
	<li>Incube as celulas em temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>Brevemente vórtice partículas magnéticas fornecido no kit do enriquecimento de células B por 30 s (Figura 2-2). Adicione 150 µ l das partículas magnéticas a 2 mL da amostra.</li>
	<li>Incube a amostra por mais 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Trazer o volume da amostra de 2,5 mL com 1X PBS contendo 2% de soro de vitela fetal (FCS) e o ácido 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Colocar o tubo no imã e incubar o tubo por outro 3-5 min (Figura 2-3).</li>
	<li>Pegue o ímã com o tubo no lugar e em um movimento contínuo, decantar o tubo para que a suspensão de eritrócitos enriquecido é coletada em um tubo fresco (Figura 2-4). Conte as células por um contador de célula automática ou manualmente usando um hemocytometer para obter o rendimento total de células B. Nota: Normalmente, o rendimento é de 10 ~5 B células/mL para o normal de células B e 5-50 x 106 células/mL para MCL.</li>
	<li>Confirmando a pureza do enriquecimento da célula B<ol>
<li>Leve ~ 50.000 células e incubar as células com anticorpos anti-CD19/CD20 (01:20 diluição) e anticorpo anti-CD45 acoplado ao fluorochromes diferentes (01:10 diluição) à temperatura ambiente por 15-30 min.</li>
		<li>Lavar com 1 mL de 1X PBS + 1% de BSA, Centrifugar as células a 400-500 x g por 5 min e ressuspender as células em ~ 200 µ l de PBS.</li>
		<li>Adquirir as amostras de células por citometria de fluxo e analisar para a pureza das células B. A pureza é principalmente > 90% por esse método (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. desenvolvimento do modelo de Mouse de enxerto heterólogo
<ol><li>Suspenda ~ 40-60 x 106 células em 150-200 µ l de PBS 1x (volume necessário para injetar por rato).</li>
	<li>Injetar 150 µ l de suspensão de células por via intravenosa (i.v.) em cada veia da cauda de camundongos imunodeficientes 6-7 semanas da gama (NSG) do scid NOD independentemente do gênero (Figura 4A).</li>
	<li>Permitir que os ratos desenvolver linfoma humana para ~ 10 semanas. Nota: Células do linfoma primário de humano leva muito mais tempo para desenvolver o tumor, em comparação com linhas de células do linfoma humano (~ 3 semanas).</li>
	<li>Quando os animais começam a apresentar sintomas de doença fatal, como a perda de peso, cabelo babado, paralisia dos membros posteriores, diminuição da atividade, etc., sacrificar os ratos por CO2 asfixia seguida por punção cardíaca coração para obter sangue.</li>
	<li>Coletamos diferentes órgãos como a medula óssea, baço e fígado dissecando os ratos e coletar sangue periférico por sangue de desenho do coração no momento do sacrifício para análise de enxertia do tumor (Figura 4B -F).</li>
</ol>4. quimerismo análise de células de Tumor incorporada em diferentes órgãos
<ol><li>Depois de coletar os diferentes órgãos, processá-los por ruptura mecânica para gerar suspensões única célula após a lise de células vermelhas do sangue (RBC) usando 200 µ l de tampão de potássio de cloreto de amónio 1x para o sangue e medula óssea, 500 µ l para o baço e 2 mL para o fígado .</li>
	<li>Contar e mancha as células usando anticorpos específicos de célula B humana, ou seja, anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD45. Nota: Ratos NSG carecem de células B e, portanto, para análise, células estão manchadas com marcadores de célula B específico humana.</li>
	<li>Analise as células derivadas de cada órgão, por citometria de fluxo, por retenção de células B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>Quantificar as células do tumor engrafted em diferentes órgãos derivados de ratos MCL injetado baseados em células fechadas conforme indicado no passo 4.3 (Figura 4). Nota: Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Ensaios clínicos são possíveis para drogas que estão em um estágio avançado de desenvolvimento, mas não podem ser usadas para a descoberta de medicamentos. Os esforços para desenvolver animais destinatários para xenotransplante de células humanas para testar drogas cedo do palco há muito tem sido exercidos. Aqui nós apresentamos um modelo animal que evita a rejeição do enxerto humano e pode estabelecer um modelo para doenças humanas, tais como MCL. Este é actualmente um modelo de transplante do estado da arte para estuda...

Linfócitos por natureza desempenham um papel importante na vigilância imune, e tráfico de linfócitos é um passo fundamental na montagem do antígeno imunidade específica1,2. Este processo inclui a migração de ingênuo T linfócitos do timo para o fluxo de sangue e de lá para os órgãos linfoides secundários, incluindo os gânglios linfáticos, de Peyer ou baço, onde se encontram os antígenos cognatos. Os linfócitos B diferenciam na medula óssea e migram como ingênuo células em folículos de órgãos linfoides secundários3. Algumas dessas células B vincular o antígeno com o receptor e são ativadas por células T específicas. Proliferação e diferenciação dessas células B empurra as células ingênua B não está ativado, para a zona do manto do folículo. Células ativadas podem diferenciar na memória B células, que patrulham o corpo, ou maduro em imunoglobulinas secretoras células plasmáticas que migram para a medula óssea4.
MCL ocorre quando linfócitos ingênua B na zona de manto transformam em um tumor. Estas células do linfoma residem no microambiente dos órgãos linfoides e proliferaram independentemente do controle específico dos linfócitos T. No entanto, em uma determinada fase de densidade escapar deste nicho e recircular na corrente sanguínea em busca de nichos em outros órgãos. Considerando a complexidade das moléculas de adesão e a promiscuidade de quimiocinas e seus receptores, o mecanismo desse celular de tráfico na vivo é mal compreendido e, portanto, dificulta a terapia. Novos métodos são necessários para efetivamente bloquear este processo de migração para impedir que as células do linfoma B atingindo novos microambiente.
MCL é uma das mais difíceis de tratar tumores malignos de células B. O desenvolvimento de um fenótipo neoplásico de MCL é o resultado de uma cascata de várias etapas, caracterizada pela aquisição de propriedades biológicas únicas. No momento do diagnóstico, a maioria dos pacientes (70%) já está presente com uma doença disseminada, com a maioria dos casos, exibindo o envolvimento extranodal no baço, medula óssea e/ou o trato gastrointestinal5,6. Em pacientes tratados, recaída por tumores resistentes dentro de alguns anos é comum, mesmo que a quimioterapia convencional induz a taxas de remissão de alta no curto prazo7,8. Aqui nós apresentamos um novo modelo de doença que pode ajudar a entender a divulgação MCL e sua biologia subjacente: estabelecemos um humano MCL xenoenxertos rato modelo que originou as células do tumor primário dos pacientes. Esperamos que este modelo vai ajudar a desenvolver estratégias terapêuticas contra divulgação de MCL e possivelmente proporcionar novas perspectivas clínicas para melhor diagnóstico e tratamento dos pacientes recaíram.

<table><tbody><tr><td>Meios Ficoll-paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>para separação de células mononucleares</td></tr><tr><td>Meio RPMI 1640</td><td>Tecnologias Gibco-Life</td><td>61870-010</td><td>para diluição de amostra de sangue</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>lavagem de células</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>para preparação de PBS com 1% BSA usado na lavagem de células durante o isolamento</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>marcador de célula pan-B humana</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>marcador de célula pan-B humana</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>marcador de célula pan-B humana</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>marcador</td></tr> <tr>de célula T humana<td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Proteína de superfície celular tipicamente ausente no MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Marcador de pan-leucócitos</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Proteína de superfície celular tipicamente ausente em</td></tr><tr><td>camundongos MCL NOD scid gama (NSG)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>usado para desenvolver xenoenxertos MCL neste estudo</td></tr><tr><td>Kit de enriquecimento de células B humanas de fácil separação</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>19054</td><td>usadas para enriquecer células B para obter células puras para injeção em camundongos</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>usado para caracterizar a amostra MCL e estudar os órgãos para enxerto MCL</td></tr><tr><td>1X tampão de potássio cloreto de amônio tampão</td><td></td><td></td> de <td>lise de sangue vermelho (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2&middot; 2H2O 3,722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Linfócitos B são jogadores-chave na circulação de células imunes e eles principalmente para casa e residam em órgãos linfoides. Enquanto as células B normais só proliferam quando estimulados por linfócitos T, oncogênicas células B sobrevivem e expandir-se autonomamente em nichos de órgão indefinido. Linfoma de células do manto (MCL) é uma tal distúrbio de células B, onde a taxa de sobrevida mediana dos pacientes é de 4-5 anos. Isso exige a necessidade de mecanismos eficazes, pelos quais o homing e enxertia dessas células são bloqueados a fim de aumentar a sobrevivência e longevidade dos pacientes. Portanto, o esforço para desenvolver um modelo do rato de enxerto para estudar a eficácia da terapêutica MCL, bloqueando o localizador mecanismo na vivo é de extrema importância. Desenvolvimento de animais destinatários para xenotransplante de células humanas para testar drogas cedo do palco há muito ter sido exercida, como modelos de rato pré-clínicos relevantes são cruciais para novos agentes terapêuticos de tela. Este modelo animal é desenvolvido para evitar a rejeição do enxerto humano e estabelecer um modelo para doenças humanas, e pode ser uma ferramenta extremamente útil para estudar a progressão da doença de tipos diferentes de linfoma e executar testes pré-clínicos de drogas de candidato para malignidades hematológicas, como MCL. Estabelecemos um modelo do rato de enxerto heterólogo que irá servir como um excelente recurso para estudar e desenvolver novas abordagens terapêuticas para MCL.

O manuscrito descreve um protocolo otimizado para o desenvolvimento bem sucedido de um modelo de mouse de enxerto para enxertia das células MCL. Preparação de uma população celular puro (en este caso MCL células), é muito crítico para desenvolver bem sucedidas xenografts MCL. A Figura 1 representa as etapas preparativa para isolamento de células mononucleares do sangue do paciente MCL pela separação de gradiente de densidade. As células mononucleares são tran...

Linfoma de células do manto (MCL) é um difícil de tratar a doença associada a células B e é igualmente difícil estabelecer um modelo de rato de enxerto heterólogo do MCL primário para estudar e desenvolver a terapêutica. Aqui, descrevemos a criação bem sucedida de xenografts MCL em camundongos para ajudar a compreender a sua biologia subjacente.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

O objetivo geral deste método é estabelecer um modelo de camundongo com xenotransplante para o linfoma de células do manto, a fim de desenvolver estratégias de tratamento para esta doença. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da hematooncologia, como o resultado terapêutico de diferentes estratégias de tratamento. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite estudar o efeito de medicamentos sobre células humanas de linfoma in vivo.As implicações desta técnica estendem-se à terapia para linfoma de células do manto, pois, utilizando este modelo, não só é viável como também conveniente estudar o efeito da terapia em células derivadas de pacientes. Embora este método possa fornecer informações sobre os aspectos terapêuticos do linfoma de células do manto, ele também pode ser aplicado para estudar diferentes tipos de linfomas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois é difícil obter xenografias derivadas de pacientes.Quando tivemos pela primeira vez a ideia deste método, quando queríamos estudar a migração de linfócitos B in vivo e os efeitos de algumas terapias sobre esse processo. Dilua 12 mililitros de amostra sanguínea de linfoma de células do manto com volumes iguais de Meio RPMI 1640. Em seguida, inverta o meio de gradiente de densidade várias vezes antes de utilizá-lo.Aspire 15 mililitros de meio de gradiente de densidade em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Com a ajuda de um aspirador, adicione cuidadosa e suavemente a amostra de sangue diluído sobre o meio de gradiente de densidade sem misturar as duas camadas. Em seguida, desligue os freios e centrifugue a amostra de sangue a 400g por 40 minutos à temperatura ambiente.Utilize uma pipeta de Pasteur estéril para aspirar as células sanguíneas mononucleares da camada intermediária e transfira para um tubo limpo. Para lavar as células mononucleares, adicione três volumes de solução salina tamponada com fosfato estéril na concentração simples contendo 1% de soro bovino fetal a um volume estimado de suspensão celular. Pipete a suspensão celular várias vezes para uma mistura adequada.Em seguida, centrifugue a amostra a 400-500g durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com solução tampão salina fosfato de concentração simples contendo 1% de albumina sérica bovina. Centrifugue a amostra.Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um ou dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Depois, conte o número de células utilizando um contador automático de células. Dilua as células em solução salina tamponada com fosfato, então pipete as células para um tubo de poliestireno de cinco mililitros e adicione 100 microlitros de coquetel de anticorpos à suspensão celular.Pipete a suspensão celular suavemente várias vezes para uma mistura adequada. Em seguida, incube as células à temperatura ambiente na cabine de fluxo laminar por 10 minutos. Enquanto isso, vortexe as partículas magnéticas do kit de enriquecimento de células B por 30 segundos.Em seguida, adicione 150 microlitros das partículas magnéticas a dois mililitros de suspensão celular. Incube a mistura de partículas magnéticas e células à temperatura ambiente durante cinco minutos. Ajuste o volume da amostra para 2,5 mililitros, coloque o tubo no ímã e incube por mais três a cinco minutos.Após a incubação, em um único movimento contínuo, decante a suspensão celular do tubo ligado ao ímã para um novo tubo. Em seguida, conte o rendimento total de linfócitos B na suspensão utilizando um contador automático de células. Para confirmar a pureza dos linfócitos B enriquecidos, incube aproximadamente 50.000 células com anticorpos anti-CD19, CD20 e anti-CD45 conjugados a diferentes fluorocromos, à temperatura ambiente, por 15 a 30 minutos.Em seguida, lave as células com um mililitro de solução salina tamponada com fosfato na concentração unitária e 1% de albumina sérica bovina. Centrifugue as células a 400-500g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato.Analise a pureza das células B utilizando citometria de fluxo, que geralmente é superior a 90% com este método. Suspenda as células em 150 microlitros de solução salina tamponada com fosfato na concentração unitária. Em seguida, injete a suspensão celular por via intravenosa na veia da cauda de camundongos com idade entre seis e sete semanas, independentemente do sexo.A injeção das células de linfoma isoladas do sangue derivado do paciente por via intravenosa na veia da cauda do camundongo também é fundamental para garantir o enxerto bem-sucedido. Após sacrificar os camundongos em uma câmara de dióxido de carbono, colete os diferentes órgãos. Em seguida, submeta os órgãos à disruptura mecânica em um filtro de 70 micrômetros com o auxílio da parte traseira do êmbolo de uma seringa para gerar uma suspensão de células simples.Centrifugue todas as amostras, exceto sangue, a 400–500 ×g durante cinco minutos e despreze o sobrenadante. Utilize tampão de cloreto de amônio e potássio em concentração única para lisar células de sangue, medula óssea, baço e fígado. É importante filtrar as células derivadas de órgãos isolados de camundongos para obter uma suspensão simples de células antes de prosseguir para a citometria de fluxo, a fim de evitar entupimentos.Utilize anticorpos específicos para linfócitos B, como anti-CD19, CD20 e CD45, para corar as células. A citometria de fluxo permitiu identificar os linfócitos B derivados de cada órgão com anticorpos positivos para CD19, CD20 e CD45. Com base nas células selecionadas, quantifique as células específicas de órgão e as células tumorais enxertadas obtidas de camundongos injetados com linfoma de células do manto.Neste estudo, a citometria de fluxo é realizada para analisar a pureza de linfócitos B antes e após o enriquecimento em linfoma de células do manto. Para caracterizar o linfoma de células do manto monoclonal, são utilizados marcadores específicos de linfócitos B, como CD45, CD19, CD5, CD200, CD20, Kappa e Lambda. A análise por citometria de fluxo mostra células que se coram positivamente para CD45, CD19, CD20 e CD5.E estes são selecionados para caracterização. Células que não apresentaram coloração para CD23 e CD200 também são selecionadas. O grau de enxerto específico de órgão é investigado mediante processamento adicional dos órgãos por citometria de fluxo e posterior análise para linfócitos B.É mostrada aqui uma representação comparativa do padrão de enxertia obtido a partir de dois pacientes utilizando órgãos como baço, medula óssea e fígado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até três semanas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de enriquecer os PBMCs utilizados para xenotransplantes e também manter uma verificação regular nos camundongos quanto a sinais vitais de doença, como pelos arrepiados, postura curvada, paralisia das patas traseiras e perda de peso.Após este procedimento, xenografias poderiam ser aplicadas a outros tipos de linfomas, por exemplo, com a tendência de realizar uma medicina personalizada. Após seu desenvolvimento, esta técnica poderá abrir caminho para outros pesquisadores na área de hematooncologia explorarem os meios de como estabelecer linfoma de células do manto derivado de pacientes em camundongos nod scid imunodeficientes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como purificar PBMCs derivados de pacientes e utilizá-los para xenografar camundongos imunodeficientes, a fim de compreender a estratégia de terapias.Por favor, não se esqueça de que trabalhar com amostras sanguíneas humanas primárias pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar esses procedimentos.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método para enxertia confiável luciferase marcadas humana maligna dos nervos periféricos células tumorais em bainha do nervo ciático de ratos imunodeficientes é descrito. A utilização de imagem de bioluminescência para demonstrar estabelecimento adequado de enxertos tumor e critérios para a segregação aleatória dos animais em grupos de estudo são também discutidos.

Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar um modelo de camundongo xenoenxerto humanizado. Um camundongo imunocomprometido é injetado com ciclofosfamida para causar depleção de células imunológicas. Células tumorais derivadas de pacientes misturadas com células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) em um hidrogel são injetadas por via subcutânea no camundongo, formando um tumor com células T infiltrantes.

Uma técnica para gerar um modelo humano de camundongo xenoenxerto humanizado enxertado com PBMC

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

O protocolo atual descreve métodos para estabelecer modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) e linhas de célula cancerosas preliminares das amostras cirúrgicas do cancro gastric. Os métodos fornecem uma ferramenta útil para o desenvolvimento de drogas e pesquisa de biologia do câncer.

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.

Modelo de pele de xenoenxerto para manipular respostas imunes humanas in vivo

Aprenda a estabelecer um modelo de xenotransplante em camundongos para linfoma de células do manto usando células derivadas de pacientes. Este método permite estudar efeitos terapêuticos in vivo e desenvolver estratégias de tratamento personalizadas.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

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