Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

O objetivo geral deste protocolo é identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em ressecções de pacientes com glioblastoma utilizando imuno-histoquímica cromogênica e o ImageJ. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do microambiente tumoral, como a aparência desses componentes em amostras de pacientes e como podemos determinar razões fisiologicamente relevantes entre as células. A principal vantagem desta técnica é que ela é direta para análise em amostras de pacientes. As implicações desta técnica estendem-se para a elucidação do complexo microambiente tumoral do glioblastoma, que ainda é pouco caracterizado.

De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o tempo de desenvolvimento cromogênico precisa ser rigorosamente monitorado para evitar superdesenvolvimento e saturação do tecido. Inicie o protocolo realizando as lavagens especificadas no protocolo textual complementar. Dilua a solução desmascaradora de antígenos com base em tris e pH elevado com água destilada, seguindo as recomendações do fabricante.

Prosseguir para a recuperação de antígeno mediada por calor, adicionando a solução de desmascaramento diluída a um recipiente micro-ondulável não vedado. Colocar as lâminas no recipiente. Em seguida, colocar o recipiente com as lâminas no micro-ondas.

Em seguida, ferva o recipiente por 20 minutos em potência alta. Monitore os níveis de líquido para evaporação e reabasteça o recipiente com água destilada conforme necessário. Deixe as amostras esfriarem na solução por uma hora à temperatura ambiente.

Contorne a amostra de tecido com um marcador hidrofóbico para minimizar o volume de reagentes necessário para cobrir a amostra. Em seguida, adicione cuidadosamente entre 100 e 200 microlitros da solução de permeabilização, suficiente para cobrir a amostra de tecido. Remova e descarte a solução e, novamente, cubra a amostra de tecido com a solução de permeabilização.

Incube as amostras à temperatura ambiente com a solução bloqueadora por uma hora. Em seguida, incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com os anticorpos primários diluídos na solução bloqueadora. No dia seguinte, detecte os anticorpos primários utilizando um reagente polimérico de peroxidase de rábano-picante correspondente ao animal hospedeiro do anticorpo primário.

Pipete quantidade suficiente de solução de permeabilização para cobrir a amostra de tecido e incube a amostra por cinco minutos. Remova e descarte a solução e cubra a amostra de tecido com solução de permeabilização mais uma vez por cinco minutos. Incube as lâminas em peróxido de hidrogênio 0,3% e TBS 1X por 15 minutos.

Desenvolva as amostras com uma peroxidase diaminobenzidina ou substrato dab por dois a 10 minutos, até que a intensidade de coloração desejada seja alcançada. Contracolora as amostras para identificar os núcleos celulares, como com hematoxilina, seguindo o protocolo do fabricante. Desidrate as amostras com etanol a 100% e xilol.

Por fim, monte as amostras permanentemente com meio de montagem. Duas regiões de interesse nas ressecções tumorais, a região principal do tumor (Bulk) e as regiões adjacentes, compostas principalmente por tecido saudável com células cancerígenas invasoras difusas, foram identificadas pelo neuropatologista colaborador em amostras de pacientes coradas com hematoxilina e eosina. A imunohistoquímica cromogênica identificou marcação positiva para astrócitos, micróglias e oligodendrócitos em cada amostra de paciente.

Realizamos a coloração sem anticorpo primário como controle negativo. O fabricante recomendou e testou diluições adicionais antes de definir a diluição de um para 200, devido à coloração positiva ideal do corpo celular e dos prolongamentos, com minimização do fundo para o anticorpo anti-ALDH1L1. Utilizando o ImageJ, a porcentagem de cobertura da coloração de oligodendrócitos positivos para OSP-1 foi quantificada para, eventualmente, comparar as diferenças em nossas regiões de interesse.

Uma vez que o limiar apropriado tenha sido aplicado à imagem, a porcentagem de cobertura proveniente do limiar pode ser medida e comparada entre múltiplos pacientes. Cinco regiões adjacentes e regionais de amostras de pacientes com glioblastoma ou GBM, juntamente com tecido cerebral saudável, foram comparadas quanto à porcentagem de cobertura da proteína específica de oligodendrócito um ou OSP1. Após dominada, a técnica de coloração pode ser realizada em quatro horas no primeiro dia e duas horas no segundo dia, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar atentamente a intensidade da coloração do tecido e sua hidratação.