Name: Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a identificar componentes do microambiente tumoral em glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ. Este método permite análises quantitativas diretas em amostras de pacientes.

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Os autores agradecem os Drs. Fahad Bafakih e Jim Mandell para aquisição e identificação de amostras de pacientes, Garrett F. Beeghly para assistência com imuno-histoquímica e o Centro de Pesquisa de Biorepositórios e Tecidos, Centro de Pesquisa Cardiovascular Center Histology Core e o Centro de Análise Biomolecular da Universidade da Virgínia para assistência com Aquisição de amostras, imuno-histoquímica e imagens.

Este protocolo identifica componentes celulares em amostras embutidas em parafina fixada em formalina (FFPE), como é típico para amostras de pacientes clínicas bancárias. A incorporação de parafina permite a melhor manutenção da morfologia celular e tecidual, além de ter uma melhor longevidade das seções. As amostras utilizadas para esta análise foram acessadas através da Universidade de Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. As amostras de pacientes foram selecionadas por um neuropatologista com base em um diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grau IV da OMS) que completaram ressecções tumorais na Universidade da Virgínia entre 2010 e 2013 e foram des-identificados antes dessa análise 11 . 1. Desparaffinização e Reidratação de Amostras FFPE NOTA: Esta parte do protocolo é específica para amostras FFPE. Embora as amostras embutidas em parafina possam ser mais úteis para esta análise, devido à preservação de células e tQuestão de morfologia, esta análise também pode ser feita com seções congeladas. Se estiver usando seções congeladas, esta porção pode ser omitida e proceder diretamente à imuno-histoquímica cromogênica. <ol><li> Execute as seguintes lavagens por 5 minutos cada: Xileno, Xileno, 100% Etanol, 100% Etanol, 95% Etanol, 95% Etanol, 70% Etanol, Água desionizada, Água desionizada </li></ol> 2. Antigen Retrieval NOTA: Esta porção do protocolo é necessária para quebrar pontes de metileno formadas durante a fixação de formalina de amostras de FFPE e expor sites de antígenos para anticorpos para se ligar. <ol><li> Diluir a solução de desmascaramento de antigénio de alto pH com base em Tris na recomendação do fabricante em água destilada. </li><li> Execute a recuperação do antígeno mediada pelo calor usando um microondas. Outras formas de recuperação mediada pelo calor (como panela de pressão, vaporizador de vegetais ou água fervente) também seriam suficientes. <ol><li> Adicione a solução de desmascaramento diluída a um microondas não seladoembarcação. Coloque as lâminas na embarcação. Coloque as lâminas no microondas. </li><li> Ferver durante 20 minutos com alta potência. Monitore os níveis de líquido para evaporação e reabasteça com água destilada conforme necessário. </li></ol></li><li> Permitir que as amostras esfriem em solução durante 1 h à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Imunohistoquímica cromogênica <ol><li> Esboce uma amostra de tecido com uma caneta hidrofóbica para minimizar o volume de reagentes necessários para cobrir a amostra. NOTA: Certifique-se de manter as amostras de tecido hidratadas e não as deixe secar, pois isso afetará a eficácia da coloração. </li><li> Pipetar uma solução de permeabilização suficiente (solução salina tamponada com Tris (TBS) + Triton-X a 0,01% para cobrir a amostra de tecido (tipicamente cerca de 100 a 200 μL). </li><li> Remova e descarte a solução e repita o passo 3.2. </li><li> Incubar amostras à temperatura ambiente com solução de bloqueio (2,5% de soro de cavalo + solução de permeabilização). </li><li> Incubar amostras durante a noite em 4 ºC com anticorpos primários diluídosEm solução de bloqueio. NOTA: Todos os anticorpos primários utilizados aqui são diluídos a 1: 200, mas as diluições ideais podem ser determinadas usando diluições em série, começando com a recomendação do fabricante. Informações detalhadas sobre os anticorpos usados ​​neste protocolo foram previamente publicadas 11 . </li><li> Detectar anticorpos primários usando um reagente de polímero de peroxidase de rábano correspondente ao animal hospedeiro do anticorpo primário, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Pipetar solução de permeabilização suficiente para cobrir a amostra de tecido e incubar durante 5 min. </li><li> Remova e descarte a solução e repita a Etapa 3.7. </li><li> Incubar as lâminas em 0,3% de H 2 O 2 em 1x TBS durante 15 min. </li><li> Desenvolva amostras com um substrato de peroxidase diaminobenzidina (DAB) durante 2 a 10 min até atingir a intensidade de mancha desejada. </li><li> Contra-amostras para identificar núcleos celulares, como com hematoxilina, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Desidratar amostras com 100%Etanol e xileno. </li><li> Monte amostras permanentemente com mídia de montagem. </li></ol> 4. Identificação das Regiões de Interesse <ol><li> Lâminas de imagem sob microscópio de campo brilhante capaz de imagens de alta resolução. NOTA: use componentes celulares de imagem com uma resolução mínima de 20x. </li><li> Mova a câmera para regiões específicas de interesse em amostras de tecido. </li><li> Salve imagens como arquivos TIFF para quantificação. </li></ol> 5. Análise de imagem <ol><li> Abra imagens no ImageJ para quantificar a cobertura percentual. </li><li> Use o plug-in Limite de cor para remover a cor roxa dos núcleos corados com hematoxilina. </li><li> Converta a imagem para 8 bits. </li><li> Adicione um limite sem fundo escuro. </li><li> Processe a imagem usando um dos 17 filtros de limiar ImageJ pré-carregados ( ou seja, MaxEntropy), de modo que apenas as porções coloridas DAB estão incluídas no limite. NOTA: Selecione o filtro de limite pré-carregado ótimo que minimizouÉ inclusão de coloração de fundo. Isso pode depender da qualidade da coloração e especificidade do anticorpo. Use o mesmo limite para todas as repetições técnicas dentro de cada amostra de paciente. </li><li> Aplicar limite. </li><li> Medir a área de porcentagem da imagem limite. </li><li> Cobertura de área percentual média para múltiplas regiões dentro de cada amostra. </li></ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
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</ol>

Nosso método aqui proposto é uma abordagem quantitativa para analisar amostras histológicas coradas usando imunohistoquímica cromogênica tradicional. A metodologia atual para este tipo de análise inclui protocolos de coloração semelhantes, seguidos pela classificação por patologistas independentes. Este método tem sido confiável, no entanto, para uma série de aplicações, é necessária uma compreensão mais precisa da maquiagem celular, como melhor compreensão da heterogeneidade associada aos tumores e recapitulação precis...

O glioblastoma (GBM), o câncer cerebral mais comum e maligno, é caracterizado por invasão altamente difusa do tumor primário para o parênquima 1 , 2 do cérebro circundante. Essa invasão difusa torna o tumor particularmente difícil de ressecar completamente, e as células cancerígenas invasoras que permanecem pós-terapia são a razão mais comum para recorrência inevitável 2 , 3 , 4 . Anteriormente, achamos inibir a invasão de células de glioma difuso para ser terapeuticamente benéfico 5 , porém pouco se sabe sobre os mecanismos complexos que contribuem para a invasão GBM. O microambiente do tumor, ou tecido que envolve o câncer, tem sido implicado na progressão de tumores em cânceres múltiplos 6 , 7 . O microambiente tumoral do glioblastoma, em pArticular, é relativamente pouco caracterizada e é exclusivamente complexa, composta de células gliais múltiplas, como astrocitos, microglia e oligodendrócitos, bem como matriz extracelular, fatores solúveis e fatores biofísicos. Experimentalmente, os astrocitos e a microglia demonstraram aumentar a progressão do glioma e a invasão 8 , 9 , 10 , mas a composição de todas as células gliais no microambiente do cérebro humano nativo é desconhecida. Nós anteriormente mostramos componentes microambientais que podem prever a sobrevivência do paciente analisando quantitativamente os componentes celulares do microambiente do glioblastoma e incorporando nossas análises em um modelo de riscos proporcionais 11 . Aqui, descrevemos o método de análise quantitativa para identificar as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais do paciente com glioblastomaS. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Avaliar a cobertura percentual cria uma medida simples para determinar as diferenças morfológicas das células, particularmente aquelas afetadas pelas interações com células cancerígenas. Estudos anteriores para quantificar a coloração histopatológica usam coloração padrão, como hematoxilina e eosina 12 ou tricromo 13 de Masson, que não aproveitam a especificidade da coloração imuno-histoquimica baseada em anticorpos. Nosso método foi desenvolvido para quantificar diretamente as populações gliais dentro das resecções tumorais do paciente com glioblastoma, que pretendemos usar para elucidar o microambiente do glioblastoma complexo.

<table><tbody><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Químico</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr> Solução de <tr><td>desmascaramento de antígeno de pH alto</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de cavalo Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IBA1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Específica Anti-Oligodendrócito1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-cabra</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-rato / coelho)</td> <td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB substrato</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Contracoloração de hematoxilina</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Meios de montagem</td><td>de Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagem Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Produtos de</td> <td>pesquisa 195506</td><td></td></tr></tbody></table> internacional

imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Com o crescente interesse no microambismo do tumor, buscamos desenvolver um método para determinar especificamente os componentes do microambiente dentro de amostras de pacientes com glioblastoma, o câncer cerebral mais mortal e invasivo. Não só os métodos quantitativos são benéficos para descrever com precisão os tecidos doentes, mas também podem contribuir para um prognóstico mais preciso, diagnóstico e desenvolvimento de sistemas e substituições de engenharia de tecidos. No glioblastoma, as células gliais, como a microglia e os astrócitos, foram correlacionadas de forma independente com um mau prognóstico com base na classificação de patologistas. No entanto, o estado dessas células e outros componentes das células gliais não foram bem descritos de forma quantitativa. Isso pode ser difícil devido aos grandes processos que marcam essas células gliais. Além disso, a maioria das análises histológicas se concentra na amostra de tecido geral ou apenas na maior parte do tumor, ao contrário de delinear as quantificações com base em regiõesSobre o tecido altamente heterogêneo. Aqui, descrevemos um método para identificar e analisar quantitativamente as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais de pacientes com glioblastoma. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais em resecções tumorais do paciente e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Com essas técnicas, podemos descrever melhor as células gliais em todas as regiões do microambiente do tumor de glioma.

Para esta análise, duas regiões de interesses dentro de nossas ressecções tumorais - o tumor primário e as regiões adjacentes, principalmente composta de tecido saudável com células invadidas de câncer invasivo ( Figura 1A , 1B ) - foram identificadas por neuropatologistas colaboradores em hematóxilina e paciente com corante de eosina Amostras. Dentro de cada amostra de paciente, identificou-se a coloração positiva para astrocitos ( <strong ...

Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.

Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em ressecções de pacientes com glioblastoma utilizando imuno-histoquímica cromogênica e o ImageJ. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do microambiente tumoral, como a aparência desses componentes em amostras de pacientes e como podemos determinar razões fisiologicamente relevantes entre as células. A principal vantagem desta técnica é que ela é direta para análise em amostras de pacientes. As implicações desta técnica estendem-se para a elucidação do complexo microambiente tumoral do glioblastoma, que ainda é pouco caracterizado.De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o tempo de desenvolvimento cromogênico precisa ser rigorosamente monitorado para evitar superdesenvolvimento e saturação do tecido. Inicie o protocolo realizando as lavagens especificadas no protocolo textual complementar. Dilua a solução desmascaradora de antígenos com base em tris e pH elevado com água destilada, seguindo as recomendações do fabricante.Prosseguir para a recuperação de antígeno mediada por calor, adicionando a solução de desmascaramento diluída a um recipiente micro-ondulável não vedado. Colocar as lâminas no recipiente. Em seguida, colocar o recipiente com as lâminas no micro-ondas.Em seguida, ferva o recipiente por 20 minutos em potência alta. Monitore os níveis de líquido para evaporação e reabasteça o recipiente com água destilada conforme necessário. Deixe as amostras esfriarem na solução por uma hora à temperatura ambiente.Contorne a amostra de tecido com um marcador hidrofóbico para minimizar o volume de reagentes necessário para cobrir a amostra. Em seguida, adicione cuidadosamente entre 100 e 200 microlitros da solução de permeabilização, suficiente para cobrir a amostra de tecido. Remova e descarte a solução e, novamente, cubra a amostra de tecido com a solução de permeabilização.Incube as amostras à temperatura ambiente com a solução bloqueadora por uma hora. Em seguida, incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com os anticorpos primários diluídos na solução bloqueadora. No dia seguinte, detecte os anticorpos primários utilizando um reagente polimérico de peroxidase de rábano-picante correspondente ao animal hospedeiro do anticorpo primário.Pipete quantidade suficiente de solução de permeabilização para cobrir a amostra de tecido e incube a amostra por cinco minutos. Remova e descarte a solução e cubra a amostra de tecido com solução de permeabilização mais uma vez por cinco minutos. Incube as lâminas em peróxido de hidrogênio 0,3% e TBS 1X por 15 minutos.Desenvolva as amostras com uma peroxidase diaminobenzidina ou substrato dab por dois a 10 minutos, até que a intensidade de coloração desejada seja alcançada. Contracolora as amostras para identificar os núcleos celulares, como com hematoxilina, seguindo o protocolo do fabricante. Desidrate as amostras com etanol a 100% e xilol.Por fim, monte as amostras permanentemente com meio de montagem. Duas regiões de interesse nas ressecções tumorais, a região principal do tumor (Bulk) e as regiões adjacentes, compostas principalmente por tecido saudável com células cancerígenas invasoras difusas, foram identificadas pelo neuropatologista colaborador em amostras de pacientes coradas com hematoxilina e eosina. A imunohistoquímica cromogênica identificou marcação positiva para astrócitos, micróglias e oligodendrócitos em cada amostra de paciente.Realizamos a coloração sem anticorpo primário como controle negativo. O fabricante recomendou e testou diluições adicionais antes de definir a diluição de um para 200, devido à coloração positiva ideal do corpo celular e dos prolongamentos, com minimização do fundo para o anticorpo anti-ALDH1L1. Utilizando o ImageJ, a porcentagem de cobertura da coloração de oligodendrócitos positivos para OSP-1 foi quantificada para, eventualmente, comparar as diferenças em nossas regiões de interesse.Uma vez que o limiar apropriado tenha sido aplicado à imagem, a porcentagem de cobertura proveniente do limiar pode ser medida e comparada entre múltiplos pacientes. Cinco regiões adjacentes e regionais de amostras de pacientes com glioblastoma ou GBM, juntamente com tecido cerebral saudável, foram comparadas quanto à porcentagem de cobertura da proteína específica de oligodendrócito um ou OSP1. Após dominada, a técnica de coloração pode ser realizada em quatro horas no primeiro dia e duas horas no segundo dia, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar atentamente a intensidade da coloração do tecido e sua hidratação.

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Fonte: Núñez, F. J., et al. Avaliação de biomarcadores em glioma por imuno-histoquímica em culturas de neuroesferas de glioma 3D embebidas em parafina. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra uma técnica imuno-histoquímica para rotular biomarcadores tumorais em neuroesferas tumorais cerebrais embebidas em parafina. As seções da neuroesfera são submetidas à remoção e reidratação da parafina, seguida de tratamento para expor os locais dos biomarcadores. Anticorpos primários e secundários são...

Coloração imuno-histoquímica de biomarcadores em seções de neuroesferas de tumores cerebrais

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Apresentamos um método para replicar o microambiente tumoral de glioma na frente invasiva que incorpora fluxo de fluido intersticial. Este modelo é um hidrogel de hialuronano-colágeno I em um inserto de cultura de tecidos onde uma cabeça de pressão de fluido pode ser aplicada. A invasão pode ser quantificada e as células podem ser isoladas ou lisadas.

Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

Esse protocolo preparou com sucesso tecido neovascular de alta qualidade suficiente a partir de amostras de glioma usando microdissecação por captura a laser para análise proteômica quantitativa da angiogênese tumoral, superando as limitações de estudos que tradicionalmente focam principalmente em fatores angiogênicos e fornecendo um perfil proteômico em larga escala da angiogênese do glioma.

Preparação de tecidos neovasculares de tecidos de glioma humanos para análise proteômica quantitativa da angiogênese tumoral

Aprenda a identificar componentes do microambiente tumoral em glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ. Este método permite análises quantitativas diretas em amostras de pacientes.

Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

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