Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

O objetivo geral deste procedimento é capturar eficientemente uma transitoriedade de cálcio de imagem em neurônios da cabeça de C.Elegans masculinos após a exposição a feromônios. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como a compreensão da regulação do circuito neural específico do sexo. A principal vantagem desta técnica é que os machos C.Elegans agora podem ser visualizados de forma eficiente em um dispositivo de armadilha microfluídica.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque carregar animais pode ser difícil no início e os feromônios biogênicos não provocam transitoriedade de cálcio em todos os animais. Para iniciar a montagem dos reservatórios, prepare três conjuntos de tubos inserindo uma agulha em uma extremidade e um tubo de metal na outra. Em seguida, para cada reservatório, pegue uma válvula luer de três vias e conecte uma seringa de 30 mililitros com seu êmbolo removido, uma seringa de três mililitros e o tubo.

Encha cada reservatório com o tampão apropriado, estímulo S basal ou S basal contendo fluorescina. Em seguida, remova todas as bolhas de ar do reservatório e da tubulação, sacudindo e bombeando a seringa. Agora, encha uma nova seringa e tubo de três mililitros com S basal e insira na porta de saída do dispositivo microfluídico.

Aplique suavemente um pouco de pressão na seringa até que o tampão apareça na superfície dos orifícios de entrada. Em seguida, conecte os tubos de controle de fluxo, tampão e reservatório de estímulo aos orifícios de entrada apropriados, garantindo que gotas de líquido estejam presentes no orifício da porta de carregamento e na tubulação a ser conectada. Agora, aplique suavemente um pouco mais de pressão na seringa até que as gotículas apareçam na entrada da porta de carregamento do sem-fim e, em seguida, insira um pino de bloqueio sólido nessa porta.

Em seguida, remova a seringa da porta de saída e conecte uma linha de saída conectada à casa de vácuo. Agora, inspecione o dispositivo em busca de bolhas nos canais de flutuação na alimentação de vídeo do microscópio. Clique em ao vivo, para observar a imagem ao vivo e espere que as bolhas se dissipem naturalmente antes de prosseguir.

Em seguida, ligue a fonte de luz fluorescente e use um filtro GFP para confirmar a dinâmica de fluxo adequada. Acione a válvula de três ondas e observe o fluxo de controle fluorescente aparecer na alimentação de vídeo, quando a válvula estiver aberta. Para começar, pegue uma minhoca em uma placa de ágar NGM não semeada e deixe a minhoca rastejar para longe.

Em seguida, flutue a placa com S basal. Aspirar a solução contendo o verme para a seringa. Agora, no dispositivo, desligue o vácuo para interromper o fluxo usando a válvula luer de saída.

Em seguida, remova o pino sólido que bloqueia a porta de carregamento do sem-fim. Insira a tubulação contendo sem-fins na porta de carregamento. Abra a válvula luer de saída e observe a transmissão de vídeo ao vivo.

Agora, aplique uma leve pressão na seringa até que o verme apareça. Puxe o verme para trás se ele entrar na cauda primeiro, ele deve entrar de cabeça para ser exposto ao estímulo. O usuário deve puxar o verme para trás antes que a cauda entre totalmente no canal, caso contrário, tirar o verme do canal é extremamente difícil e geralmente requer a descarga completa do verme através do canal e o carregamento de um novo verme.

Agora, usando a pressão da seringa, avance o verme através do canal e posicione a cabeça do verme, de modo que fique exposto ao fluxo tampão, mas não tão longe no canal, que fique livre para se mover. Uma pequena quantidade de movimento axial ou rotacional é esperada em animais não paralisados. Embora a adição de um paralítico aos tampões quase elimine esse efeito.

Para diminuir a probabilidade de movimento durante o teste, use machos mais velhos que são presos com mais eficiência, diminua a largura ou espessura da porta de carregamento do verme ou aumente a quantidade de tempo gasto no paralítico. Use o software para fazer gravações usando excitação de luz azul. Defina a exposição para 100 milissegundos, abra a janela de aquisição de imagem, defina os pontos de tempo para 300 com um intervalo em zero e inicie a aquisição da imagem.

Após cinco segundos, aplique o estímulo trocando a válvula de três vias que controla os amortecedores. Uma estimulação de 10 segundos é um bom ponto de partida e a duração do estímulo pode ser ajustada conforme necessário. Após a estimulação, volte a ter o fluxo premindo novamente o botão e continue a gravar até que o vídeo de 30 segundos esteja concluído.

Isso permite que a fluorescência do acampamento g retorne à linha de base. Agora, deixe a preparação descansar por 30 segundos antes da próxima tentativa. Vermes que expressam g camp três no neurônio não suscetível, ASH, respondem a um glicerol molar com mudanças visíveis na fluorescência dentro do neurônio ASH, indicativas de atividade neural.

O neurônio deve permanecer na área de análise durante todo o vídeo, caso contrário, pode ocorrer um artefato de movimento. Em caso afirmativo, mova a área de análise para esses pontos de tempo e mescle os valores de intensidade para criar um único rastreamento. Os machos que são estimulados com o atraente feromônio biogênico ascarosídeo três durante a exposição, transitoriedade de cálcio foram medidos nos quatro neurônios CEM.

De animal para animal e de neurônio para neurônio, os traços variavam em forma, sinal e magnitude. Assim, é muito importante analisar muitos animais ao estudar as respostas de feromônios. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como carregar um C elegans macho em um dispositivo microfluídico e analisar a transitoriedade do cálcio nos neurônios da cabeça.

O mesmo processo pode ser usado com hermafroditas, para identificar diferenças específicas de segundos nas respostas neurais. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em meia hora para o primeiro animal fotografado. Após a primeira gravação, um novo animal pode ser carregado na imagem em cerca de 10 minutos.

Após este procedimento, outros métodos como a optogenética podem ser combinados com este protocolo para entender melhor como os circuitos neurais são regulados.