Name: Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar queratinócitos primários de pele de rato neonatal e adulto. Este método permite estudar diferenciação celular e respostas imunes à radiação UVB em biologia epidérmica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela subvenção de INSTITUTO NACIONAL DE ARTRITE E MÚSICA MUSCULOSALELÉTICA E PELE (R01AR069653 a Zhang LJ) e Institutos Nacionais de Apoio à Saúde (5T32AR062496-03 a CA).

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSD. 1. Isolamento primário e cultura de KC do mouse por pele neonatal <ol><li> Sacrifique o nascimento pós-natal de 0 a 2 neonatos da cepa do mouse tipo selvagem C57B / 6 por decapitação usando tesoura. Corte os membros logo acima das articulações do pulso e do tornozelo, depois corte a cauda completamente, deixando um pequeno orifício. </li><li> Para descascar a pele inteira, primeiro inserir tesoura afiada através do buraco na cauda e cortar a pele ao longo da linha dorsal do meio do corpo até a abertura no pescoço. Em seguida, use uma pinça para agarrar o corpo exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele inteira do corpo e sobre os tocos da perna com um movimento contínuo. <ol><li> Retire a pele como uma peça intacta e tenha cuidado para não quebrar a pele em pedaços, pois isso irá resultar em perda de células durante a etapa de dispase. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Enxágue a pele descascada com 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm e, em seguida, coloque a pele de cada cachorrinho em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada, que contém 4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC (KC meio basal tem 0,06 mM de CaCl2, DG, e antibióticos / antimicóticos). NOTA: vários isolados de pele podem ser combinados e incubados em um tubo de 15 mL (até 5 peles por tubo) contendo 12 mL de solução de dispase. Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador. <ol><li> Certifique-se de que a pele não está dobrada no tubo, pois isso irá resultar em exposição insuficiente da região dobrada à solução dispase. </li></ol></li><li> No dia seguinte (após 12-18 h em dispase), transfira a pele juntamente com a solução de dispersão para uma placa de Petri. Transfira cada peça de tecido para uma nova placa de Petri com 15 ml de PBS estéril para lavar o excesso de dispase. </li><li> Usando dois pares de pinças, segure a pele do PBS,Levante a pele e transfira para uma nova placa de Petri com o lado epidérmico para baixo e a derme para cima. Estique cuidadosamente as dobras da pele de modo a que ela seja totalmente estendida na placa de Petri. </li><li> Coloque 500 μL de uma solução de digestão à base de tripsina para cada pele em uma nova placa de Petri. Usando fórceps, levante lentamente a derme para cima e afastar-se da epiderme, enquanto mantém pressionada a epiderme. Descarte a derme como material biológico perigoso. Transfira a epiderme separada e flutue em cada gota de solução de tripsina com a camada basal para baixo. <ol><li> Se a epiderme é dobrada na solução de tripsina, remova as dobras usando fórceps para garantir uma digestão eficiente de KCs basais do epitélio. </li></ol></li><li> Incube a pele em uma placa de Petri em solução de tripsina à temperatura ambiente (com a tampa coberta) em um agitador horizontal com agitação suave durante 20 min. </li><li> Adicione 2 mL de meio de crescimento de KC suplementado por epiderme (cerca de 1 polegada quadrada de tamanho porEpiderme) para a placa de Petri. Segure a epiderme usando fórceps e esfregue vigorosamente a epiderme para trás e para trás para liberar células únicas da folha epidérmica. <ol><li> Observe que o meio se torna cada vez mais turvo à medida que as células são separadas da epiderme. Incline a placa Petri para recolher e transferir a suspensão celular para um novo tubo, deixando a folha epidérmica restante no prato. </li></ol></li><li> Repita mais duas vezes o esfregamento da folha epidérmica após a adição de 2 mL de meio de crescimento KC e combine as suspensões celulares no mesmo tubo. </li><li> Pipetar a solução celular de forma ascendente e descendente suavemente algumas vezes para quebrar qualquer aglomerado celular usando a pipeta serológica apropriada e passá-lo através de um filtro de 100 μm para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. </li><li> Centrifugar as células filtradas durante 5 min a 180 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender gentilmente o sedimento celular em 1 mL de meio de crescimento KC frio / epiderme. </li><li> Conte as células por um hemocitômetro. <br/&gt; NOTA: Os KCs podem se diferenciar espontaneamente em suspensão, de modo que as células devem ser banhadas o mais rápido possível após o isolamento para garantir o melhor desempenho das células. Recomendamos colocar as células no gelo enquanto conta, pois isso reduzirá a taxa de diferenciação espontânea de KC. </li><li> Semear as células a uma densidade de 5 x 10 4 / cm 2 em meio de crescimento KC em placas de cultura pré-revestida com um produto de matriz extracelular (ECM) que promove a fixação das células. NOTA: Usamos um comercial disponível (por exemplo, fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina (veja a Tabela de Materiais para detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C e meio fresco Reabastecido todos os dias. <ol><li> Para o revestimento, revestir os pratos de cultura com o material de revestimento de fixação celular aquecido até a temperatura ambiente durante 10 min a 2 h antes da semeadura celular. Remova o fator de anexo imediatamente antesAdicionando a suspensão celular. </li></ol></li><li> Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência. </li></ol> 2. Isolamento primário KC do mouse da pele de cauda adulta <ol><li> Sacrifique um mouse adulto C57BL / 6 (de preferência entre 6-15 semanas de idade, masculino ou feminino) de acordo com os regulamentos da instalação animal. Corte a cauda do corpo da base da cauda e corte ~ 2 mm da ponta da cauda para que haja um orifício visível na ponta. </li><li> Para descascar a pele da cauda, ​​primeiro use uma lâmina afiada para cortar a pele da cauda da base até a ponta da cauda. Em seguida, use uma pinça para agarrar o osso da cauda exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele da cauda do osso com um movimento contínuo. Corte a pele descascada da linha média para que cada peça tenha menos de 2-3 cm de comprimento. </li><li> Enxágüe a pele de pele sagacidadeH 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm, em seguida coloque a pele de cada cauda em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada (4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC). NOTA: várias peças de pele também podem ser combinadas e incubadas em um tubo de 15 mL (até 5 caudas por tubo) contendo 12 mL de solução de dispersão. <ol><li> Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador. </li></ol></li><li> Execute os passos 1.4 a 1.13 para isolar a suspensão de célula única da epiderme da cauda. </li><li> Semente as células adultas com uma densidade de 10 x 10 4 / cm 2 (contada por um hematocitômetro) em meio de crescimento KC em pratos de cultura pré-revestidos com colágeno. NOTA: Utilizamos um kit de revestimento baseado em colágeno comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C, e o meio fresco foi reabastecido todos os dias. Em geral, o cOs pratos ulture devem ser revestidos com colágeno durante 30 min a 1 h antes da semeadura celular. Observamos que há um aprimoramento significativo da aderência KC adulta ao prato quando revestido com colágeno em comparação com o fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina. </li><li> Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência. </li></ol> 3. Diferenciação in vitro de KCs por alto cálcio <ol><li> Para induzir a diferenciação terminal, adicionar CaCl 2-0,2 mM no meio de cultura. </li><li> Alternativamente, fome os KCs cultivados durante a noite sem suplementos de crescimento adicionados em meio basal de baixo teor de cálcio KC antes da adição de alto teor de cálcio. NOTA: A fome do fator de crescimento aumentará o comprometimento celular para a diferenciação precoce e a indução de marcadores de diferenciação precoce, como o K10 5 </Sup&gt;. </li></ol> 4. Mortalidade celular mediada por irradiação UVB e liberação de TNFα de KCs <ol><li> Cultive os KCs do mouse no meio de crescimento KC (em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C) com mudança média diária até as células chegarem à confluência. Imediatamente antes da irradiação UVB, remova o meio de crescimento e substitua-o por 500 μL de PBS. Em seguida, submeta as células a 25 mJ / cm 2 UVB ou controle de simulação (não UVB). NOTA: A irradiação UVB é realizada usando lâmpadas UVB portáteis com duas lâmpadas de 8 W (312 nm) como descrito anteriormente 10 . Após a irradiação UVB, o PBS é aspirado e o meio fresco é adicionado. </li><li> Medir e quantificar a viabilidade celular pelo teste de viabilidade CCK-8 a 6, 8 e 24 h após o tratamento com UVB seguindo as instruções do fabricante 11 . </li><li> Recolher o meio condicionado dos KCs tratados com UVB nos pontos de tempo desejados e medir o TNFα liberadoNo meio condicionado pelo kit ELISA do TNF (Mono / Mono), seguindo as instruções 7 , 12 do fabricante. </li></ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
<li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis%3A+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li>
<li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li>
<li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li>
<li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li>
<li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+%28DPP4%29+in+primary+human+%28pre%29adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074(2016).</li>
<li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-inducible+C-type+lectin%2C+mincle%2C+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li>
<li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15502164">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li>
<li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li>
<li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li>
<li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li>
<li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+cell+cycle+exit%2C+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes%3A+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li>
<li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+1.2+mmol%2Fl+calcium%2C+triamcinolone+acetonide%2C+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A epiderme da pele funciona como uma barreira crítica para separar e proteger o corpo do ambiente externo e danos causados ​​pela perda de água, patógenos, calor e radiação UV. Os KCs são a linhagem celular predominante da epiderme e a cultura primária de KC epidérmicas é uma ferramenta útil para estudar e compreender os processos biológicos de formação de barreiras e a resposta de KCs a insultos ambientais in vitro . Aqui descrevemos métodos para isolar e cultivar KCs epidérmicos p...

A pele é o maior órgão do corpo com a epiderme como a camada mais externa. A epiderme desempenha um papel crítico na formação de uma barreira epidérmica intacta para separar o corpo do meio ambiente e, assim, evita a perda de água e fornece proteção contra insultos ambientais, como alérgenos, agentes patogênicos e exposição a UVB. A epiderme desenvolve a partir de uma única camada de queratinócitos basais indiferenciados (KCs) em um epitélio estratificado de várias camadas, consistindo de uma camada basal, seguida por uma camada espinhosa, camada granular e estrato córneo. Os KCs basais, que consistem em células-tronco epidérmicas e células amplificadoras de trânsito, são proliferativos e indiferenciados. À medida que os KC basais saem do ciclo celular, as células comprometem-se a se diferenciar e migram gradualmente para a superfície da epiderme, acompanhada pela maturação das junções célula-célula e na formação de uma barreira de permeabilidade epidérmica (EPB). Os KCs na camada espinhosa expressam diferenciais iniciaisMarcadores de iões tais como queratina 10 (K10); À medida que os KCs migram para a camada granular, as células expressam marcadores de diferenciação tardia, como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). No stratum corneum, os KCs se tornam corneócitos terminalmente diferenciados, que eventualmente são lançados através da descamação, à medida que novas células os substituem. O cálcio é considerado o agente mais fisiológico na epiderme e desencadeia a diferenciação in vitro e in vivo de maneira similar. Na epiderme de pele normal, os íons de cálcio formam um &quot;gradiente de concentração&quot; característico, aumentando a concentração para a superfície da pele 1 , 2 , 3 . A concentração de cálcio aumenta de níveis baixos nas subcamadas mais baixas (camadas basais e espinhosas) até um pico na camada granular superior e depois cai para níveis insignificantes na camada mais superficial (estrato córneo).<html> O gradiente de cálcio também se desenvolve coincidentemente com o surgimento de uma barreira de permeabilidade de componentes, que apóia que a sinalização de cálcio desempenha um papel crítico na diferenciação de KC. In vitro , baixo teor de cálcio (0,02-0,1 mM) mantém a proliferação de KCs basais como monocamada, enquanto que o alto teor de cálcio (&gt; 0,1 mM) induz um comprometimento rápido e irreversível das células para a diferenciação terminal, como demonstrado pela formação e indução da junção apertada De LOR e INV após alto tratamento de cálcio com os KC basais 4 , 5 . Além da formação de barreiras, os KC epidérmicos também são um componente importante do sistema imune inato da pele. Em resposta a patógenos ou padrões moleculares associados danificados (DAMPs) liberados após irradiação UVB ou lesões, os KCs podem produzir grandes quantidades de citocinas inflamatórias, como TNFα, IL6 e IFNβ, levando a ativação do sistema imunológico&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . Embora seja necessária uma sinalização inflamatória adequada de KCs para a depuração de patógenos, a resposta inflamatória descontrolada pode desencadear o desenvolvimento de doenças de pele auto-inflamatórias, como psoríase e rosácea 6 , 8 . Em geral, os KCs desempenham um papel vital na manutenção da barreira da pele intacta e no início de uma resposta imune após invasão de patógenos ou insultos ambientais. Portanto, a cultura primária de KCs epidérmicos é uma técnica útil para estudar a biologia epitelial, a diferenciação de KC, bem como as respostas imunes inatas estimuladas por KC. O isolamento e a cultura dos KCs epidérmicos de ratos primários podem ser um processo desafiador devido à susceptibilidade e sensibilidade de KC a vários estimulantes externos. Aqui descrevemos um método para isolar e cultura KCs de pele neonatal de mouse ouPele de cauda de rato adulto. Para o isolamento KC adulto, não usamos a pele dorsal do mouse porque o isolamento de quantidades suficientes de KC viáveis ​​deste tecido pode ser difícil pelas seguintes razões: Primeiro, a pele dorsal adulta na fase de repouso do ciclo do cabelo (telógeno) consiste em um Epiderme fina com apenas 1-2 camadas de células, levando a um baixo rendimento celular e a uma separação ineficiente da epiderme da derme, que é o passo crítico para o sucesso do isolamento de KC. Em segundo lugar, a alta densidade folicular do cabelo que está presente na pele dorsal adulta contribui ainda mais para a dificuldade em separar a epiderme da derme. Em vez disso, usamos rotineiramente a pele da cauda como fonte de KCs para ratos adultos, pois esse epitélio é mais espesso com 3-5 camadas de KC epidérmico. Também possui uma menor densidade do folículo capilar, o que não interfere na separação epidérmica, permitindo o isolamento KC de qualquer pele de rabo de rato adulto, independentemente da idade e do estágio de ciclismo do mouse. A neona isoladaKCs são semeados para pratos de cultura revestidos com gelatina, enquanto que os pratos revestidos com colágeno são utilizados para semente KC adultos isolados devido à capacidade prejudicada das células adultas para aderir em comparação com as suas contrapartes neonatais. Para cultivar KCs de ratinho, o meio basal de baixo cálcio é suplementado com dGS, que contém o fator de crescimento epidérmico (EGF), a transferrina bovina, o fator de crescimento insulino-tipo1 (IGF1), a prostaglandina E2 (PGE2), a albumina de soro bovino (BSA) e a hidrocortisona. Entre 2-4 dias após o chapeamento inicial, a maioria dos KCs diferenciados podem ser lavados durante as mudanças diárias do meio, e as células aderentes restantes apresentam morfologia típica em paralelepípedos 4 , estão proliferando e não expressam o marcador de diferenciação inicial K10.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6 recém-nascidos ou camundongos adultos do tipo selvagem</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>camundongos do tipo selvagem (originalmente comprados do Jackson Laboratory) são criados e mantidos em biotério animal na UCSD.</td></tr><tr><td>KC meio basal (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>meio basal para cultura de queratinócitos com 0,06 mM CaCl2</td></tr><tr><td>Suplemento de crescimento definido (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>suplementos de crescimento definido para meio de cultura</td></tr><tr><td>Dissolver o pó</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>enzima para dissociar a epiderme da derme</td></tr><tr><td>Fator de Fixação</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>material de revestimento à base de gelatina</td></tr><tr><td>Matriz de revestimento</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Material de revestimento à base de colágeno</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>Uma enzima suave semelhante à tripsina para dissociar queratinócitos da folha epidérmica</td></tr><tr><td>100 &mu; m Cell Strainer Malha de nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 kit de viabilidade celular</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF (Mono/Mono) Conjunto ELISA II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpadas UV portáteis com fio</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>Tubos UV EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>de 8 watts</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>Microscópio invertido claro BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>para a cultura celular</td><td>ZEISS, Jena, Alemanha</td> Microscópio fluorescente <td>Olympus</td> BX41 do observador <td></td>de Axio</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de queratinócitos de rato primário de pele de rato neonatal e adulto

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

O queratinócito (KC) é o tipo de célula predominante na epiderme, a camada mais externa da pele. Os KC epidérmicos desempenham um papel crítico no fornecimento de defesa da pele ao formar uma barreira da pele intacta contra insultos ambientais, como a irradiação UVB ou patógenos, e também iniciando uma resposta inflamatória sobre esses insultos. Aqui descrevemos métodos para isolar KCs de pele de rato neonatal e de pele de rabo de rato adulto. Também descrevemos condições de cultura usando suplementos de crescimento definidos (dGS) em comparação com o soro fetal bovino chelexado (cFBS). Funcionalmente, mostramos que os KCs neonatais e adultos são altamente responsivos à alta diferenciação terminal induzida por cálcio, formação de junção apertada e estratificação. Além disso, os KCs adultos cultivados são suscetíveis à morte celular desencadeada por UVB e podem liberar grandes quantidades de TNF após a irradiação UVB. Juntos, os métodos descritos aqui serão úteis aos pesquisadores para a configuração do modelo in vitroS para estudar biologia epidérmica no rato neonatal e / ou no rato adulto.

Alta diferenciação terminal induzida por cálcio de KC neonatal e adulto. O primário epidérmico do rato KCs plaqueadas e mantidas a 0,06 mM de CaCl2 cresceu como uma monocamada, e as células individuais tinham uma forma poligonal com espaço intercelular distintas, que mostra o aspecto de paralelepípedos quando confluentes (Figura 1A e Figura 2A). Elevando o CaCl 2-0,2 mM induziu uma morfolog...

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar queratinócitos primários de pele de camundongo neonatal ou adulto para sua diferenciação in vitro ou para estudar suas respostas imunes inatas à exposição à UVb. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia epidérmica sobre como a diferenciação dos queratinócitos é regulada ou como os queratinócitos epidérmicos respondem a estímulos externos. As principais vantagens desta técnica são que os queratinócitos podem ser convencionalmente isolados tanto de pele de camundongo neonatal quanto adulto e que podem ser cultivados com nosso soro.Realizando o procedimento junto comigo estará Fengwu Li, um pesquisador colaborador da minha equipe. Comece removendo as patas de um camundongo neonato do tipo selvagem C57 BL6 de dia pós-natal zero a dois, logo acima das articulações dos punhos, e corte completamente a cauda, deixando apenas uma pequena bolinha. Insira uma tesoura fina através do orifício da cauda e corte a pele ao longo da linha média dorsal do corpo até a abertura no pescoço.Usando uma pinça, segure o corpo exposto e utilize outra pinça para segurar a pele. Em seguida, descasque suavemente toda a pele do corpo e sobre os cotos das pernas em um único movimento contínuo, tomando cuidado para não romper a pele em pedaços. Enxágue a pele descascada com 50 mililitros de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 centímetros e coloque a pele em um tubo de dois mililitros contendo tampão de digestão com dispase gelado, tomando cuidado para que a pele não fique dobrada.Após coletar todas as lâminas de pele neonatal, coloque o tubo em um rotador a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira o conteúdo do tubo para um novo recipiente de Petri. Em seguida, transfira cada fragmento de tecido para um novo recipiente de Petri contendo 50 mililitros de PBS estéril para remover qualquer excesso de dispase.Use duas pinças, coloque as amostras de pele em placas de Petri individuais, com o lado epidérmico voltado para baixo, e estique cuidadosamente as dobras da pele para que os fragmentos fiquem totalmente estendidos sobre o fundo das placas. Adicione 500 microlitros de uma solução digestiva à base de tripsina a cada placa e use uma pinça para levantar lentamente cada derme para longe do epitélio, mantendo o epitélio no lugar com a segunda pinça. Deixe os epitélios isolados flutuando na solução de tripsina com as camadas basais voltadas para baixo e cubra as placas.Em seguida, incube os fragmentos de pele em um agitador horizontal à temperatura ambiente, com agitação suave por 20 minutos. Ao final da incubação, adicione dois mililitros de meio de crescimento para queratinócitos suplementado por epiderme a cada placa de Petri e use pinças para esfregar vigorosamente as lâminas epiteliais, liberando as células isoladas do tecido cutâneo. Quando o meio ficar turvo, incline as placas para permitir a coleta e a transferência das suspensões celulares para um novo tubo.Deixando o tecido epidérmico remanescente na placa. Após a terceira coleta celular, pipete suavemente algumas vezes a suspensão celular combinada para dissociar eventuais agregados celulares e filtre as células através de um filtro de 100 micrômetros para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Recolha as células por centrifugação e ressuspenda suavemente o pellet em um mililitro de meio de crescimento para queratinócitos frio sobre gelo, para contagem.Semeie as células com densidade de 5x10⁴ por centímetro quadrado em meio de crescimento para queratinócitos em placas de cultura previamente revestidas com um produto de matriz extracelular que promova a adesão celular. Incube, então, as células a 37 °C e 5% de CO₂, substituindo o sobrenadante diariamente por meio fresco até que as células atinjam a confluência apropriada. Para isolar queratinócitos de um camundongo adulto, remova primeiro a cauda na sua base.Em seguida, remova aproximadamente dois milímetros da ponta da cauda, de modo que haja um orifício visível. Use uma lâmina afiada para cortar ao longo da pele da cauda, desde a base até a ponta. Depois, usando uma pinça para segurar o osso da cauda exposto e outra pinça para segurar a pele, retire suavemente o tecido da pele do osso em um único movimento contínuo.Corte a pele descascada ao meio, de modo que cada pedaço tenha menos de dois a três centímetros de comprimento, e enxágue os pedaços em 15 mililitros de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 centímetros. Coloque as peles de até cinco caudas em um tubo de 15 mililitros contendo até 12 mililitros de tampão de digestão com dispase gelado e incube as peles durante a noite a quatro graus Celsius, com rotação. Na manhã seguinte, isole as células epidérmicas das lâminas de pele parcialmente digeridas, conforme demonstrado anteriormente para as amostras de pele neonatal.Em seguida, semeie as células queratinócitos adultas isoladas numa densidade de 1x10⁵ por centímetro quadrado em meio de crescimento para queratinócitos, em placas de cultura previamente revestidas com colágeno. Troque o sobrenadante diariamente até que as células atinjam a confluência adequada. Para induzir a diferenciação terminal de qualquer tipo de cultura de queratinócitos, adicione cloreto de cálcio às células numa concentração de 2 nanomolares.Para a morte induzida pela irradiação UVb, substitua o meio de crescimento de uma cultura confluentes de queratinócitos por 500 microlitros de PBS e exponha brevemente as células a 15 milijoules por centímetro quadrado de UVb. Substitua o PBS por meio de crescimento fresco e retorne as células ao incubador de cultura celular por seis horas. Após coletar o meio condicionado em cada ponto temporal experimental, quantifique a viabilidade celular pelo ensaio de viabilidade com o kit de contagem celular, de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, meça o TNL liberado pelos queratinócitos irradiados no meio condicionado, conforme protocolos padrão. Os queratinócitos epidérmicos primários semelhantes ao modo primário, cultivados e mantidos em cloreto de cálcio 06 nanomolar, crescem em monocamada, com as células individuais exibindo formato poligonal, espaços intercelulares distintos e aparência geral semelhante a calçamento quando confluentes. Elevar a concentração de cloreto de cálcio para 2 milimolar induz uma mudança rápida na morfologia celular.Com as células se tornando achatadas e o espaço intercelular distinto se tornando menos aparente dentro de oito horas. E a adesão entre células nas junções apertadas se tornando mais acentuada dentro de 24 horas. Entre 48 e 72 horas, a formação do envoltório celular cornificado e a estratificação celular vertical tornam-se aparentes.A coloração com faloíldina em queratinócitos tratados com alto cálcio revela a formação de projeções filopódias ricas em fibras de actina entre células adjacentes, já a partir de três horas após a troca de cálcio. Entre seis e 24 horas, torna-se evidente uma remodelação adicional das fibras de actina. Com a quantidade acentuada de estratificação celular aparente em 48 horas após a exposição ao alto cálcio.A irradiação UVb induz a morte celular dependente do tempo em culturas de queratinócitos, conforme demonstrado por microscopia de contraste de fase e ensaio de viabilidade celular. De fato, após 24 horas, quase todas as células se tornam arredondadas e destacadas, sendo quantificadas como inviáveis no ensaio de viabilidade celular. Muito provavelmente devido aos altos níveis de TNF alfa liberados pelos queratinócitos em resposta à exposição à radiação UVb.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter os queratinócitos dissociados sempre em gelo e semear as células o mais rápido possível para evitar a diferenciação terminal das células isoladas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia epidérmica explorarem os papéis dos queratinócitos no desenvolvimento da pele e na defesa imune inata da pele. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar queratinócitos epidérmicos primários a partir da pele de camundongos neonatos ou adultos.

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Este vídeo descreve o isolamento de queratinócitos - as células mais proeminentes da camada epidérmica da pele humana, empregando uma combinação de digestão enzimática e métodos de ruptura mecânica. Este método ajuda no crescimento preferencial de queratinócitos em relação a outros tipos de células da pele usando um meio de crescimento seletivo.

Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura dos queratinócitos orais derivados do paladar do rato adulto. Um método de avaliação utilizando imunostaining também é relatado.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

Este protocolo descreve a cultura de queratinócitos recém-obtidos (passagem 0) para uso em imagens de células vivas.

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, purificação e cultivo de células marginais primárias da stria vascular do camundongo, e para estabelecer modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular para estudar distúrbios da parede lateral coclear.

Isolamento e Cultura de Células Marginais Primárias da Stria Vascularis de Camundongos Neonatais

Aprenda a isolar e cultivar queratinócitos primários de pele de rato neonatal e adulto. Este método permite estudar diferenciação celular e respostas imunes à radiação UVB em biologia epidérmica.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

Explorar mais vídeos