Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é determinar o estado funcional da vasomotilidade microvascular das ilhotas pancreáticas in vivo, a fim de avaliar seu impacto em doenças relacionadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área médica circulatória, como se a vasomotilidade microvascular das ilhotas pancreáticas é alterada em condições patológicas. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando demonstramos que existe uma circulação mecano-funcional que se desenvolveu durante a evolução do diabetes.

A principal vantagem desta técnica é que ela pode avaliar o estado funcional da vasomotricidade microvascular de tecidos e órgãos tanto em ambientes clínicos quanto laboratoriais. Este método pode fornecer informações sobre doenças relacionadas às ilhotas pancreáticas. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como doenças microvasculares relacionadas ao rim e à retina.

As aplicações desta técnica também se estendem para a compreensão da natureza das tendências no status funcional da vasomotricidade microvascular. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois existem grandes quantidades de dados acadêmicos microvasculares derivados do laser doppler durante os experimentos. É fundamental que a demonstração deste método seja realizada, pois muitos fatores podem afetar negativamente a coleta precisa de dados da microcirculação.

Este protocolo começa com a administração diária de injeções de STZ em camundongos durante cinco dias consecutivos. Dissolva o STZ em tampão de citrato de sódio até uma concentração de trabalho de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, administre injeções intraperitoneais utilizando uma seringa de um mililitro e agulha de 25 graus.

Os camundongos devem jejuar por quatro horas antes da injeção, mas o acesso à água não deve ser removido. Injete os camundongos controle com o mesmo volume de tampão de citrato de sódio puro. Após as injeções, forneça aos camundongos alimento normal e água com 10% de sacarose.

Após o quinto dia de injeção de STZ, substitua a água com 10% de sacarose por água normal. Nove dias depois, teste a glicemia dos camundongos. Primeiro, mantenha os camundongos em jejum por seis horas com acesso livre à água.

Em seguida, colete sangue das veias da cauda e utilize um glicosímetro padrão portátil para medir a glicose sanguínea. Considere diabéticos quaisquer camundongos com níveis de glicose no sangue acima de 200 miligramas por decilitro. Antes de utilizar o aparelho de doppler a laser, limpe primeiramente as superfícies ópticas da ponta da sonda e do conector da sonda com um pano macio e não abrasivo, depois conecte o cabo à porta do instrumento.

Em seguida, monte o suporte de calibração. Primeiro, deixe o padrão de fluxo armazenado atingir a temperatura ambiente. Isso leva cerca de meia hora.

Em seguida, agite suavemente o padrão de fluxo por 10 segundos e deixe-o em repouso na base de calibração por dois minutos. Depois, levante o grampo o máximo possível e fixe a sonda no grampo. Agora, submerja lentamente a sonda no padrão de fluxo e fixe a sonda utilizando os suportes da sonda.

Para prosseguir, reduza a luminosidade do ambiente e pressione calibração no aparelho de doppler a laser. Em seguida, selecione o canal de trabalho ao qual a sonda está conectada e execute o programa de calibração. Posicione um camundongo anestesiado em posição supina sobre uma plataforma de trabalho e fixe-o utilizando fita cirúrgica.

Em seguida, esterilize a pele abdominal com etanol 75% da região cervical até a cauda, depois cubra a periferia da região com uma esponja de gaze seca que possui um orifício central de três centímetros de largura. Em seguida, levante a pele abdominal com pinça e faça uma incisão vertical inicial ao longo da linha média do abdômen usando um bisturi ou tesoura de pele. Então, segure o músculo subjacente com pinça e realize uma incisão para acessar a cavidade abdominal.

Não lesione nenhum órgão. Para expor a cavidade abdominal, dobre a pele e o músculo subjacente sobre o tórax e, em seguida, exponha suavemente o corpo do pâncreas e o baço usando uma pinça de ponta romba. Agora, no software de controle do aparelho de doppler a laser, crie um novo arquivo de medição e configure os monitores conectados.

Na guia geral, defina a duração do monitoramento como contínua e use os valores padrão de fábrica para a guia do monitor LDF. Em seguida, abra a caixa de diálogo de configuração de exibição e selecione os canais apropriados. Depois, alterne os seguintes parâmetros: fonte de dados para o canal e rótulo, unidades e cor, então clique em avançar.

Em seguida, insira as informações de identificação sobre o sujeito e a medição na caixa de diálogo de informações do arquivo e prossiga clicando novamente em próximo. Agora, a configuração está concluída e uma janela de medição será exibida. Em seguida, avance manualmente o eletrodo até uma distância de um milímetro do pâncreas.

A precisão da medição está relacionada à distância entre a sonda e o tecido das ilhotas pancreáticas. A leitura do fluxo sanguíneo será imprecisa a menos que seja mantido cuidadosamente um espaçamento de um milímetro entre os tecidos e a sonda. Para iniciar a gravação, clique no ícone de início e os dados de PU sanguíneo microvascular começarão a ser salvos.

Faça isso durante um minuto inteiro e use os botões de exibição de compressão e expansão e os botões de aumento ou diminuição da altura das trilhas do gráfico para ajustar o efeito exibido durante a gravação e, em seguida, pare a gravação. Depois, salve o arquivo com um nome apropriado. Agora, reposicione manualmente a sonda para evitar efeitos aditivos e exaustão localizada da capacidade contrátil e de relaxamento.

No total, colete dados de PU de três pontos aleatórios no pâncreas de cada camundongo. Em algum momento durante o experimento, meça os dados de PU de uma placa não refletiva para obter um valor de controle de linha de base. Após realizar as três medições, use pontos de sutura 3-0 para fechar as camadas musculares e, em seguida, pontos de sutura 4-0 para fechar a camada da pele.

Agora, monitore o camundongo em uma gaiola de recuperação até que esteja pronto para ser transferido para uma gaiola limpa de alojamento. Em geral, a condição microcirculatória do ilhotas pancreáticas é representada por fases periódicas de contração e relaxamento. Os fenômenos hemodinâmicos globais criam um padrão de perfusão do fluxo sanguíneo.

Utilizando o aparelho de laser doppler, foram coletados dados de PU para mostrar o padrão de distribuição da perfusão sanguínea microvascular em camundongos não diabéticos e diabéticos. Os resultados foram totalmente diferentes. O ritmo de contrações e relaxamentos da vasomotilidade microvascular das ilhotas pancreáticas era caótico e irregular em camundongos diabéticos induzidos por STZ, enquanto os controles não diabéticos apresentavam oscilações rítmicas.

Em seguida, a vasomotricidade foi quantificada utilizando perfis de PU. Em comparação com os controles, a perfusão sanguínea média da microcirculação das ilhotas pancreáticas estava reduzida em camundongos diabéticos induzidos por STZ. Esses camundongos também apresentaram diminuições significativas na amplitude e na frequência dessa vasomotricidade, bem como na velocidade relativa da perfusão sanguínea para a ilhota pancreática.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que a distância entre a sonda e o tecido pancreático esteja dentro de um milímetro. Uma distância inadequada fornece uma leitura de fluxo sanguíneo artificialmente aumentada ou diminuída.

Após este procedimento, outros métodos, como o speckle a laser e o oxigênio translocante, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a visualização da isquemia, a avaliação do fluxo sanguíneo e o estado funcional da avaliação da vasomotilidade microvascular. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores e clínicos na área de endocrinologia e metabolismo explorarem os mecanismos microcirculatórios ocultos por trás das doenças relacionadas às ilhotas pancreáticas. Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos a laser pode ser extremamente perigoso devido à exposição à radiação, e precauções, como manter o ambiente a pelo menos 200 milímetros dos olhos, devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.