Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é determinar o estado funcional da vasomotricidade microvascular das ilhotas pancreáticas in vivo para avaliar seu impacto nas doenças relacionadas. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo circulatório médico, como se a vasomotricidade microvascular das ilhotas pancreáticas é alterada no estado patológico. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando demonstramos que existe uma circulação mecânica funcional que evoluiu no desenvolvimento do diabetes.

A principal vantagem desta técnica é que ela pode avaliar o estado funcional da vasomotricidade microvascular de tecidos e órgãos em ambientes clínicos e laboratoriais. Este método pode fornecer informações sobre doenças relacionadas às ilhotas pancreáticas. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como doenças microvasculares renais e relacionadas à retina.

As aplicações dessa técnica também se estendem para a compreensão da natureza das tendências no estado funcional da vasomoção microvascular. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque há grandes quantidades de dados acadêmicos microvasculares derivados do laser doppler durante os experimentos. Certifique-se de que a demonstração desse método seja crítica porque muitos fatores podem afetar adversamente a coleta precisa de dados de microcirculação.

Este protocolo começa com a administração de camundongos uma injeção diária de STZ por cinco dias consecutivos. Dissolver o STZ em tampão citrato de sódio até uma concentração de trabalho de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, administre injeções intraperitoneais por meio de uma seringa de um mililitro e agulha de calibre 25.

Os camundongos devem jejuar por quatro horas antes da injeção, mas seu acesso à água não deve ser removido. Injete os camundongos de controle com o mesmo volume de tampão de citrato de sódio puro. Após as injeções, forneça aos camundongos comida regular e 10% de água de sacarose.

Após o quinto dia de injeção de STZ, substitua a água de sacarose a 10% por água normal. Nove dias depois, teste a glicose no sangue. Primeiro, jejue os ratos por seis horas com acesso gratuito à água.

Em seguida, retire o sangue das veias da cauda e use um glicosímetro portátil padrão para medir o sangue. Considere qualquer camundongo com níveis de glicose no sangue acima de 200 miligramas por decilitro diabético. Antes de usar o aparelho doppler a laser, primeiro limpe as superfícies ópticas da ponta da sonda e do conector da sonda com um pano macio e não abrasivo e, em seguida, conecte o cabo à porta do instrumento.

Em seguida, monte o suporte de calibração. Primeiro, deixe o padrão de fluxo armazenado atingir a temperatura ambiente. Isso leva cerca de meia hora.

Em seguida, agite suavemente o padrão de fluxo por 10 segundos e deixe-o descansar na base de calibração por dois minutos. Em seguida, levante o grampo o mais alto possível e prenda a sonda no grampo. Agora, mergulhe lentamente a sonda no padrão de fluxo e prenda a sonda usando os suportes da sonda.

Para continuar, diminua as luzes da sala e pressione a calibração no aparelho doppler a laser. Agora escolha o canal de trabalho ao qual a sonda está conectada e execute o programa de calibração. Posicione um mouse anestesiado em decúbito dorsal em uma plataforma de trabalho e prenda-o com fita cirúrgica.

Em seguida, esterilize a pele abdominal com etanol 75% da região cervical até a cauda e, em seguida, cubra a periferia da região com uma esponja de gaze seca que tenha um orifício de três centímetros de largura no centro. Em seguida, levante a pele abdominal com uma pinça e faça uma incisão vertical inicial ao longo da linha média do abdômen usando um bisturi ou tesoura de pele. Em seguida, segure o músculo subjacente com uma pinça e faça uma incisão para entrar na cavidade abdominal.

Não machuque nenhum órgão. Para revelar a cavidade abdominal, dobre a pele e o músculo subjacente sobre o tórax e, em seguida, exponha suavemente o corpo pancreático e o baço usando uma pinça de nariz rombudo. Agora, no software de controle do aparelho de laser doppler, crie um novo arquivo de medição e configure os monitores conectados.

Na guia geral, defina a duração do monitoramento como execução livre e use o padrão de fábrica para a guia do monitor LDF. Em seguida, abra a caixa de diálogo de configuração de exibição e selecione os canais apropriados. Em seguida, alterne os seguintes parâmetros:fonte de dados para o canal e rótulo, unidades e cor e clique em avançar.

Em seguida, insira as informações de identificação sobre o assunto e a medição na caixa de diálogo de informações do arquivo e prossiga clicando em avançar novamente. Agora, a configuração está concluída e uma janela de medição aparecerá. Em seguida, avance manualmente o eletrodo até um milímetro do pâncreas.

A precisão da medição está relacionada à distância entre a sonda e o tecido das ilhotas pancreáticas. A leitura do fluxo sanguíneo será imprecisa, a menos que um milímetro entre os tecidos e a sonda seja cuidadosamente respeitado. Para iniciar a gravação, clique no ícone Iniciar e os dados de PU do sangue microvascular começarão a ser salvos.

Faça isso por um minuto inteiro e use os botões de exibição de compactação e expansão e os botões de aumentar ou diminuir a altura dos traços gráficos para ajustar o efeito exibido durante a gravação e, em seguida, pare a gravação. Em seguida, salve o arquivo com um nome apropriado. Agora, reposicione manualmente a sonda para evitar efeitos aditivos e exaustão localizada da capacidade contrátil e de relaxamento.

Ao todo, colete dados de PU de três pontos aleatórios no pâncreas para cada camundongo. Em algum momento durante o experimento, meça os dados de PU de uma placa não reflexiva para obter um valor de controle de linha de base. Depois de fazer as três medições, use suturas de três oh para fechar as camadas musculares e, em seguida, suturas de quatro oh para fechar a camada da pele.

Agora monitore o mouse em uma gaiola de recuperação até que ele esteja pronto para ser transferido para uma gaiola doméstica limpa. Em geral, a condição microcirculatória da ilhota pancreática é representada por fases periódicas de contração e relaxamento. O fenômeno hemodinâmico geral cria um padrão de perfusão do fluxo sanguíneo.

Utilizando o aparelho de laser doppler, foram coletados dados de UP para mostrar o padrão de distribuição da perfusão sanguínea microvascular em camundongos não diabéticos e diabéticos. Os resultados foram totalmente diferentes. O ritmo de contrações e relaxamentos da vasomotricidade microvascular das ilhotas pancreáticas foi caótico e irregular em camundongos diabéticos induzidos por STZ, enquanto os controles não diabéticos apresentaram oscilações rítmicas.

Em seguida, a vasomoção foi quantificada usando perfis de UP. Em comparação com os controles, a perfusão sanguínea média da microcirculação das ilhotas pancreáticas diminuiu em camundongos diabéticos induzidos por STZ. Esses camundongos também mostraram reduções significativas na amplitude e frequência desse vasomovimento, bem como na velocidade relativa de perfusão sanguínea para a ilhota pancreática.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que a distância entre a sonda e o tecido do pâncreas esteja dentro de um milímetro. Uma distância inadequada dá uma leitura de fluxo sanguíneo artificialmente aumentada ou diminuída.

Após este procedimento, outros métodos, como speckle a laser e translocação de oxigênio, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como visualização de isquemia, avaliação do fluxo sanguíneo, avaliação do estado funcional da vasomotricidade microvascular. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores e clínicos no campo da endocrinologia e metabolismo explorarem os mecanismos microcirculatórios ocultos por trás das doenças relacionadas às ilhotas pancreáticas. Não se esqueça de que trabalhar com um instrumento a laser pode ser extremamente perigoso devido à exposição à radiação e precauções como o lado do ambiente a pelo menos 200 milímetros do olho devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.