Name: Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a induzir obesidade em Drosophila melanogaster com dieta rica em gordura e meça triacilgliceróis em alta vazão. Este método acelera descobertas sobre lipotoxicidade e doenças metabólicas.

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Gostaríamos de agradecer a Erika Taylor para edição deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por subvenções provenientes do National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) de R.B., um suplemento de investigação pós-doutoramento (R01 HL085481) e companheirismo (AAUW) para S.B.D., concessões e da associação americana do coração para S.B.D. e RGB

1. HFD alimentação protocolo <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> tabela 1. Receita de comida de mosca. 
Esta tabela resume os diferentes ingredientes usados para preparar nosso controle alimentar. Uma vez feita, 10 mL do alimento é vertido em frascos, refrigerado e estocado a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
<ol><li>Preparação HFD <ol><li>para fazer 1 kg de alimento gordo alto, pesa 700 g de comida de mosca normal pre-feita (ver tabela 1) e 300 g de óleo de coco em dois recipientes separados usando uma balança analítica.</li>
		<li>Calor cada recipiente individualmente no microondas, até que o conteúdo derrete completamente. Despeje o óleo de coco o recipiente de alimento de voar. Mexa com um batedor até que o óleo é bem misturado a comida da mosca. 
		Nota: Não há pedaços de comida ou óleo devem ser visíveis. Quando a comida de mosca está derretendo no microondas, parar em intervalos de 1 minuto para misturar os alimentos e evitar ferver.</li>
		<li>Re-pesar o alimento de gordura alto. Se o peso total é inferior a 1 kg (700 g de comida + 300 g de óleo de coco), adicionar água (cerca de 10 mL) para compensar a evaporação durante o aquecimento e para trazer de volta o peso de 1 kg...</li>
		<li>Pour cerca de 10 mL bem misturado alta gordura comida por frasco (cerca de 25% do volume do frasco). Em seguida, cubra com gaze para evitar moscas &#39; contaminação. Deixe esfriar por 1h à temperatura ambiente, em seguida, transferir os frascos a 4 ° C para armazenamento acima de 4 semanas. 
		Nota: A comida Normal (NF) é usada como um alimento de controle. Também despeje 10 mL (cerca de 25% do volume do frasco) de NF por frasco. Para a comida HFD, substitua 30% da comida NF com óleo de coco. Para controle e condições experimentais, as moscas receberam a mesma quantidade de NF e HFD (10ml de comida por frasco).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Figura 1 . HFD alimentação em Drosophila. 
O esquema mostra as diferentes etapas de alimentação para as moscas em um alimento de controle (dieta normal sem adição de óleo de coco-NF) ou HFD (com a adição de óleo de coco). O processo todo leva 10 dias após a coleta inicial de moscas adultas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"> <li>HFD alimentação de d. melanogaster Nota: Este protocolo inclui controle alimentar e HFD alimentando os procedimentos que são compatíveis com qualquer linha de voar. Controle e experimentais moscas são colocadas em frascos contendo a mesma comida de quantidade (NF ou HFD).
	<ol><li>Uso de CO 2 para anestesiar moscas. 
		Nota: Para os neófitos, por favor leia referência 21 para uma visão geral sobre criação e manipulação de d. melanogaster.</li>
		<li>Recolher 0-5 moscas dia velho de frascos e transferência (lançando) as moscas em novos frascos contendo NF (previamente aquecido à temperatura ambiente). Deixe a idade de moscas por 5 dias adicionais no 21 ° C.</li>
		<li>No final dos 5 dias, retire os frascos que contêm HFD e NF de 4 ° C. 
		Nota: como temperaturas frias podem salientar vivos moscas, deixe os frascos descansar por 30 min à temperatura ambiente para se aquecer antes de usar.</li>
		<li>Usando lenços, limpar e remover o excesso de líquido dos lados dos frascos.</li>
		<li>Inserir um pequeno pedaço de papel de filtro, sobre 1 cm x 3 cm, a comida da alta gorda para absorver todo o líquido excedente. 
		Nota: Este passo é essencial para prevenir as moscas de degola para a comida HFD.</li>
		<li>Em seguida, transferir as moscas sobre os alimentos de alta gordura (lançando). Colocar os frascos horizontalmente do lado deles, (não permanente) em 21-22 ° C durante 5 dias. 
		Nota: Evite temperaturas mais altas, como isto pode parcialmente derreter a comida gorda alta, fazendo com que as moscas manter os alimentos e morrer.</li>
		<li>Depois de 5 dias, transferir (lançando) as moscas de NF e HFD dentro dos frascos de novos sem comida para permitir que a sua coragem de vazio durante 30 min. Em seguida, proceder à pesagem moscas. 
		Nota: Uma das etapas críticas neste HFD protocolo de alimentação é preparar um HFD bem misturado, livre de quaisquer pedaços de comida de mosca ou óleo condensado. Mistura homogênea e refrigerar o HFD 45-30 ° c é aconselhável, antes de derramar dentro dos frascos e armazenar os alimentos na idade adequada de 4 ° C. correspondência de controle e experimentais moscas é importante, assim como prior de condições nutricionais e ambientais controladas para a alimentação de HFD. Durante a fase de alimentação, controle e experimentais moscas devem ser dada a mesma quantidade de NF e HFD. Nunca colete moscas de superlotadas frascos ou garrafas (para evitar efeitos de transgeracional). Sempre coloque um máximo de 25 moscas por frasco durante NF e HFD alimentação para evitar restrição dietética ou outros efeitos crowding. O HFD é composto de 30% de óleo de coco, assim, temperaturas acima de 22 ° C parcialmente podem derreter o HFD, fazendo com que as moscas enfiar a comida oleosa e morrer. Antes de colocar as moscas o HFD, limpe os frascos para remover qualquer resíduo de óleo e inserir um filtro de papel para absorver qualquer excesso de líquido no alimento. Durante a incubação das moscas em HFD, os frascos são colocados em seus lados para fornecer uma superfície horizontal sem gordura para as moscas.</li>
	</ol></li> <li>Pesando as moscas <ol><li>para cada genótipo e gênero a ser testado, usar uma escala ultra sensível para registrar os pesos de tubos de vazio, previamente rotulado 1,7 mL.</li>
		<li>Usando anestésico voar ou CO 2, anestesiar e recolher 36 moscas com o mesmo genótipo, sexo, e alimentar o status com um pincel em um pre-pesava 1.7 tubo mL.</li>
		<li>Pesa o tubo contendo moscas com a mesma escala ultra-sensíveis.</li>
		<li>Determinar o peso médio de voar esta fórmula a seguir: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Nota: O número de moscas neste protocolo é 36.</li>
		<li>Flash congela os tubos de 1,7 mL contendo moscas por mergulhar no nitrogênio líquido por 2 min. coletar e colocar os tubos em caixas. Em seguida, transferir as caixas a-80 ° C (temperatura preferível) para o armazenamento até o uso com o ensaio de TAG. 
		Atenção: O nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa. Por favor, use equipamento de proteção pessoal apropriado.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG ensaio <ol><li>preparação das concentrações padrão TAG <ol><li>preparar 500 mL de PBT (PBS 1x, 0.05% Triton).</li>
		<li>Usando tubos de 0,5 mL e a solução de TAG (Tabela de materiais), preparam-se 100 µ l de espaço em branco (apenas PBT) e 100 µ l de seis concentrações de TAG padrão (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0,125 µ g / µ l; 0.0625 µ g / µ l) com o PBT.</li>
		<li>Coloque os tubos no gelo e prosseguir com as moscas de moedura.</li>
	</ol></li> <li>Moagem as moscas <ol><li>tirar as moscas congeladas de-80 ° C (etapa 1.3). Transferir os tubos contendo as moscas no gelo</li>
		<li>Primeiro, coloque o metal de 2 milímetros, bolas de moagem em um dispensador de bola 96 poços, use um pincel pequeno para remover bolas extras.</li>
		Placa de <li>lugar da moagem de 96 poços de cabeça para baixo em cima do dispensador de bola e flip transferir as bolas de metal directamente para a placa de moedura. Deve haver uma bola por alvéolo.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicionar 600 µ l de PBT em cada linha da placa de 96 poços moedura.</li>
		<li>Com fórceps, adicionar 3 voa por bem. Indicar a condição de genótipo, sexo e comida das moscas em cada linha/poço da placa de 96 poços moedura.</li>
		<li>Firmemente Coloque as tampas para a placa de moedura de 96 poços. Fita pode ser colocada na parte superior para assegurar que não há nenhum escapamento.</li>
		<li>, Corretamente, colocar as placas de 96 poços moagem para a máquina de moer. Ajuste a máquina para a velocidade mais alta e pressione &#34; executar &#34; para moer as moscas por 3 min.</li>
		<li>Após 3 min, parar a moagem e proceder com centrifugação de placa: centrifuGE para 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Após a centrifugação, gerenciar a placa de moedura cuidadosamente para evitar misturar o sobrenadante com a pelota.</li>
	</ol></li> <li>Carregamento de amostra e determinação de conteúdo de TAG <ol><li>tomar uma nova placa de 96 poços Espectrofotômetro. Usando uma pipeta multicanal, carregar 200 µ l de reagente a TAG em cada linha da placa.</li>
		<li>Carga 20 µ l de PBT dentro do primeiro poço da primeira linha, para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		Poços de <li>carga 20 µ l de cada diluição padrão (da etapa 2.1.2) para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, transferência de 20 µ l do sobrenadante de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços Espectrofotômetro. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Em seguida, coloque uma folha de gás-permeável sobre a parte superior da placa de 96 poços.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 ° C durante 10 min. 
		Nota: Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para remover todas as bolhas. A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância.</li>
		<li>Leia a absorvância de cada poço da placa em 550 nm, utilizando um leitor de microplacas compatível. Em seguida, traçar a curva-padrão e determinar a concentração [µ g / µ l] das amostras desconhecidas.</li>
		<li>Para determinar a quantidade de conteúdo da marca por médio peso mosca, use a seguinte fórmula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Nota: neste protocolo, 3 moscas foram picadas em 600 µ l de PBT; em consequência, o volume médio por mosca é 200 µ l.</li>
	</ol></li> <li>Ensaio de Bradford e normalização de conteúdo da marca com conteúdo de proteína <ol><li>preparar sete 100 µ l de albumina de soro bovino (BSA) padrão diluições (75 µ g/mL; 100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) com o PBT.</li>
		<li>Tomar uma nova placa de 96 poços e carregar 200 µ l de reagente de Bradford X 1 em cada linha da placa.</li>
		<li>No primeiro bem de primeira linha, adicionar 10 µ l de PBT para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		Poços de <li>Adicionar 10 µ l de cada diluição padrão para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, transferir 10 µ l do sobrenadante a mosca de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Colocar uma película permeável ao gás por cima da placa de 96 poços.</li>
		<li>Incube a placa na temperatura de quarto por 5 min. Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para removê-los. 
		Nota: A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância.</li>
		<li>Uso de um espectrofotômetro para ler a absorbância do branco, padrões e amostras desconhecidas em 595 nm. Use a curva padrão para determinar as concentrações [µ g / µ l] das amostras em cada linha.</li>
		<li>Normalizar a TAG conteúda com nível de proteína usando a seguinte fórmula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Indução de obesidade em ratos pode levar meses19,20. Nas moscas, este HFD alimentando o protocolo permite a indução de acúmulo de gordura em excesso em questão de dias ou menos, causando aumentos no acúmulo de gordura somente após 18 h (ver Figura 2). HFD alimentando com o protocolo descrito aumenta o conteúdo de glicose 12 e Bmm lipase e PGC-1 expressão24. Isto está em contras...

Estamos em um tempo onde a obesidade e seus associados encargos económicos, é um problema mundial1. Dois em cada três americanos estão com sobrepeso ou obesos com patologias do coração relacionadas, a principal causa de morte dentro da população adulta2. Novos métodos eficientes são necessários para investigar adequadamente os componentes genéticos e moleculares implicados na regulação da síndrome metabólica, usando organismos modelo. Por esta razão, nós escolhemos o mosca de fruta Drosophila modelo porque ele compartilha os processos biológicos mais básicos com mamíferos, incluindo ratos e seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaé altamente conservadas durante a evolução, mas no geral é muito menor com menos duplicação de genes e complexidade metabólica, tornando-a ideal para compreender os mecanismos fundamentais implicados em muitas doenças humanas4 , 7 , 8. Além disso, característico de processos realizados pelo tecido adiposo, intestino e pâncreas são representados na mosca e mediar funções reguladoras no metabolismo glicose e lipídios, por exemplo, que são semelhantes aos seres humanos9, 10,11. Além disso, as vias moleculares básicas envolvidos no controle da obesidade, resistência à insulina e diabetes em seres humanos são funcionalmente conservadas em Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tem um coração que é formado durante o desenvolvimento de processos semelhantes do coração dos mamíferos3,17. Assim, o desenvolvimento de um confiável HFD alimentação protocolo e ensaio de TAG alto throughput, adaptado para fins de triagem eficiente usando a caixa de ferramenta genética da Drosophila, fornecem um meio importante para estudar e entender a base genética fundamental doenças metabólicas complexas subjacentes.
O próprio alimento HFD é feito a partir de um alimento mosca de laboratório padrão suplementado com óleo de coco, que é composto principalmente de ácidos graxos saturados, conhecidos por ser associado com a síndrome metabólica18. Enquanto induzir obesidade em modelos de mamíferos, como roedores, pode levar meses19,20, nosso HFD otimizado protocolo de alimentação em Drosophila eficazmente e reproducibly aumenta a gordura em questão de dias12,14. Este protocolo, em conjunto com um ensaio de alto throughput TAG, permite eficiente triagem em massa para os efeitos de fatores genéticos, influências ambientais e candidatos a fármacos para descobrir novos moduladores do metabolismo das gorduras. Em consequência, estes protocolos são prováveis relevantes para entender e/ou combater a obesidade e patologias humanas associadas a obesidade.
O protocolo de alimentação é versátil e pode ser aplicado para estudar os efeitos metabólicos e funcionais do único de ácidos gordos saturados ou insaturados. O uso deste teste de TAG de alta taxa de transferência não está limitado a d. melanogaster, mas pode ser adaptado a uma variedade de organismos modelo pequeno com cutícula ou matrizes extracelulares duros (por exemplo, outras espécies de Drosophila , c. elegans e outros emergentes organismos invertebrados modelo) para medir o teor de gordura em diferentes condições ambientais, genéticas ou fisiológicas, em qualquer fase de desenvolvimento, maturidade ou fase da doença metabólica. O ensaio de TAG é baseado em uma medição colorimétrica de uma série de reações enzimáticas que degradam as TAGs em ácidos graxos livres, glicerol, o glicerol-3-fosfato e finalmente H2O2 , que reage com 4-aminoantipyrine (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (3,5 DHBS) para produzir um produto de cor vermelho que é medido utilizando um Espectrofotômetro de 96 poços.

<table><tbody><tr><td>Dispensador de Conta-gotas/Contas Talboys</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de Alto Rendimento Talboys</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Bolas de Moagem, Aço Inoxidável&nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 bolas</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Microplacas de profundidade de poço</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>caixa de 80 placas</td></tr><tr><td>Greiner&nbsp; Microplaca de 96 poços fundo plano</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 placas</td></tr><tr><td>Greiner CapMat para vedação de placas multipoços</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 placas de vedação</td></tr><tr><td>Reservatórios de Reagentes& nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipeta 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipeta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipeta 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipeta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipeta 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipeta</td></tr><tr><td>Multicanal pontas</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>para pipeta de 10 uL</td></tr><tr><td>Pontas multicanal</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>para pipeta de 200 uL</td></tr><tr><td>Pontas multicanal</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>para pipeta de 100 uL</td></tr><tr><td>Fórceps&nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Pinça super fina</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Balança Analítica Mfr# XS64</td><td>Especialistas científicos Cole-Parmer</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Balança de carregamento superior</td><td>Especialistas científicos Cole-Parmer</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de microplacas de 96 poços</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Microplaca Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td> Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x corante Reagente</td></tr><tr><td>Óleo de coco</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>frasco de 15 0z</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Folha permeável a gás</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675 50</td><td>peças</td></tr><tr><td>de papel de filtro</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Pacote de 100</td></tr><tr><td>frascos</td> <td>de DrosophilaGenesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr> Início <tr><td>Rápido Albumina de Soro Bovino Padrão</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico FlyNap</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4"</td></tr></tbody></table>

dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto throughput em drosophila melanogaster.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Doença cardíaca é a principal causa de morte humana no mundo. Numerosos estudos têm demonstrado forte ligação entre obesidade e mau funcionamento cardíaco em humanos, mas mais ferramentas e esforços de pesquisa são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Para mais de um século, o modelo geneticamente altamente tratável de Drosophila tem sido fundamental na descoberta de genes-chave e vias moleculares que provou ser altamente conservadas em toda a espécie. Muitos processos biológicos e mecanismos de doença são funcionalmente conservados na mosca, como desenvolvimento (por exemplo, plano de corpo, coração), câncer e doenças neurodegenerativas. Recentemente, o estudo da obesidade e patologias secundárias, tais como doença em organismos-modelo, tem desempenhado um papel altamente crítico na identificação dos principais reguladores envolvidos na síndrome metabólica em seres humanos.
Aqui, propomos usar esse organismo modelo como uma ferramenta eficiente para induzir a obesidade, ou seja, acumulação excessiva de gordura e desenvolver um protocolo eficiente para monitorar o teor de gordura sob a forma de acumulação de TAGs. Além de altamente conservadas, mas menos complexo genoma, a mosca também tem uma vida curta para a experimentação rápida, combinada com a relação custo-eficácia. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a alimentação de alta gordura dieta (HFD) em Drosophila para induzir a obesidade e um ensaio de triacilglicerol (TAG) de alto rendimento para medir o associado aumento no teor de gordura, com o objectivo de ser altamente reprodutível e eficiente para rastreio genético ou químico em larga escala. Estes protocolos oferecem novas oportunidades para eficientemente investigar mecanismos reguladores envolvidos na obesidade, bem como fornecer uma plataforma padronizada para a pesquisa de descoberta de drogas para testes rápidos do efeito de candidatos da droga sobre o desenvolvimento ou prevenção da obesidade, diabetes e doenças metabólicas associadas.

No d. melanogaster, como é o caso com outras espécies, existe dimorfismo sexual entre machos e fêmeas,22. É sabido que as fêmeas são maiores, com mais gordura em seus abdomens, do que os machos22. Para testar a eficácia do nosso protocolo, realizamos ensaios de TAG para determinar as diferenças de conteúdo da marca entre machos e fêmeas de sua padrão de laboratório (w1118) voa. Os dados mostram que as fêmeas têm ...

Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

O objetivo geral deste protocolo de alimentação com alta quantidade de gordura e ensaio de triacilglicerol de alto rendimento é induzir obesidade em um organismo modelo, como *Drosophila melanogaster*, e monitorar as alterações associadas no conteúdo de gordura sob uma variedade de condições. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do metabolismo, incluindo obesidade em organismos inteiros e lipotoxicidade específica de órgãos, relevante para diabetes, síndrome metabólica, esteatose hepática e cardíaca. A principal vantagem desta técnica é que o acúmulo excessivo de gordura em *Drosophila* pode ser induzido em poucos dias, e o conteúdo de gordura pode ser determinado simultaneamente em cerca de uma hora.As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico de doenças metabólicas e à sua terapia, pois o protocolo de alto rendimento permite estudos acelerados de descoberta de fármacos utilizando este sistema modelo. Para iniciar o experimento, prepare um quilograma de ração rica em gordura, pese 700 gramas de ração pré-pronta para moscas e 300 gramas de óleo de coco em dois recipientes separados utilizando uma balança analítica. Aqueça cada recipiente individualmente no micro-ondas até que o conteúdo derreta completamente.Despeje o óleo de coco derretido no recipiente de alimento para moscas e mexa o conteúdo usando um batedor até que o óleo esteja bem misturado ao alimento. Pese novamente o alimento rico em gordura. Se o peso total for inferior a um quilograma, adicione cerca de 10 mililitros de água para restabelecer o peso de um quilograma.Em seguida, despeje 10 mililitros do alimento rico em gordura bem misturado em cada frasco. Cubra o alimento com o pano de gaze para prevenir contaminação e deixe o alimento esfriar por uma hora à temperatura ambiente. Após o resfriamento, transfira os frascos para quatro graus Celsius para armazenamento por até quatro semanas.Use CO2 para anestesiar as moscas. Colete moscas com idade entre zero e cinco dias provenientes de frascos e transfira-as para novos frascos contendo alimento normal previamente aquecido ou AN. Deixe as moscas envelhecerem por mais cinco dias a 21 graus Celsius. Ao final dos cinco dias, retire os frascos contendo a dieta rica em gordura, ou DRG, e AN de quatro graus Celsius.Limpe e remova o excesso de fluido das laterais dos frascos usando lenços descartáveis para evitar que as moscas grudem na dieta rica em gordura. Insira um pequeno pedaço de papel de filtro, com aproximadamente um centímetro por três centímetros, na dieta rica em gordura para absorver qualquer líquido excedente. Em seguida, transfira as moscas para a dieta rica em gordura.Coloque os tubos horizontalmente, de lado, a 21 a 22 graus Celsius durante cinco dias. Após cinco dias, transfira as moscas das dietas NF e HFD para novos tubos sem alimento para permitir o esvaziamento do intestino por 30 minutos. Em seguida, prossiga para pesar as moscas.Para cada genótipo e sexo a ser testado, utilize uma balança ultrassensível para registrar os pesos de tubos vazios de 1,7 mililitro previamente rotulados. Anestesie e colete 36 moscas do mesmo genótipo, sexo e estado alimentar com um pincel, colocando-as em um tubo de 1,7 mililitro previamente pesado. Em seguida, pese o tubo contendo as moscas utilizando a mesma balança ultrassensível.Congele rapidamente os tubos de 1,7 mililitro contendo moscas, mergulhando-os em nitrogênio líquido por dois minutos. Colete os tubos e coloque-os em caixas. Em seguida, transfira as caixas para um congelador a menos 80 graus Celsius para armazenamento até o uso com o ensaio TAG.Primeiro, retire as moscas congeladas do freezer a -80 graus Celsius e coloque os tubos sobre gelo. Coloque bolas de moagem de metal de dois milímetros em um dispensador de bolas de 96 poços e use um pincel pequeno para remover as bolas extras. Em seguida, posicione a placa de moagem de 96 poços virada para baixo sobre o dispensador de bolas e vire o conjunto para transferir diretamente as bolas de metal para a placa de moagem.Certifique-se de que haja uma bola por poço. Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 600 microlitros de PBT em cada linha da placa de moagem de 96 poços. Com pinça, adicione três moscas por poço.Indique o genótipo, o sexo e a condição alimentar das moscas em cada linha ou poço da placa de moagem de 96 poços. Coloque firmemente as tampas sobre a placa de moagem de 96 poços. Aplique fita adesiva na parte superior para garantir que não haja vazamento.Posicione corretamente as placas de 96 poços para moagem na máquina de moagem. Ajuste a máquina para a velocidade mais alta e pressione iniciar para moer as moscas por três minutos. Após três minutos, interrompa a moagem e prossiga com a centrifugação.Após a centrifugação, manipule a placa de moagem com cuidado para evitar a mistura do sobrenadante com o precipitado. Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 microlitros do reagente TAG em cada linha de uma nova placa espectrofotométrica de 96 poços. Adicione 20 microlitros de PBT no primeiro poço da primeira linha para criar uma prova em branco.Misture aspirando e dispensando com a pipeta. Adicione 20 microlitros de cada diluição padrão nas poças restantes da primeira linha e misture aspirando e dispensando com a pipeta. Usando uma pipeta multicanal, transfira 20 microlitros de sobrenadante de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente na placa de 96 poços para espectrofotômetro.Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Em seguida, coloque uma fita permeável a gases sobre a parte superior da placa de 96 poços. Incube a placa a 37 graus celsius por dez minutos.Leia a absorbância de cada poço da placa em 550 nanômetros utilizando um leitor de microplacas compatível. Ensaios de TAG em moscas selvagens padrão de laboratório mostram que fêmeas possuem mais gordura corporal total do que seus equivalentes machos. Os dados também demonstraram que o ensaio é estável, sem variação na quantificação de TAG ao longo do tempo e sem variação dependente do tamanho da amostra biológica.Ensaios de marcação de dieta rica em gordura, ou DRG, e moscas fêmeas alimentadas com dieta controle revelaram que o consumo de DRG em drosófila causa aumento do conteúdo lipídico que se acumula progressivamente ao longo do tempo. Após apenas 18 horas de alimentação com DRG, observou-se um aumento significativo do conteúdo lipídico nas moscas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de utilizar frascos bem limpos para a alimentação com dieta rica em gordura.Armazene as moscas a 22 graus ou abaixo, e também não misture o sobrenadante com os detritos durante a pipetagem no ensaio de marcação. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam o metabolismo e doenças associadas explorarem o efeito do excesso de nutrientes e a base genética do acúmulo de gordura e disfunção orgânica associada, como a cardiomiopatia lipotóxica em drosófila.

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Nós apresentamos robustos métodos bioquímicos e microscópicos para...

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo descreve um ensaio de alto rendimento para testar as preferências de postura de ovos de Drosophila melanogaster em resolução de um único animal.  Este ensaio fornece uma plataforma simples, eficiente e escalável para identificar genes e componentes de circuitos que controlam um processo simples de tomada de decisão.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O peixe-zebra está emergindo como um modelo valioso de processamento de lipídios na dieta e doenças metabólicas. São descritos protocolos de alimentação de larvas ricas em lipídios, imagens ao vivo de análogos lipídicos fluorescentes da dieta e quantificação da ingestão de alimentos. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma variedade de técnicas de triagem, imagem e investigação orientada por hipóteses.

Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

Aqui apresentamos um método para medir os níveis de gordura organismais no terceiro estádio (L3) fase larval de Drosophila melanogaster. Este método explora a relativamente baixa densidade de tecido adiposo para diferenciar entre as larvas com reservas de gordura alterados. A análise à base de empuxo é uma valiosa ferramenta para a triagem rápida, reprodutível e econômico.

Um método baseado em flutuabilidade da determinação dos níveis de gordura no<em&gt; Drosophila</em

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

A TreadWheel usa movimento rotacional para suavemente induzir exercício em adultos Drosophila melanogaster explorando geotaxis de inata, negativo dos moscas. Permite a análise das interações entre o exercício e fatores, tais como o genótipo, sexo e dieta e seus efeitos em ensaios fisiológicos e moleculares para avaliar a saúde metabólica.

A TreadWheel: Protocolo de treinamento de intervalo para suavemente induzido por exercício em Drosophila melanogaster.

Descrito aqui é um protocolo que permite a quantificação colorimétrica da quantidade de alimentos comidos dentro de um intervalo definido de tempo por larvas de melanogaster Drosophila expostas a dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Esses ensaios são conduzidos no contexto de uma tela termogenética neuronal.

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Apresentamos um protocolo para um ensaio de alimentação de duas opções para moscas. Este ensaio de alimentação é rápido e fácil de executar e é adequado não apenas para pesquisas de laboratório de pequena escala, mas também para telas comportamentais de alto rendimento em moscas.

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

O ensaio alimentador de microplacos oferece um método econômico de alta produtividade para quantificar o consumo de alimentos líquidos em Drosophila. Um dispositivo impresso em 3D conecta uma microplaca de 96 poços na qual as moscas estão alojadas em uma microplaca de 1536 poços da qual as moscas consomem uma solução de alimentação com um corante rastreador. O declínio do volume da solução é medido espectrofotometricamente.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Aprenda a induzir obesidade em Drosophila melanogaster com dieta rica em gordura e meça triacilgliceróis em alta vazão. Este método acelera descobertas sobre lipotoxicidade e doenças metabólicas.

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

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