Name: Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a analisar interações ARN-proteína usando eletroforese horizontal em gel nativo de poliacrilamida. Este método permite monitorar a formação de complexos em tempo real durante a eletroforese, oferecendo vantagens sobre géis verticais tradicionais.

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Agradecemos a Laura Vanderploeg pela preparação de números. O trabalho no laboratório Sheets é suportado pela subvenção NSF 1050395 e pela concessão NIH (R21HD076828). O trabalho no laboratório Ryder é suportado por concessões do NIH R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle é apoiada por uma Bolsa de Oportunidades Avançadas da SciMed GRS através da Escola de Pós-Graduação da Universidade de Wisconsin-Madison e do Programa de Treinamento em Biotecnologia através do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (T32GM008349).

1. Preparação do Gel de Poliacrilamida Nativo Horizontal 4 . <ol><li> Preparação dos materiais necessários. <ol><li> Para o aparelho de gel horizontal, use uma caixa de gel (37 cm x 24 cm) com uma bandeja de 27 cm x 21 cm e uma capacidade para dois pentes de 24 poços. Esta configuração fornece um total de 48 amostras que podem ser analisadas simultaneamente. </li><li> Prepare os seguintes reagentes: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (persulfato de amônio). </li></ol></li><li> Geração de um gel de acrilamida nativo a 10%. <ol><li> Num balão de 500 mL, adicione 80 mL de TBE 5x, 100 mL de acrilamida a 40% e água até um volume final de 400 mL. </li><li> Adicione 4 mL de APS a 10% e 400 μL de TEMED. Misture bem. </li><li> Despeje a mistura na bandeja de fundição horizontal e deixe o gel polimerizar por 30 min. O gel terá aproximadamente 2 cm de espessura. NOTA: Os géis podem lançar uma exaustão para acelerarAté a polimerização. Após a polimerização, uma fina camada de líquido permanecerá no topo do gel. </li><li> Despeje o líquido e lave com tampão corrente. Remova o (s) pente (s) com cuidado e enxágue os poços com tampão corrente usando uma seringa. </li></ol></li><li> Preparação do buffer de operação. <ol><li> Prepare 2 L de buffer de corrida 1x TBE para a caixa de gel. Diluir 400 mL de 5XTBE com 1600 mL e misturar. Coloque 1x tampão TBE na sala fria para esfriar. </li></ol></li><li> Pre-Running the gel <ol><li> Adicione 2 L de tampão de funcionamento a frio na caixa de gel e insira o gel. </li><li> Antes de executar o gel a 120 V por 1 h a 4 ° C em uma sala fria. Durante esse período, prepare a reação de ligação. </li></ol></li></ol> 2. Reação de encadernação 8 <ol><li> 2.1.Prepare os seguintes componentes de reação. DTT 20 mM BSA 10 mM TRNAs de levedura 10 mM Tampão de ligação 5X (HEPES 50 mM pH 8,0, EDTA 5 mM, 25KCl 0 mM, Tween-20 a 0,2%) RNA marcado com fluoresceína 100 nM adquirido comercialmente Proteína Bicaudal-C concentrada 50% de glicerol em H 2 O tratado com DEPC H 2 O tratado com DEPC </li><li> Monte os componentes de reação de ligação em um tubo de microcentrífuga sem RNase. <ol><li> Ao tubo, adicione 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL de tRNAs de levedura 10 mM, 10 μL de tampão de ligação 5x. </li></ol></li><li> Adicionar proteína a uma concentração final de 250 nM em 50 μL. Adicione água a um volume final de 45 μL. </li><li> Adicione 5 μL de substrato de ARN marcado fluorescentemente. Use um substrato de 32-nucleotídeos marcado com fluoresceína de 3 &#39;adquirido comercialmente. </li><li> Misturar e incubar no escuro durante 30 min à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Análise de Amostras no Gel Nativo de Poliacrilamida Horizontal <ol><li> A cada reação, adicione 15 μL de glicerol a 50% e misture suavemente. </li><li> CarefuAdicione 30 μL de cada reacção ao gel. A quantidade de amostra que pode ser carregada num único poço varia dependendo da espessura do gel e do tamanho dos poços. Carregamos volumes tão pequenos quanto 15 μL e até 45 μL em um único poço de géis criados com um pente de 24 po e despejados até uma espessura de 2 cm. </li><li> Depois de conectar a fonte de alimentação ao aparelho de gel, ligue a alimentação e ajuste a tensão. Execute o gel a 4 ° C a 120 V. NOTA: Para o aparelho de gel horizontal, isso acaba sendo de aproximadamente 5 V / cm. Para o aparelho de gel vertical, isto é 16 V / cm. <ol><li> Para evitar danos ou branqueamento do ARN marcado de forma fluorescente, realize eletroforese no escuro. </li><li> Vários tempos de eletroforese dependendo dos detalhes do complexo RNA-proteína que está sendo analisado. NOTA: Uma grande vantagem da análise EMSA horizontal é que a eletroforese pode ser interrompida, a imagem em gel e depois a gePosso voltar para o aparelho e a eletroforese pode continuar por tempos mais longos. </li></ol></li></ol> 4. Imaging the Gel <ol><li> Execute análise com qualquer instrumento projetado para detecção e imagens de substratos fluorescentes. </li><li> Coloque o gel na imagem. </li><li> Ajuste as configurações da imagem. Para os ligandos de ARN marcados com fluoresceína, use as seguintes configurações: FAM (comprimento de onda 473 nm), 750 Tensão de fotomultiplicador (PMT), tamanho de pixel de 100 μm. </li><li> Digitalize o gel para capturar a imagem. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os géis nativos de poliacrilamida são uma ferramenta inestimável para investigar as interações proteína-ARN e, tradicionalmente, esses géis são submetidos a eletroforese verticalmente 2 , 3 . Utilizamos uma modificação do protocolo que substitui géis de poliacrilamida nativos criados e submetidos a eletroforese horizontalmente 1 , 4 , 6 , 7<...

Os ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs) provaram ser uma ferramenta bioquímica inestimável para analisar as interações específicas de proteína-nucleico 1 , 2 , 3 . Esses ensaios podem fornecer informações importantes sobre a afinidade de ligação das proteínas ao RNA ou DNA 3 , a estequiometria componente dos complexos de ácido nucleico-proteína 1 e fornecem novos pontos de vista importantes sobre a especificidade de ligação das proteínas de ligação de ARN através de experiências de competição de substrato 1 . A configuração experimental tradicional para estes ensaios consiste em misturar a proteína purificada com um substrato de ARN radiomarcado. Os complexos resultantes são então analisados ​​com géis de poliacrilamida não desnaturantes (nativos) vertidos entre duas placas de vidro seguidas por eletroforese de amostra num aparelho vertical 3. Embora esta abordagem tenha sido utilizada de forma exaustiva para fornecer informações importantes sobre os mecanismos bioquímicos subjacentes à ligação das proteínas aos ácidos nucleicos, ela também possui várias limitações. Por exemplo, esta estratégia básica tem um rendimento relativamente baixo e não é facilmente adaptável para aplicações que exigem a análise de muitas reações vinculativas em paralelo. Além disso, com o aparelho vertical tradicional, é desafiador monitorizar complexos em várias ocasiões durante a eletroforese 3 , 4 . Aqui apresentamos uma adaptação do ensaio EMSA que utiliza géis nativos de poliacrilamida em um aparelho de platina, eletroforese horizontal e substratos de ARN marcados fluorescentemente 4 , 5 , 6 , 7 . A incorporação dessas modificações relativamente simples ao nível básicoTegy oferece algumas vantagens poderosas. Em particular, o formato de plataforma horizontal facilmente se presta a analisar dúzias de amostras simultaneamente 4 . Além disso, para alguns complexos de RNA-proteína, tais como aqueles formados entre a proteína Bicaudal-C e sua eletroforese de substrato de ARN em um gel horizontal, proporciona uma capacidade aumentada para resolver complexos distintos de proteína RNA e discriminar estes de substrato de ARN não ligado.

<table><tbody><tr><td>Caixa de Gel Horizontal</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Produto não é mais fabricado. Caixas de gel semelhantes podem ser encontradas na Thermo Scientific, caixas de gel da série A. Número de catálogo: A2-BP</td></tr><tr><td>24 poços grandes grandes pentes horizontais de eletroforese</td><td>em gel OWL</td><td>N/A</td><td>Produto não mais fabricado. Caixas de gel semelhantes podem ser encontradas na Thermo Scientific, pentes de caixa de gel da série A. Número de catálogo: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Célula de eletroforese</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrilamida / Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>tRNAs de levedura</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína marcada RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>O pedido pode ser feito sob medida para o comprimento e a sequência desejada Hidrato</td></tr><tr>de<td>sal tetrassódico EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapuro</td><td>US Biológico</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de arn-proteína

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental da biologia molecular que tem sido amplamente utilizada para a análise bioquímica das interações RNA-proteína. Essas interações foram tradicionalmente analisadas com géis de poliacrilamida gerados entre duas placas de vidro e amostras submetidas a eletroforese verticalmente. No entanto, os géis de poliacrilamida moldados em bandejas e submetidos a electroforese horizontalmente oferecem várias vantagens. Por exemplo, géis horizontais utilizados para analisar complexos entre substratos de ARN fluorescentes e proteínas específicas podem ser imaginados várias vezes à medida que a eletroforese progride. Isso proporciona a oportunidade única de monitorar complexos de RNA-proteína em vários pontos durante o experimento. Além disso, a eletroforese horizontal em gel possibilita analisar muitas amostras em paralelo. Isso pode facilitar muito as experiências de tempo, bem como analisar várias reações simultaneamente para comparar diferentes componentes e condições. Aqui nós prUm protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal para analisar as interações RNA-Proteína.

Para demonstrar o poder e a versatilidade da eletroforese em gel nativo horizontal, analisamos a ligação da proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a um ARN marcado fluorescentemente contendo um local de ligação Bicc1. As proteínas Bicc1 funcionam como repressores translacionais específicos de mRNA para controlar as decisões do destino das células durante os estádios maternos do desenvolvimento animal 9 , 10 , <su...

A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

O objetivo geral deste protocolo é analisar interações entre RNA e proteínas utilizando eletroforese nativa horizontal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na bioquímica de RNA, como definir as características de interações específicas entre RNA e proteínas. A principal vantagem desta técnica é que permite monitorar a formação de complexos múltiplas vezes durante a eletroforese.Para o aparelho de eletroforese horizontal, utilize uma cuba com bandeja de vazamento de 27 centímetros por 21 centímetros e capacidade para dois pentes de 24 poços. Esta configuração permite analisar simultaneamente um total de 48 amostras. Prepare dois litros de tampão de eletroforese 1x TBE diluindo 400 mililitros de TBE 5x com 1.600 mililitros de água e misturando bem.Coloque o tampão TBE na câmara fria para resfriar. Prepare os seguintes reagentes seguindo procedimentos padrão: acrilamida 40% melhor 19:1, TBE 5x, temed e sulfato de amônio a 10%. Para preparar um gel de acrilamida nativo a 10%, adicione o seguinte a um frasco de 500 mililitros: 80 mililitros de TBE 5x, 100 mililitros de acrilamida 40% e água até um volume final de 400 mililitros.Adicione quatro mililitros de persulfato de amônio a 10% e 400 microlitros de TEMED e misture bem. Despeje a mistura na bandeja horizontal de moldagem e deixe o gel polimerizar na capela por 30 minutos. O gel polimerizado terá aproximadamente dois centímetros de espessura e uma fina camada de líquido permanecerá na superfície do gel.Coloque o gel na cuba e leve-a para a câmara fria. Em seguida, despeje o líquido e enxágue com tampão de eletroforese em movimento. Remova os pentes cuidadosamente, adicione dois litros de tampão de eletroforese frio à cuba e, em seguida, use uma seringa para enxaguar os poços com tampão de eletroforese.Execute o gel prévio a 120 volts por uma hora a quatro graus Celsius em uma câmara fria. Enquanto o gel estiver sendo executado previamente, prepare as reações de ligação. Adicione os seguintes componentes da reação de ligação a cada tubo microcentrífugo livre de RNA nesta ordem: cinco microlitros de BSA 10 milimolar, cinco microlitros de DTT 20 milimolar, cinco microlitros de tRNAs de levedura 10 milimolar, 10 microlitros de tampão de ligação 5x, proteína bicaudal-c até uma concentração final de 250 nanomolar em 50 microlitros, água tratada com DEPC até um volume final de 45 microlitros e cinco microlitros de substrato de RNA marcado fluorescentemente.Feche os tubos e agite suavemente para misturar, centrifugue brevemente os tubos e incube no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Quando as reações de ligação estiverem concluídas, adicione 15 microlitros de glicerol a 50% em cada reação e misture suavemente. Carregue cuidadosamente 30 microlitros de cada reação nos poços do gel; a quantidade de amostra que pode ser carregada em um único poço varia conforme a espessura do gel e o tamanho dos poços.Ligue a fonte de alimentação ao aparelho de eletroforese em gel, ligue a energia, ajuste a voltagem para 120 volts e realize a eletroforese a quatro graus Celsius. Para evitar danos ou descoloração do RNA marcado com fluorescência, realize a eletroforese no escuro. Os tempos de eletroforese variarão conforme as características específicas do complexo proteína-RNA que está sendo analisado.Uma grande vantagem da análise do ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética horizontal é que a eletroforese pode ser interrompida no gel antes da conclusão da corrida. Realize a análise com qualquer instrumento projetado para detectar substratos fluorescentes em imagens. Ajuste as configurações do sistema de imagem; para ligantes marcados com fluorescência, utilize as seguintes configurações.Comprimento de onda da fluoresceína de 473 nanômetros, tensão do fotomultiplicador de 750 volts e tamanho do pixel de 100 micrômetros. Digitalize o gel para capturar a imagem. Após a aquisição da imagem, o gel pode ser recolocado no aparelho e a eletroforese pode ser continuada por períodos mais longos.A ligação da proteína xenopus bicaudal-C ou Bicc1 a um RNA mensageiro do Cripto1 marcado com fluoróforo e contendo um sítio de ligação para Bicc1 foi analisada por eletroforese nativa vertical e horizontal. Como controle negativo, Bicc1 foi misturado com um RNA marcado com fluoróforo derivado do RNA mensageiro da CiclinaB1. Ficou claramente evidente, utilizando qualquer um dos métodos, que Bicc1 se liga ao RNA do Cripto1 e forma um complexo específico. No entanto, os complexos de Bicc1 e Cripto1 foram significativamente mais distintos quando analisados com o gel horizontal, facilitando sua detecção e permitindo a discriminação entre complexos proteína-RNA e RNA não ligado.Após a aquisição de imagem, o gel foi retornado ao aparelho de eletroforese, submetido à eletroforese por mais três horas e meia e reimagem. Como mostrado aqui, os complexos tinham migrado mais e ainda eram facilmente detectáveis, indicando sua estabilidade. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro a cinco horas, se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar interações entre RNA e proteínas utilizando eletroforese nativa em gel horizontal.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fonte: Stenum, T. S., et al. Quantificação da abundância e dos níveis de carga dos RNAs de transferência em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso da eletroforese em gel e do blot do norte para detectar e comparar os níveis de carga dos RNAs de transferência em E. coli , separando formas aminoaciladas e desaciladas.

Eletroforese em gel e Northern Blotting para detectar níveis de carga de tRNA em E. coli

Este vídeo demonstra uma técnica de separação desnaturante baseada em poliacrilamida para proteínas. Essa técnica auxilia na identificação preliminar de proteínas com base em seus pesos moleculares.

Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio para análise de proteínas: uma técnica para separar e visualizar proteínas com base no peso molecular

Neste vídeo, demonstramos um método de eletroforese em gel bidimensional que separa proteínas individuais de uma mistura complexa de proteínas obtida de tecidos tumorais de adenoma hipofisário humano não funcional (NFPA). As proteínas são separadas com base em sua carga elétrica na primeira dimensão e posteriormente separadas com base em pesos moleculares na segunda dimensão.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética para detectar interações proteína-DNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência infravermelha. Quando a proteína se liga à sonda de DNA, ela forma um grande complexo que migra lentamente e aparece como uma banda deslocada no gel.

Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética para Detecção de Complexos de Fator de Transcrição-DNA

Aqui apresentamos um protocolo para analisar as interações RNA/proteína. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) é baseado na migração diferencial de complexos de RNA/proteína e RNA livre durante a eletroforese em gel nativo. Usando uma sonda de RNA radiomarcada, os complexos RNA/proteína podem ser visualizados por autorradiografia.

Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Nós relatamos os protocolos para a síntese e purificação de oligômeros de peptídeo ácido nucleico (PNA) incorporando modificado de resíduos. São descritos os métodos bioquímicos e biofísicos para a caracterização do reconhecimento dos duplex RNA pelas PNAs modificados.

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

Um protocolo para perfis metabólicos de amostras biológicas por capilar espectrometria de eletroforese em massa usando um design de interface ponta porosa sheathless é apresentado.

Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

Este artigo descreve um protocolo simples e rápido para avaliar o estado oligomérico da proteína GTPase MxA semelhante à dinamina de lisados de células humanas usando uma combinação de PAGE não desnaturante com análise de western blot.

Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Aprenda a analisar interações ARN-proteína usando eletroforese horizontal em gel nativo de poliacrilamida. Este método permite monitorar a formação de complexos em tempo real durante a eletroforese, oferecendo vantagens sobre géis verticais tradicionais.

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

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