Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste protocolo é avaliar quantitativamente o efeito dos ambientes de alta salinidade e da assimetria da solução transmembrana encontrados em condições fisiológicas nos estados de fase da membrana. As soluções dentro e fora das células são muito diferentes. Nossos métodos ajudam a entender o efeito da assimetria da solução nas propriedades da membrana e no comportamento da fase.

A principal vantagem de nossa abordagem é que as vesículas podem ser preparadas em condições de tampão fisiológico e o dispositivo microfluídico pode ser usado para criar condições de tampão assimétricas. Para iniciar o procedimento, torne áspero um lado de uma placa de PTFE com uma lixa fina. Lave o prato, um frasco de vidro de 15 mililitros e um recipiente de vidro lacrado com detergente comercial, etanol e clorofórmio.

Use uma seringa de vidro de 25 microlitros para depositar 10 a 15 microlitros de estoque de lipídios em clorofórmio no lado áspero da placa de PTFE limpa e seca. Espalhe o estoque de lipídios com a agulha da seringa para criar um filme lipídico uniforme. Use uma pinça para transferir a placa para o frasco de 15 mililitros.

Aqueça a placa a 60 graus Celsius e seque por duas horas para evaporar o solvente. Em seguida, adicione água deionizada a um recipiente de vidro a uma altura de cerca de um centímetro. Coloque o frasco para injetáveis com a placa no recipiente, certificando-se de que permanece estável e na vertical e feche o recipiente.

Deixe a bicamada lipídica pré-inchar a 60 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, remova o frasco do recipiente. Retire cinco mililitros de solução de inchaço em uma seringa de plástico e conecte um filtro de 0,45 micrômetro à ponta da seringa.

Adicione a solução de inchaço filtrada ao frasco para hidratar o filme lipídico. Tampe o frasco e sele-o com filme plástico de parafina. Armazene o frasco a 60 graus Celsius durante a noite para obter o agregado GUV.

Resfrie as vesículas à temperatura ambiente dentro de uma hora após a remoção do fogo. Corte a extremidade de uma ponta de micropipeta de plástico de 200 microlitros, para que o agregado GUV possa ser puxado para dentro da ponta. Use a ponta da pipeta aparada para transferir o agregado e 50 microlitros de solução de inchaço para um frasco limpo e seco de dois mililitros.

Adicione ao frasco 950 microlitros de solução fresca de inchaço ou uma solução isotônica para atingir condições de solução simétricas ou assimétricas, respectivamente. Pipete a mistura para cima e para baixo e, em seguida, inverta suavemente o frasco várias vezes para ressuspender os GUVs. Para iniciar a avaliação, coloque uma alíquota da suspensão GUV em um isolador de silicone em uma lâmina de microscópio.

Sele a câmara com uma lamínula. Deixar a amostra reequilibrar durante cinco minutos. Em seguida, coloque a lâmina no estágio de amostra de um microscópio de fluorescência e adquira imagens de pelo menos 30 GUVs por lote.

Inspecione as imagens para determinar os estados de fase das GUVs de imagem. Os GUVs em estado de fase líquida única serão esféricos e lisos com um rótulo fluorescente homogeneamente distribuído por toda a membrana. GUVs em um estado bifásico ordenado e desordenado líquido serão esféricos com um rótulo fluorescente particionado em domínios com limites suaves dentro da membrana.

Verifique se os domínios estão livres para se difundir nas superfícies das vesículas e podem coalescer. Os GUVs em um estado de fase líquida sólida bifásica ou trifásica serão arredondados com alguns limites angulares. Domínios líquidos em um fundo sólido não devem exibir difusão, mas domínios sólidos devem se difundir livremente em um fundo líquido.

Uma vez que o estado de fase de cada GUV de imagem tenha sido identificado, determine o estado de fase dominante para o lote. Repita o processo com amostras independentes se o estado de fase dominante for uma maioria estreita. Antes de usar o dispositivo microfluídico, prepare pelo menos cinco mililitros de soluções de sacarose e sal.

Filtrar cada solução através de um filtro de 0,45 micrómetros. Em seguida, apare as pontas das pontas de pipeta de plástico de 200 microlitros e coloque uma ponta de pipeta em cada canal do dispositivo. Adicione ao reservatório do dispositivo 100 microlitros de solução de inchaço filtrada fresca do mesmo tipo usada para preparar os GUVs.

Adicione cinco microlitros da solução de inchaço a cada ponta da pipeta. Centrifugue o dispositivo a 900 vezes G por 10 minutos para preencher os canais do dispositivo. Em seguida, encha uma seringa de vidro de um mililitro com a mesma solução filtrada para inchaço.

Conecte um pedaço de tubo à seringa. Empurre a solução de inchaço através do tubo até que o êmbolo esteja totalmente pressionado e o tubo esteja cheio de solução. Em seguida, conecte a tubulação ao canal de saída e monte a seringa em uma bomba de seringa.

Em seguida, conecte a unidade de controle de pressão às entradas do canal microfluídico. Certifique-se de que as válvulas estejam fechadas e, em seguida, ajuste a pressão para três bar. Coloque o dispositivo microfluídico no estágio de amostra de um microscópio confocal invertido.

Use uma pipeta para remover a solução de inchaço do reservatório do dispositivo até que restem apenas 25 a 50 microlitros de solução. Adicione 150 microlitros da suspensão GUV ao reservatório e misture a suspensão com pipetagem suave. Execute a bomba de seringa no modo de retirada a 10 microlitros por minuto por 20 minutos ou até que mais de 90% das armadilhas do dispositivo estejam ocupadas.

Em seguida, abra as válvulas da unidade de controle de pressão para fechar as válvulas de anel no dispositivo microfluídico. Pare a bomba de seringa e deixe o dispositivo descansar por uma hora antes de adquirir imagens confocais dos GUVs no dispositivo. Em seguida, use uma pipeta para remover a suspensão GUV do reservatório para deixar apenas 25 a 50 microlitros.

Adicione ao reservatório 150 microlitros do outro tipo de solução de inchaço filtrada e pipete suavemente a mistura para cima e para baixo. Repita esse processo pelo menos cinco vezes para substituir completamente a solução no reservatório. Execute a bomba de seringa no modo de retirada a 10 microlitros por minuto por 10 minutos para substituir a solução nos microcanais.

Em seguida, diminua a taxa de fluxo para um microlitro por minuto. Feche as válvulas da unidade de controle de pressão por dois segundos e, em seguida, abra as válvulas e pare a bomba de seringa. Deixe o dispositivo descansar por uma hora antes de gravar imagens confocais.

Para começar a preparar a câmara de controle de temperatura, primeiro conecte as conexões do tubo farpado a um conjunto de fluxo de calor de alumínio com janelas de lamínula de dois milímetros de espessura. Prenda um espaçador de borracha a uma das lamínulas para formar a câmara de observação. Carregue 100 microlitros da suspensão GUV na câmara de observação e sele a câmara com uma lamínula.

Inverta lentamente o conjunto. Conecte a câmara de alumínio a um banho-maria externo. Monte o conjunto em um microscópio sample stage.

Ajuste o banho-maria externo para a temperatura mais baixa desejada e deixe o sistema equilibrar por 10 a 15 minutos. Adquira imagens dos GUVs e determine os estados de fase em várias temperaturas. Os GUVs foram preparados a partir de proporções variadas de DOPG e esfingomielina de ovo e colesterol em soluções simétricas de sacarose ou sal.

Seus estados de fase dominante foram determinados por microscopia de fluorescência. As composições selecionadas foram então transferidas para condições assimétricas por diluição para avaliar as condições efetivas da solução no comportamento da fase. Para investigar melhor o comportamento da fase GUV em soluções assimétricas, os GUVs foram presos em um dispositivo microfluídico para permitir a troca completa da solução externa.

Os GUVs aprisionados foram avaliados por microscopia confocal antes e após a troca fluídica. A fração de GUVs homogêneos a separados por fase foi monitorada em uma faixa de temperaturas para avaliar a temperatura efetiva no comportamento da fase GUV. Um padrão sigmoidal foi observado nos dados, que foram então ajustados a um modelo de Boltzmann.

A temperatura na qual a fração de GUVs separados por fase foi de 0,5 foi determinada a partir da curva ajustada. Embora esses métodos possam fornecer informações sobre o comportamento da fase da membrana, as aplicações também podem ser usadas para outros experimentos, como estudar as interações entre membranas em biomoléculas em condições fisiológicas.