Name: Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a avaliar o efeito da alta salinidade e assimetria transmembrana nos estados de fase de vesículas gigantes unilamelares usando microscopia de fluorescência. Este método permite preparar GUVs em condições fisiológicas.

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Este trabalho é parte do consórcio MaxSynBio, que é financiado conjuntamente pelo Ministério Federal da educação e pesquisa da Alemanha e a sociedade Max Planck.

Os autores não têm nada para divulgar.

Produção de sucesso de GUVs para observações de estado de fase em condições de alta salinidade simétricas e assimétricas
Os protocolos aqui apresentados apresenta uma estratégia para avaliar a influência de assimetria de buffer e a solução de alta salinidade em estado de fase de membrana de GUVs carregadas sobre uma escala larga das composições. Um dos principais desafios para alcançar este objetivo foi a produção de GUVs carregados nos buffers de alta salinidade.
Nós produzimos com sucesso GUVs em solução de sacarose e alta-solução salina tampão por uma simples abordagem inchaço espontânea, que inclui uma etapa de pré-hidratação do filme lipídico depositado e uma etapa final de hidratação durante a noite para crescimento de vesículas. É importante notar que a deposição de lipídios deve ser feita em uma placa PTFE áspera para garantir lipídico mesmo espalhar-se para produzir vesículas unilamellar. Além disso, é essencial para executar cada passo durante a preparação de vesículas em uma temperatura onde o filme lipídico está em um estado de fase fluida e homogênea. Outra coisa, a população de vesículas pode ser polydisperse na composição e influenciar a análise de estado de fase final da população. O protocolo específico para o inchaço espontâneo de GUVs rende uma moita de vesículas que por um lado, oferece a possibilidade de re-suspendê-lo em pequenos volumes para obter altamente concentrada dispersões de vesículas e por outro lado, fornece solução assimétrica condições através da membrana, minimizando a diluição das vesículas8,28. É essencial que durante a diluição de vesículas ou solução externa trocar, dentro e fora osmolarities permanecem combinado como alterações de morfologia causadas por incompatibilidades de osmolaridade podem induzir ou impedir de separação de fase Lo + Ld41 ou, no caso de hipotônica condições, pode levar à vesícula estourando.
Aqui, tenta otimizar protocolos de electroformation em solução de alta salinidade resultou na produção de não GUVs enquanto inchaço PVA-assistida rendeu vesículas multilamellar. Mesmo que ele requer mais longos tempos de preparação e resultados em lotes de vesículas de inferior qualidade10,17, o sucesso da produção de vesículas carregadas por espontânea inchaço vem com vantagens adicionais. Exige um esforço mínimo ao mesmo tempo, resultando em rendimentos suficientes para análises de estatística em lotes e, ao contrário de electroformation, sem equipamentos sofisticados ou otimização foram necessárias. Além disso, sem contaminações por oxidação lipídica têm sido observadas42,43. De acordo com a literatura não há nenhuma diferença entre as composições lipídicas das vesículas e as ações correspondentes do qual eles foram cultivados7,17. Além disso, a formação de vesículas sobre um substrato PTFE não solicita a inclusão de quaisquer contaminações em contraste com gel-assistida métodos inchaço onde moléculas estrangeiras podem ser introduzidas pelo substrato23. Electroformation vem com mais inconvenientes relacionados à diluição excessiva vesículas ao criar condições de solução assimétrica. GUVs produzidos por electroformation estão normalmente presentes como uma dispersão homogênea (em contraste com a suspensão de vesículas altamente concentrado na forma de um grupo formado durante o inchaço espontâneo). Qualquer diluição da solução externa diluiria substancialmente o número de vesículas também. Além disso, ao longo deste trabalho, observou-se que DOPG/eSM/Chol GUVs produziram pela electroformation em sacarose tornou-se instável, se diluído em tampão de alta salinidade. Fluorescência de patches de lipídios do slide de microscópio indicado que vesículas explodiriam antes sua inspeção visual foi possível. Tal instabilidade pode ser atribuída a uma tensão elevada da membrana das vesículas preparado pela electroformation em comparação com aqueles obtidos por inchaço espontâneo10.
Embora a diluição de vesícula é uma abordagem fácil e rápida para criar condições de solução GUV assimétricas, ele apenas realiza uma troca parcial solução externa, embora em uma fração de alta (aqui: 95%, Figura 2), como após diluição, vestígios de que o solução de inchaço permanecerá. A escolha do grau da troca da solução externa é um trade-off entre pipetagem até a moita de vesículas em conjunto com a solução de inchaço (seção 2) e não diluir demais. Portanto, nós introduzimos uma abordagem alternativa microfluidic discutida em outra parte em detalhe37 que permite uma troca rápida e completa solução externa durante observações de estado de fase de chefe para verificar as fase estado de observações para diluído vesículas. As observações de variações de estado de fase quando se muda de simétrica para condições de solução assimétrica de fato foram observadas para estar de acordo. Além disso, ambos os métodos para gerar condições de solução assimétrica mostradas aqui são comparativamente rápido (comparar ref.8) e vem sem riscos conhecidos de alterações de composição local (comparar referências30,31), aumento da tensão de membrana (comparar referência32), ou aquecimento local (comparar referência33), quanto os métodos alternativos discutido na introdução. Durante a captura de microfluidic, um equilíbrio osmótico entre a vesícula interior e o exterior não é apenas essenciais para evitar artefatos de estado de fase como mencionado acima, mas também causada por condições de solução hipertônica de deflação podem causar os GUVs presos a escorregar através do posts depois de uma troca de solução externa.
Mesmo que o inchaço espontâneo foi aplicado com sucesso para crescer sem carga vesículas de um sistema DOPC/eSM/Chol, em outros casos, a ausência de cargas podem afectar o GUV inchaço devido a consequente falta de repulsão entre os bilayers individuais44 . Estendendo o período pré-inchaço ou introduzindo headgroups volumosos lipídica pode contrariar esta questão45. Além disso, a estabilidade da vesícula após sua diluição em soluções diferentes daquele usado para inchaço pode diferir para composições diferentes lipídios e meios de diluição, que aqui não temos investigado. Também não exploramos a possibilidade de ajustar o diâmetro médio do chefe com o método de preparação aqui apresentado. Mas parâmetros tais como a composição de vesículas e inchaço solução são susceptíveis de influenciar os resultados. A aplicação de métodos alternativos46 pode produzir vesículas maiores para os lipídios e soluções utilizados aqui, no entanto, eles podem vir com outros inconvenientes associados com o método. A abordagem acima descritas para produzir GUVs em condições de alta salinidade simétricas e assimétricas fornece uma ferramenta potencial para estudos adicionais de vesículas constituído por composições diferentes lipídios e dispersos em diferentes meios. Que não exploramos as possibilidades, futuros julgamentos mostrará como geralmente os métodos de preparação e diluição de chefe podem ser aplicados.
Observando a separação de fases em diferentes temperaturas
Existem diferentes configurações experimentais adequadas para estudar GUVs a diferentes temperaturas. Enquanto essas configurações não são comumente descritas em detalhe dentro da literatura, o trabalho atual apresenta uma montagem básica aplicável para tais estudos.
_content "> controle medições mostram que a temperatura disto internamente projetou e construiu a câmara é precisamente controlada por um termostato e gradientes de temperatura dentro da Câmara estão dentro da resolução de temperatura experimental. Assegura-se que as condições experimentais térmicas são consistentes com a leitura do termostato.
Durante a avaliação dos Estados de fase chefe sobre uma escala de temperatura larga, é importante que as observadas vesículas são bem equilibradas após a temperatura ter sido alterada. Uma maneira de assegurar isto é para verificar se há histerese. Se houver histerese, os passos de temperatura devem ser diminuídos e/ou vezes de equilibração aumentaram. Como temperatura controle neste trabalho é estabelecida por um termóstato à base de água, a gama de temperaturas de funcionamento está idealmente limitada a 0 - 100 ° C. Este intervalo pode ser expandido usando outros líquidos de controle de temperatura como óleo ou empregando outras configurações, por exemplo, um dispositivo Peltier. Na prática, a temperatura também é limitada pela possível condensação ou evaporação. Além disso, para temperaturas longe da temperatura ambiente, a ocorrência de um gradiente de temperatura de estado estacionário em toda a câmara de observação se torna mais provável. Além disso, os equipamentos de imagem podem ser prejudicado em temperaturas extremas. Para intervalos de temperatura típico apropriados para estudos de vesículas lipídicas (~ 10-50 ° C7,9) danos ao equipamento de observação devem ser considerado, mas normalmente não é esperado.
Artefatos de observação de domínio de vesículas
Há um número de fontes para artefatos de observação usando microscopia de fluorescência de campo amplo. Primeiro de tudo, um deve estar ciente de que a resolução máxima r do objeto aplicado para a inspeção visual dos Estados de fase de vesículas determina o limite de detecção dos domínios de lipídios de acordo com: 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> onde λ é o comprimento de onda de emissão, e nd é a abertura numérica do objectivo. Um objetivo típico com um 40 x ampliação e um at de 0,6 que detecta de emissão verde acender cerca de 560 nm atingiria uma resolução óptica de ~0.6 µm. portanto, estudos que comparam a Estados de fase de vesículas, feitas a partir de misturas de lipídios particular entre diferentes condições devem usar o mesmo objectivo para a mesma mistura de lipídios.
Outro artefato é a ocorrência de domínios de lipídios em consequência da foto-oxidação lipídica devido a uma exposição prolongada à luz de excitação41. Foto-dano ocorre preferencialmente em metades de lipídios de hidrocarboneto insaturado. Na verdade, algumas composições de lipídios, tal formação de domínio das vesículas inicialmente homogêneas foi observada aqui após um longo período de exposição à luz de excitação (~ 30 s). Para combater esse problema, a luz de excitação foi mantida focada em um campo de visão por apenas alguns segundos para a avaliação do estado de fase. Portanto, o DiIC18 era adequado para os nossos propósitos. Outros corantes, no entanto, podem ser muito mais sensíveis e podem precisar de ser tratado em intensidades de excitação mais baixas e com tempos de exposição à luz de excitação mais curtos.
Tensão de cisalhamento mecânico da transferência das vesículas pipeta mistura potencialmente domínios temporariamente, assim, distorcer o comportamento de fase de vesículas aparentes. Para alguns lotes, vesículas diferentes apresentaram comportamentos diferentes fase 0 min e 5 min após a pipeta de transferência no sentido do lamela de microscópio. Também a tensão de cisalhamento induzida pelo fluxo do fluido no dispositivo microfluidic tem demonstrado resultar em domínio47de mistura. Vesículas devem ser deixadas sem ser perturbado por uma quantidade suficiente de tempo para equilíbrio antes de observação. Dentro deste estudo, vesículas presas no dispositivo microfluidic foram deixadas sem ser perturbado por 1h após o carregamento de vesícula e as trocas de solução antes de observação.
Para evitar alguns das dificuldades acima mencionadas, bem como a restrição imposta pelo limite de difração de luz, métodos alternativos, tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear48 ou de técnicas de microscopia de super resolução49 poderia ser empregada.
Conclusão e perspectivas
O trabalho apresentado demonstra um conjunto de métodos que permite a análise da influência das condições de alta salinidade simétrica e assimétrica solução na separação de fases de membrana. Todos os métodos apresentados são adequados para outras aplicações. O dispositivo microfluidic, por exemplo, fornece uma plataforma para estudar a cinética de formação de domínio e desaparecimento após a indução de assimetria de solução. Além disso, aparência de domínio em função da concentração de sal poderia ser analisada assim. Todos os métodos também podem ser usados para examinar a influência sobre o comportamento de fase usando outras soluções de interesse.

Já desde a observação dos domínios de micro-empresas em vesículas de líquido-líquido fase separada gigante unilamellar (GUVs) por microscopia de fluorescência, GUVs têm sido usados como um sistema modelo para investigar os lipídios jangada hipótese1,2 , 3 . Como a área de sua BICAMADA autônoma encontra-se no intervalo do que de células biológicas, que são imita apropriada das membranas de plasma apresentando as balsas hipotéticos. Foram realizados numerosos estudos sobre tais GUVs com vesículas dispersadas em água pura, sacarose ou soluções de baixa salinidade4,5,6,7,8. Nestas condições, no entanto, não refletem exposição fisiologicamente relevantes de biomembranas para ambientes de alta salinidade e trans-membrana solução assimetria como são as condições para as células.
Neste trabalho e em uma publicação anterior do nosso grupo9, os Estados de fase da carga GUVs multicomponentes foram examinados em função da presença de assimetria de sal e solução através da membrana. GUVs foram preparados a partir de misturas de diferentes proporções de dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), ovo esfingomielina (eSM) e colesterol (Chol) em solução de sacarose (com osmolaridade de 210 mOsm/kg) ou buffer de alta salinidade (100 mM de NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). A escolha de lipídios foi justificada pelos dados já obtidos no diagrama de fase desta mistura6,8.
Um número de métodos para a preparação de GUVs está disponível na literatura10,11,12 (Observe que, aqui, não consideraremos os que envolvem a transferência de lipídios de à base de óleo para uma fase aquosa 13 , 14 por causa do perigo inerente dos restantes resíduos óleo na membrana, que pode afetar o comportamento de fase). A preparação de GUVs no buffer de alta salinidade está associada com desafios específicos. Para soluções de baixa força iônica, o método de electroformation15,16 apresenta uma maneira rápida para preparar GUVs em rendimentos elevados com pequenos defeitos de10,17. O método baseia-se depositar uma camada de lipídios sobre uma superfície condutora (eletrodo), secá-los e hidratante-los com uma solução aquosa, enquanto aplicando um campo de AC. No entanto, este método requer ajustes se o sal está presente na solução aquosa18,19. Presume-se que a força motriz para o crescimento da vesícula por electroformation é electroosmosis16 que é dificultado em altas condutividades20. Portanto, electroswelling de GUVs em soluções de alta salinidade não é uma abordagem direta como necessita de otimização para as diferentes concentrações de sal presentes na solução inchaço. Assistida por gel de vesículas inchaço21,22 é uma alternativa potencial para electroformation com tempos de formação ainda mais rápidos. Esta abordagem baseia-se a hidratação do filme lipídico reforçada quando um gel (agarose ou álcool polivinílico (PVA)) é usado como substrato. Essas abordagens, no entanto, vêm com o risco de contaminação da membrana no caso baseada em agarose inchaço23 e/ou temperatura limites como no caso do inchaço baseada em PVA. Da mesma forma, um protocolo para crescer GUVs sobre um substrato de papel de celulose foi recentemente estabelecido24. Questões gerais desse método são a falta de controle sobre a pureza do substrato, bem como o uso de grandes quantidades de lipídios. Neste trabalho, iremos apresentar e apresentar as vantagens do método mais tradicional para a preparação de chefe, nomeadamente a espontânea inchaço método25,26. Consiste de uma camada lipídica sobre um substrato lipofóbico, hidratante-lo na atmosfera de vapor de água e inchaço subsequente na solução desejada inchaço de secagem (ver Figura 1 e detalhes na seção de protocolo). Este método não oferece controle sobre a distribuição de tamanho de vesículas e resulta em vesículas no geral menores em comparação com métodos onde a produção é assistida por campo elétrico, substrato de polímero ou microfluidic significa. No entanto, a qualidade de vesículas e o tamanho é apropriado para examinar o estado de fase de membrana como explorada aqui.
Criação de assimetria entre as soluções através da membrana da vesícula está associado com determinados desafios também. Uma abordagem comumente usada é a diluição direta da suspensão vesículas na solução externa desejada27,28. No entanto, isso também diminui a densidade de distribuição de vesículas. Outra estratégia é lentamente, trocar a solução externa em torno de GUVs, estabeleceu-se na parte inferior de uma pilha de fluxo que permite a solução de em - e saída. Para evitar perturbar ou mesmo perdendo as vesículas com o fluxo, taxas de fluxo baixas são aplicadas8, que processa esta abordagem tempo-ineficiente. Além disso, nenhuma dessas abordagens garante solução completa externa troca. Uma solução óbvia é para imobilizar vesículas para evitar perdê-los durante uma troca de solução externa. Por exemplo, biotinilado GUVs pode ser amarrado em uma superfície revestida streptavidin29. No entanto, esta abordagem pode levar a variações composicionais no aderidas e daí a membrana não-aderido segmentos30,31. Da aplicação magnética ou campos elétricos para aprisionar os resultados de vesículas na membrana de impor tensão32. Empregando a Pinça óptica para interceptar uma vesícula requer ter uma alça anexada (ou seja, uma pérola), enquanto o uso de macas ópticos pode envolver aquecimento local33. Captura de GUVs também pode ser realizada por cultivá-las em fios de platina sem desprendimento final34. Isso no entanto produz vesículas que não são isolados e geralmente ligados aos fios ou outras vesículas por tubos fina lipídico (amarras).
O trabalho apresentado destaca estratégias para superar as limitações acima referidas. Primeiro, apresentamos uma descrição detalhada do método inchaço espontâneo adaptado e otimizado para a produção de GUVs nos buffers de alta salinidade. Em seguida apresentamos duas abordagens para eficientemente criar condições de solução assimétrica por simples diluição ou a utilização de um dispositivo microfluidic. Porque o nosso objectivo é a análise do estado de fase membrana de GUVs em condições diferentes da solução, as seções subsequentes descrevem critérios para a análise estatística de sucesso e dicas de presentes para evitar falsa categorização.
As análises foram realizadas em condições isotérmicas, assim como sob temperaturas diferentes. Enquanto a temperatura control é comumente empregado, detalhes sobre câmaras de temperatura-controle experimental são raramente descritos. Aqui, apresenta-se uma configuração construída in-house para observar GUVs em diferentes condições de temperatura.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol), sal de sódio</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td><td>abreviado como DOPG no texto</td></tr><tr><td>esfingomielina de ovo de galinha</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>abreviado como</td></tr><tr><td>eSM colesterol (lã ovina, > 98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>abreviado como Chol</td></tr><tr><td>1,1'-dioctadecil-3,3,3',3',3'-perclorato de tetrametilindocarbocianina</td><td>Sondas moleculares</td><td>D-282</td><td>abreviadas como DiIC18</td></tr><tr><td>Clorofórmio, grau HPLC (&ge; 99,8%)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (> 99,8%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (37%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (&ge; 99,9%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarose (&ge; 99,5 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco roscado 45x27 mm, 15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>Soda fundo plano, tampa de rosca branca</td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Microscópio</td> confocal de varredura a laser D1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.6 NA</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.75 NA</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>Objective 63x, 0.9 NA</td><td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio, 56x26 mm, 0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínula, 22x22 mm, 0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; </td><td></td><td></td>seringas de</tr><tr>embalagem <td></td><td></td>flexível<td>"M"</td><td>Bremix</td></tr><tr><td>, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; filtro de seringa m</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, acetato de 1213723</td><td>, estéril</td></tr></tbody></table>

comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Vesículas separada fase gigante unilamellar (GUVs) exibindo coexistindo ordenada pelo líquidom e líquido-desordenada domínios são uma ferramenta comum de Biofísica para investigar a hipótese de balsa lipídica. Inúmeros estudos, no entanto, negligenciam o impacto de condições de solução fisiológica. Por conta disso, o trabalho atual apresenta o efeito da assimetria de solução tampão e trans-membrana alta salinidade na separação de fases líquido-líquido em GUVs carregados desenvolvidos dioleylphosphatidylglycerol, ovo esfingomielina e colesterol. Os efeitos foram estudados sob condições isotérmicas e variação de temperatura.
Descrevemos equipamentos e estratégias experimentais aplicáveis para monitorar a estabilidade dos domínios líquidos coexistentes em vesículas carregadas sob condições de solução de alta salinidade simétrica e assimétrica. Isso inclui uma abordagem para preparar GUVs multicomponentes carregados no buffer de alta salinidade, temperaturas elevadas. O protocolo implica a opção de realizar uma troca parcial da solução externa por uma etapa de diluição simples, minimizando a diluição de vesículas. Uma abordagem alternativa é apresentada utilizando um dispositivo microfluidic que permite uma troca de solução externa completa. Os efeitos da solução na separação de fases também foram estudados sob diferentes temperaturas. Para tal, apresentamos o projeto básico e a utilidade de uma câmara de controle de temperatura construído in-house. Além disso, refletimos sobre a avaliação do estado de fase GUV, armadilhas associados e como burlá-los.

Experimentos na fase separado unilamellar gigante vesículas (GUVs) frequentemente negligenciam condições de solução fisiológica. Este trabalho apresenta abordagens para estudar o efeito de buffer de alta salinidade na separação de fases líquido-líquido em GUVs multicomponentes carregadas como uma função de trans-membrana solução assimetria e temperatura.

Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

O objetivo geral deste protocolo é avaliar quantitativamente o efeito de ambientes de alta salinidade e da assimetria da solução transmembranar encontrada em condições fisiológicas sobre os estados de fase da membrana. As soluções no interior e no exterior das células são muito diferentes. Nossos métodos ajudam a compreender o efeito da assimetria da solução sobre as propriedades da membrana e seu comportamento de fase.A principal vantagem da nossa abordagem é que as vesículas podem ser preparadas em condições fisiológicas de tampão e o dispositivo microfluídico pode ser usado para criar condições de tampão assimétricas. Para iniciar o procedimento, lixe um dos lados de uma placa de PTFE com lixa fina. Lave a placa, um frasco de vidro de 15 mililitros e um recipiente de vidro com tampa com detergente comercial para lavar louças, etanol e clorofórmio.Use uma seringa de vidro de 25 microlitros para depositar de 10 a 15 microlitros do estoque de lipídios em clorofórmio no lado áspero da placa de PTFE limpa e seca. Espalhe o estoque de lipídios com a agulha da seringa para criar um filme lipídico uniforme. Use pinças para transferir a placa para o frasco de 15 mililitros.Aqueça a placa a 60 graus Celsius e desseque por duas horas para evaporar o solvente. Em seguida, adicione água desionizada a um recipiente de vidro até uma altura de cerca de um centímetro. Coloque o frasco com a placa dentro do recipiente, garantindo que permaneça estável e na posição vertical, e feche o recipiente.Deixe a bicamada lipídica pré-inchar a 60 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, retire o frasco do recipiente. Aspire cinco mililitros da solução de inchaço em uma seringa plástica e acople um filtro de 0,45 micrômetro à ponta da seringa.Adicione a solução de inchamento filtrada ao frasco para hidratar o filme lipídico. Tampe o frasco e feche-o com filme de parafina plástica. Armazene o frasco a 60 graus Celsius durante a noite para obter o agregado de GUV.Resfrie as vesículas até a temperatura ambiente dentro de uma hora após a remoção do calor. Corte a extremidade de uma ponteira plástica de micropipeta de 200 microlitros, de modo que o agregado de VUGs possa ser aspirado para dentro da ponteira. Use a ponteira aparada para transferir o agregado e 50 microlitros da solução de inchaço para um frasco limpo e seco de dois mililitros.Adicione ao vial 950 microlitros de solução de inchaço fresca ou uma solução isotônica para atingir condições simétricas ou assimétricas de solução, respectivamente. Pipete a mistura para cima e para baixo e, em seguida, inverta suavemente o vial várias vezes para ressuspender as GUVs. Para iniciar a avaliação, coloque uma alíquota da suspensão de GUVs em um isolador de silicone sobre uma lâmina de microscópio.Selar a câmara com uma lamínula. Deixar a amostra reequilibrar por cinco minutos. Em seguida, colocar a lâmina na platina do microscópio de fluorescência e adquirir imagens de pelo menos 30 GUVs por lote.Inspecione as imagens para determinar os estados de fase das GUVs na imagem. GUVs em um único estado de fase líquida serão esféricas e lisas, com um marcador fluorescente distribuído homogeneamente por toda a membrana. GUVs em um estado de duas fases, ordenada e desordenada, serão esféricas, com o marcador fluorescente particionado em domínios com fronteiras suaves dentro da membrana.Verifique se os domínios estão livres para difundir nas superfícies das vesículas e podem coalescer. GUVs em um estado de fase líquida sólida bifásica ou trifásica serão arredondados, com algumas fronteiras angulares. Domínios líquidos sobre um fundo sólido não devem exibir difusão, mas domínios sólidos devem difundir livremente sobre um fundo líquido.Uma vez identificado o estado de fase de cada GUV na imagem, determine o estado de fase predominante para o lote. Repita o processo com amostras independentes se o estado de fase predominante representar uma maioria estreita. Antes de utilizar o dispositivo microfluídico, prepare pelo menos cinco mililitros de cada uma das soluções de inchaço de sacarose e sal.Filtre cada solução através de um filtro de 0,45 micrômetro. Em seguida, corte as extremidades de ponteiras plásticas de 200 microlitros e coloque uma ponteira em cada canal do dispositivo. Adicione ao reservatório do dispositivo 100 microlitros de solução de inchamento fresca e filtrada do mesmo tipo utilizada para preparar as GUVs.Adicione cinco microlitros da solução de inchaço a cada ponteira de pipeta. Centrifugue o dispositivo a 900 vezes G durante 10 minutos para preencher os canais do dispositivo. Em seguida, encha uma seringa de vidro de um mililitro com a mesma solução de inchaço filtrada.Conecte um trecho de tubo à seringa. Empurre a solução de inchaço através do tubo até que o êmbolo esteja completamente pressionado e o tubo esteja cheio de solução. Em seguida, conecte o tubo ao canal de saída e fixe a seringa em uma bomba de seringa.Em seguida, conecte a unidade de controle de pressão às entradas do canal microfluídico. Certifique-se de que as válvulas estejam fechadas e, então, ajuste a pressão para três barras. Coloque o dispositivo microfluídico sobre a platina da amostra de um microscópio confocal invertido.Use uma pipeta para remover a solução de inchaço do reservatório do dispositivo até que permaneçam apenas 25 a 50 microlitros de solução. Adicione 150 microlitros da suspensão de GUV ao reservatório e misture a suspensão com pipetagem suave. Execute a bomba de seringa em modo de retirada a 10 microlitros por minuto durante 20 minutos ou até que mais de 90% das armadilhas do dispositivo estejam ocupadas.Em seguida, abra as válvulas da unidade de controle de pressão para fechar as válvulas anelares no dispositivo microfluídico. Pare a bomba de seringa e deixe o dispositivo em repouso por uma hora antes de adquirir imagens confocais dos GUVs no dispositivo. Em seguida, use uma pipeta para remover a suspensão de GUVs do reservatório, deixando apenas 25 a 50 microlitros.Adicione ao reservatório 150 microlitros do outro tipo de solução de inchaço filtrada e pipete suavemente a mistura para cima e para baixo. Repita este processo pelo menos cinco vezes para substituir completamente a solução no reservatório. Execute a bomba de seringa no modo de aspiração a 10 microlitros por minuto durante 10 minutos para substituir a solução nos microcanais.Em seguida, reduza a taxa de fluxo para um microlitro por minuto. Feche as válvulas da unidade de controle de pressão por dois segundos e, então, abra as válvulas e pare a bomba de seringa. Deixe o dispositivo em repouso por uma hora antes de registrar as imagens confocais.Para começar a preparar a câmara de controle de temperatura, conecte primeiramente adaptadores com retenção para tubos a uma montagem de fluxo de calor em alumínio com janelas de lamínulas de dois milímetros de espessura. Fixe um espaçador de borracha em uma das lamínulas para formar a câmara de observação. Carregue 100 microlitros da suspensão de GUVs na câmara de observação e feche a câmara com uma lamínula.Inverta lentamente o conjunto. Conecte a câmara de alumínio a um banho de água externo. Monte o conjunto sobre a platina de amostras do microscópio.Configure o banho-maria externo na temperatura mais baixa desejada e deixe o sistema equilibrar por 10 a 15 minutos. Adquira imagens das GUVs e determine os estados de fase em várias temperaturas. As GUVs foram preparadas a partir de diferentes proporções de DOPG e esfingomielina de ovo com colesterol em soluções simétricas de sacarose ou sal.Os estados de fase dominantes foram determinados por microscopia de fluorescência. Em seguida, composições selecionadas foram transferidas para condições assimétricas por diluição, a fim de avaliar as condições efetivas da solução sobre o comportamento de fase. Para investigar mais a fundo o comportamento de fase de GUVs em soluções assimétricas, os GUVs foram aprisionados em um dispositivo microfluídico para permitir a troca completa da solução externa.As GUVs aprisionadas foram avaliadas por microscopia confocal antes e após a troca de fluido. A fração de GUVs homogêneas em relação às GUVs com separação de fases foi monitorada ao longo de uma faixa de temperaturas para avaliar o efeito da temperatura no comportamento de fase das GUVs. Um padrão sigmoide foi observado nos dados, que então foram ajustados a um modelo de Boltzmann.A temperatura na qual a fração de GUVs separados em fases foi de 0,5 foi determinada a partir da curva ajustada. Embora este método possa fornecer informações sobre o comportamento de fase da membrana, as aplicações também podem ser utilizadas em outros experimentos, como para estudar as interações entre membranas em biomoléculas sob condições fisiológicas.

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TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Descrevemos um protocolo para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e sua caracterização usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Apresentamos uma técnica para micromanipulação sem contacto das vesículas, usando gradientes de íons cálcio localizadas. Microinjeção de uma solução de íons cálcio, nas proximidades de uma vesícula lipídica gigante, é utilizada para remodelar a membrana lipídica, resultando na produção de saliências de membrana tubular.

Remodelação de membrana das vesículas gigantes em resposta a gradientes de íons cálcio localizadas

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3  como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Aprenda a avaliar o efeito da alta salinidade e assimetria transmembrana nos estados de fase de vesículas gigantes unilamelares usando microscopia de fluorescência. Este método permite preparar GUVs em condições fisiológicas.

Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência

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