Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

O objetivo geral do leapfrogging é facilitar a criação de linhagens mutantes para genes essenciais para a embriogênese. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na Genética do Desenvolvimento e em outros campos. A principal vantagem dessa técnica é que é possível obter mutantes em genes essenciais na geração F1.

Para iniciar este procedimento, microinjete embriões de Xenopus na fase de uma célula com complexos Cas9-sgRNA conforme descrito no protocolo textual. Quando os embriões atingirem 4,5 horas pós-fertilização, na fase inicial de blástula nove, remova-os do incubador a 25 graus Celsius para permitir que continuem o desenvolvimento à temperatura ambiente. Para iniciar o transplante cinco horas após a fertilização, utilize uma pipeta de Pasteur para transferir um embrião não injetado para um recipiente de agarose de 60 milímetros contendo depressões, que servirá como receptor do enxerto.

Também transfira um embrião doador PGC para o recipiente. Use pinças para remover manualmente os envelopes vitelinos de cada embrião. Em seguida, gire ambos os embriões para que seus polos vegetais fiquem voltados para cima e acessíveis para a cirurgia.

Em seguida, enquanto estabiliza o embrião receptor com o laço de cabelo, insira a ponta afiada de uma lâmina de cabelo de sobrancelha no polo vegetal, logo abaixo da superfície. E, com movimentos rápidos de corte ascendentes, faça quatro incisões rasas com o formato de um quadrado, dentro da zona onde futuras células em forma de garrafa se formarão, marcando o blastóporo. Uma vez delineados os quatro lados do quadrado, use a lâmina de cabelo de sobrancelha para aprofundar cada incisão, utilizando movimentos de corte semelhantes, até uma profundidade de aproximadamente 1/3 a 1/2 da distância até o assoalho do blastocélio.

Livre o explante de tecido vegetal do embrião receptor fazendo um ou mais cortes horizontais na região vegetal profunda. Em seguida, trabalhando rapidamente, repita este procedimento no embrião doador de CPGs para criar um fragmento de tecido vegetal de tamanho semelhante para transplante. Uma vez que o tecido contendo CPGs seja removido do embrião doador, use a lâmina de cabelo e o laço de cabelo para posicionar o explante na abertura criada no embrião receptor.

Use o cabo da lâmina para pelos de sobrancelha, mantido paralelo à superfície do enxerto, para pressionar suavemente o enxerto dentro da abertura na superfície vegetal do embrião receptor. Use o laço de cabelo para deslizar suavemente o cadáver do embrião doador sobre a superfície de agarose e para dentro de um poço. Certifique-se de que a ferida aberta do cadáver esteja voltada para o líquido principal.

Deslize o embrião receptor para um poço adjacente e, da mesma forma, certifique-se de que o tecido do polo vegetal enxertado esteja voltado para o líquido bulk. Repita o transplante de CPGs com embriões adicionais para criar mais pares de carcaças com transplante, até que os embriões atinjam aproximadamente o estágio inicial da gastrulação (estágio 10), transferindo os embriões para poços vazios à medida que os transplantes são realizados. Uma vez que os enxertos tenham cicatrizado no lugar, tipicamente entre 30 a 45 minutos após o transplante, utilize uma pipeta de Pasteur para transferir suavemente os embriões das depressões para poços individuais em uma placa de 24 poços revestida com agarose.

Gire os embriões para que fiquem posicionados com o polo vegetal voltado para cima, em direção à solução bulk. Coloque as carcaças doadoras e os embriões receptores em poços adjacentes para auxiliar no acompanhamento dos pares de embriões e registre essas informações. Em seguida, transfira a placa de 24 poços contendo os embriões para uma incubadora a 25 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, transfira cada receptor do enxerto, agora na fase inicial de broto da cauda, para um poço individual de uma placa fresca de seis poços recoberta com agarose. Criar os embriões leapfrog e realizar a análise do DNA do doador obtido a partir das carcaças de acordo com o protocolo descrito no texto. Como o leapfrog produz animais com substituição eficiente da linhagem germinativa por alelos mutantes, os fenótipos mutantes podem ser obtidos na geração F1.

Como apresentado nesta tabela, Blitz et al. relataram que a maioria dos animais F0, direcionados ao locus da tirosinase, que é necessário para a pigmentação de melanócitos e da retina, apresentam transmissão germinativa de 100% dos genomas mutantes derivados do doador, conforme medido por cruzamentos com animais albinos tyr negativos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transplantar células germinativas primordiais de Xenopus.