Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

O objetivo geral deste novo sistema modelo baseado em DNA é entender as propriedades fundamentais de uma classe de polímeros semiflexíveis, que também descreve o comportamento de uma classe vital de biopolímeros. Este novo método nos permite estudar questões-chave no campo da metafísica suave, especificamente, permite explorar o comportamento de filamentos semiflexíveis e seus arranjos em redes. A principal vantagem desta técnica é que as propriedades mecânicas dos filamentos intravisivos são experimentalmente acessíveis e podem ser ajustadas com precisão.

Os polímeros semiflexíveis são definidos pelas propriedades especiais dos filamentos que antes só eram tratados no referencial teórico devido à falta de sistemas experimentais sintonizáveis. Embora este método forneça informações sobre a quantidade definidora de polímeros semiflexíveis, ele também pode ser aplicado como um novo hidrogel para estudar a migração celular em matrizes de diferentes rigidezes sem alterar o tamanho da malha de subposição. A menor unidade repetitiva no nanotubo pode ser pensada como um anel unitário.

Vários desses anéis unitários se acumulam durante a hibridização. Isso leva à formação de nanotubos alongados. Para começar, ressuspenda os oligonucleotídeos liofilizados em água purificada e siga as etapas adicionais de ressuspensão fornecidas no manual correspondente da empresa.

Ajustar a quantidade de água para obter uma concentração final de 200 micromolares. Determine as concentrações das fitas de DNA simples para verificar os valores fornecidos pelo distribuidor, pois a estequiometria exata é crucial para o processo de montagem. Usando uma micropipeta, misture as fitas de DNA da mesma concentração em um recipiente adequado para o termociclador formar os tubos de DNA e hélice desejados.

Hibridizar os tubos de DNA e hélice em um termociclador usando os parâmetros encontrados no protocolo de texto. Armazene os tubos de DNA e hélice hibridizados por até 3 semanas a 4 graus Celsius sem degradação detectável. Antes de realizar a reologia, dilua cuidadosamente a amostra até a concentração final desejada usando o tampão de amostra, se necessário.

Escolha uma geometria apropriada para o reômetro de cisalhamento dinâmico. Em seguida, carregue a amostra no reômetro. Para evitar possíveis efeitos de evaporação, passivar

Cerque a amostra com 2,5 mililitros do banho tampão da amostra. Ou adicione um surfactante logo abaixo da concentração de micela à amostra. Em alternativa, utilize a seringa de hamilton para envolver a amostra com lípidos para evitar o contacto direto da amostra com o ar.

Selar a câmara de recolha com uma cápsula equipada com esponjas húmidas. E, se possível, use um banho-maria adicional para suprimir ainda mais a evaporação. Inicie a medição usando o software específico do reômetro à temperatura ambiente, permitindo que a amostra se equilibre por 2 horas à temperatura ambiente.

O tempo de equilíbrio é crucial para permitir que o sistema termofletor atinja um estado randomizado isotrópico completo, uma vez que esta é a única confirmação que permite a comparação entre as diferentes medições. Após a medição, processe os dados conforme descrito no protocolo de texto. Prepare 8 alíquotas de 12 microlitros para cada amostra usando 1 a 4 DNA micromolar por fita, 12,5 milimolares de cloreto de magnésio e 1x coloração de gel de ácido nucleico.

Além disso, faça um controle negativo sem DNA, mas inclua a coloração de gel de ácido nucleico. Transfira as alíquotas para uma placa de PCR em tempo real e sele com filme adesivo. Centrifugue a placa a 100 vezes G por 1 minuto em temperatura ambiente para remover as bolhas de gás.

É fundamental remover as bolhas de gás porque elas podem se expandir durante as medições e as amostras não podem ser analisadas. Após a centrifugação, carregue a placa selada em um sistema de PCR quantitativo em tempo real. Programe um programa de recozimento para desnaturar o DNA a noventa graus Celsius por 10 minutos e baixar a temperatura rapidamente para setenta e dois graus Celsius.

Em seguida, a temperatura deve diminuir lentamente em 0,5 graus Celsius a cada trinta minutos. Depois que o sinal diminuir, acelere a temperatura ramp. Certifique-se de que a tampa do ciclador aqueça a pelo menos cem graus Celsius para evitar a condensação da amostra evaporada no filme adesivo.

Durante a montagem, excite as amostras com um laser de íons de argônio a quatrocentos e oitenta e oito nanômetros e detecte a fluorescência a quinhentos e cinquenta nanômetros ao usar um corante CY3. Para outros corantes, escolha uma combinação de emissão de excitação apropriada. Meça o sinal de fluorescência com a maior frequência possível para aumentar a qualidade geral do sinal usando a câmera embutida.

Dados brutos representativos de uma medição reológica são mostrados revelando a elasticidade da rede. Aqui é mostrada a varredura de tempo durante o tempo de equilíbrio. Este gráfico revela o comportamento dependente da deformação da rede.

Neste gráfico, o comportamento dependente da frequência da rede é evidente. Neste ponto, os valores em uma frequência específica são escolhidos. Os valores para a população específica de tubos de hélice de DNA foram plotados em relação à concentração.

Este processo foi repetido para todos os tubos de DNA e hélice. A inclinação foi então extraída em uma parcela de log registrada, produzindo o expoente da lei de potência. Finalmente, os valores foram replotados em relação ao comprimento persistente para cada concentração medida.

Esses gráficos permitem extrair a escala do módulo de platô elástico em relação à concentração e ao comprimento da persistência. Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da matéria mole e da física de polímeros explorarem o efeito da rigidez do filamento para a classe de polímeros semiflexíveis. Seguindo esse procedimento, efeitos adicionais como a recitação das redes emaranhadas, o cruzamento de redes em geral e o processo de formação de estruturas podem ser abordados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como hibridizar nanotubos de DNA e como medir as propriedades reológicas de suas redes.