Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

Os objetivos gerais deste procedimento de bio-panning são isolar rapidamente os agentes de captura de peptídeos em um alvo de proteína específico de interesse e eliminar de forma rápida e eficaz os candidatos inespecíficos de análises posteriores a jusante. Este método pode ser usado para a descoberta de reagentes robustos de afinidade peptídica para uma variedade de aplicações, desde a detecção de ameaças biológicas até o diagnóstico de doenças. A principal vantagem desta técnica é que os reagentes de afinidade peptídica podem ser rapidamente isolados em cerca de uma semana sem uma quantidade significativa de treinamento.

Embora esse método possa ser usado para descobrir reagentes de afinidade de peptídeos para uso fora da célula, os peptídeos também podem ser usados como materiais vivos. Geralmente, o aspecto mais difícil para indivíduos novos neste método será a análise de sequência a jusante dos candidatos, que interage fortemente com os protocolos experimentais mostrados aqui. As bibliotecas de exibição bacteriana de bio-panning são um processo cíclico que começa com a classificação negativa contra os próprios grânulos magnéticos para remover quaisquer ligantes inespecíficos ao material do grânulo ou quaisquer proteínas de captura anexadas.

A fração negativa que não liga as esferas magnéticas deve ser mantida. A classificação negativa adicional pode ser realizada contra quaisquer alvos potenciais de proteína de reação cruzada, e a fração negativa que não liga as esferas magnéticas é novamente mantida. As etapas de classificação positiva subsequentes são muito semelhantes à classificação negativa em relação a um alvo de proteína, mas desta vez a fração positiva ligada a esferas magnéticas é retida.

Para a classificação positiva da biblioteca de exibição bacteriana, primeiro inocule 500 mililitros de Luria Broth Miller suplementado com cloranfenicol, ou LBCM-25, com aproximadamente uma vez 10 elevado à 11ª célula de uma biblioteca de classificação de exibição bacteriana diversificada pré-esgotada de peptídeos indesejados por classificação negativa. Incube a biblioteca a 37 graus Celsius em 225 RPM até que a cultura atinja um OD 600 de 0,5 a 0,55. Em seguida, induza a expressão do peptídeo com 0,04% L-arabinose por 45 minutos a 37 graus Celsius com agitação.

No final do período de indução, coloque a cultura no gelo. E colete duas vezes dez elevado à 11ª célula bacteriana por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de PBS com um giro suave.

E divida as bactérias em vários tubos de microcentrífuga conforme necessário para uma segunda centrifugação. Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS suplementado com o alvo de biotinilação de interesse para uma incubação de 45 minutos a quatro graus Celsius em uma plataforma rotativa. Enquanto isso, lave 100 microlitros de esferas codificadas com estreptavidina em um milímetro de PBS suplementado com albumina de soro bovino, ou BSA, por centrifugação.

Colocado os grânulos lavados em um separador de partículas magnéticas de bancada e remova cuidadosamente o super nadent, tomando cuidado para não perturbar o pellet. No final da incubação rotativa, centrifugue as células para coletar qualquer alvo não ligado no supernadente e ressuspenda o pellet de célula de bactéria ligada à proteína alvo em um mililitro de PBS mais BSA. Use todo o volume de células bacterianas para ressuspender o grânulo de grânulos.

Incube a quatro graus Celsius em uma plataforma giratória por 30 minutos. Em seguida, coloque o grânulo e a solução de bactérias no gelo. Ligue o instrumento auto max para inicializar o sistema e selecione lavar agora, enxaguar e executar no menu de separação para preparar as linhas com os buffers de lavagem e execução do fabricante, respectivamente.

No final da lavagem, prepare as linhas mais uma vez usando PBS mais tampão BSA. Quando o instrumento estiver pronto, transfira a mistura de bactérias e esferas para um tubo cônico de 15 mililitros e enxágue o tubo com mais 500 microlitros de PBS fresco mais BSA. Puxe a lavagem com a mistura de bactérias e esferas e coloque o tubo no slot de amostra de um suporte de tubo cônico de quatro graus Celsius.

Coloque tubos coletores vazios de 15 mililitros nas ranhuras de seleção positiva e negativa do rack e transfira o rack para a plataforma do instrumento. Atribua um programa de separação para cada amostra no rack, adicionando uma etapa de enxágue entre cada amostra e após a última amostra. Selecione executar para iniciar a separação de células e ok ou continue a confirmar se há buffer suficiente disponível.

Quando o programa estiver concluído, remova a prateleira e coloque a fração positiva contendo as bactérias e as contas no gelo. Depois de preparar as linhas conforme demonstrado, com os buffers de operação e lavagem do fabricante, selecione potência e sim para desligar o instrumento e confirmar se há 70% de etanol no frasco de solução de armazenamento para descontaminação. Quando o desligamento do sistema estiver concluído, as garrafas ficarão roxas.

A máquina pode ser desligada. Em seguida, use toda a fração de classificação positiva para inocular um litro de LBCM25 suplementado com glicose D para cultura noturna a 37 graus Celsius com agitação. Para analisar o sucesso do isolamento do reagente de afinidade após cada rodada de classificação, ao final da indução do peptídeo pós-classificação, adicione cinco microlitros de células induzidas a 25 microlitros das soluções, conforme mostrado na tabela.

Após uma incubação de 45 minutos no gelo, recolher as bactérias em cada solução por centrifugação e aspirar o super nadente de cada amostra. Com os tubos de amostra congelados, selecione administrador no software do instrumento de FAX e abra a pasta de análise apropriada. Clique em novo experimento.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse para renomear o experimento e clique em planilhas globais. Clique no ícone de gráfico de pontos na planilha global para criar um novo gráfico de dispersão. Em seguida, selecione o próprio gráfico de pontos e selecione o ícone do inspetor.

Clique nas caixas ao lado dos eixos X e Y na janela aberta para ajustar os eixos para uma exibição bi-exponencial e fechar a janela do inspetor. Clique no experimento e crie uma nova amostra, clicando com o botão direito do mouse para renomear a amostra conforme apropriado experimentalmente. Em seguida, clique no sinal de mais para expandir a amostra e renomear a amostra.

Para executar uma amostra de controle negativo, ressuspenda o pellet somente PBS em 500 microlitros de tampão de FAX gelado misturando bem por pipetagem. Transfira a amostra para um tubo de FAX, agitando para manter as células em solução, e carregue a amostra no tubo de injeção de amostra ou SIT, do instrumento. Clique duas vezes no tubo de amostra atual e clique nos dados adquiridos.

Em seguida, exiba os eventos na área de dispersão lateral previamente preparada versus o gráfico de pontos da área de dispersão direta, ajustando o limite de tensão do tubo fotomultiplicador sob a guia de limite conforme necessário para que as células de controle negativo caiam perto do centro. Quando a amostra estiver sendo lida corretamente, ajuste a taxa de fluxo para exibir 200-2.000 eventos por segundo e clique em registrar dados para capturar um mínimo de 10.000 eventos. Quando todos os eventos tiverem sido adquiridos, remova o sample tubo do SIT.

Selecione o ícone de porta de polígono e desenhe uma porta ao redor da maioria da população de células no gráfico de dispersão. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos para selecionar mostrar hierarquia de população e clique em P1 na hierarquia de população e crie um novo gráfico de pontos para exibir a população P1. Clique com o botão direito do mouse em cada eixo para alterar o eixo Y para a área FITC e o eixo X para a área de dispersão direta e ajuste os eixos para uma exibição biexponencial.

Use a porta poligonal para bloquear as células de controle negativo o mais firmemente possível nos lados superior e esquerdo da população e selecione P2 na hierarquia da população, clicando com o botão direito do mouse para selecionar inverter a porta. Menos de 1% da população deve ficar fora do portão. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos com a porta P2 para selecionar mostrar populações e selecione as populações P2 e não P2 para exibição.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos com a porta P2 para selecionar criar exibição de estatísticas e clique com o botão direito do mouse na janela de exibição de estatísticas para selecionar editar exibição de estatísticas. Na guia populações, adicione ou remova as populações conforme apropriado, incluindo a população pai P1. P2 e não P2 já devem ser mostrados.

Em seguida, na guia de estatísticas, adicione a área FITC média e quaisquer outras estatísticas de interesse e clique em OK para fechar a janela. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de dispersão P2 e selecione duplicar para criar um gráfico de gráfico de pontos semelhante para a área PE versus a área FSC. Ajuste o eixo Y e use apenas a amostra PBS para bloquear a população P3.

Em seguida, inverta o portão. E exiba as populações apropriadas. Quando todas as portas apropriadas tiverem sido definidas, use a planilha para executar todas as amostras registrando cerca de 10.000 eventos por tubo.

Como neste experimento representativo, a ligação de Ypet Mona a um peptídeo de controle positivo fixo pode ajudar a monitorar o nível de expressão da biblioteca de peptídeos induzidos na população. As células sem peptídeos exibidos na superfície são geralmente eliminadas durante o processo de classificação, conforme observado nas rodadas três e quatro. O enriquecimento da biblioteca de peptídeos que se ligam ao alvo específico de interesse é normalmente alcançado em três rodadas de classificação positiva.

Continuar para uma quarta rodada de classificação pode ser benéfico, pois as sequências de peptídeos de maior afinidade já presentes na terceira rodada provavelmente serão ainda mais enriquecidas na quarta rodada, auxiliando na seleção de candidatos em potencial. A especificidade é avaliada comparando a ligação ao alvo pretendido com a ligação a quaisquer alvos potenciais de reação cruzada, como aqueles que foram usados para classificação negativa. A análise de sequências da quarta rodada de classificação normalmente revela sequências repetidas que são excelentes pontos de partida para análises de afinidade e especificidade.

A análise de alinhamento de sequência das sequências repetidas pode ser usada para revelar a presença de uma sequência de consenso que pode ajudar na seleção de candidatos. Uma colônia representativa de cada sequência repetida pode então ser analisada por fatos de afinidade e especificidade na célula para avaliar a ligação do peptídeo às proteínas-alvo e reativas cruzadas. Uma vez dominado, um experimento biológico completo com a análise inicial de afinidade e especificidade pode ser realizado em menos de duas semanas se for executado corretamente.

Ao executar o procedimento completo, é importante lembrar que pode ser necessário alternar entre a avaliação de associação e as análises de sequência várias vezes para entender completamente o trânsito envolvido na afinidade de associação. Incluímos um arquivo de macro suplementar que desenvolvemos para automatizar grande parte da análise de peptídeos e agilizar ainda mais a seleção de candidatos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar rapidamente os agentes de captura de peptídeos de uma biblioteca de exibição bacteriana e como eliminar candidatos não específicos de análises posteriores a jusante.

Depois de seguir este procedimento, outros métodos, como ALIZA, podem ser realizados para confirmar a afinidade e especificidade da ligação off-celular.