Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

O objetivo geral deste experimento é observar o comportamento celular durante a progressão da linhagem de células-tronco neurais para neurônios ou células gliais. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo do neurodesenvolvimento, como o papel das divisões celulares simétricas e assimétricas, o alongamento do ciclo celular e as taxas de crescimento celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a observação da linhagem celular por longos períodos.

Isso permite a observação da mudança da neurogênese para a gênese glial dentro de uma única linhagem e uma composição direta de progenitores neurais e gliais sublineares. Comece removendo os cérebros de 5 a 10 embriões e14 em uma placa de Petri com meio de dissecação a frio. Use uma pinça para retirar cuidadosamente a pele e o crânio e isolar os cérebros.

Ao trabalhar sob o microscópio estéreo, use uma pinça de dissecção para remover as meninges. Em seguida, divida o telencéfalo ao meio para separar os hemisférios. Para isolar o telencéfalo dorsolateral, corte ao longo da curva dorsomedial e do limite do pálio e do subpálio.

Transfira os telencéfalos dorsolaterais para um tubo de 2mL com meio de dissecção no gelo até que todos os cérebros sejam dissecados. Após a microdissecção do telencéfalo dorsolateral, colocar o tecido em um tubo cônico de 15mL. Em seguida, centrifugue o tubo contendo o tecido coletado em meio de dissecção a frio por cinco minutos a quatro graus Celsius e 340 vezes G para precipitar o tecido.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante com uma pipeta e adicione 1mL de 37 graus Celsius 0,05% de tripsina-EDTA para digestão química. Incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione 2mL de meio de proliferação para inibir a atividade do tripsismo.

Em seguida, polir a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro sobre um queimador de gás ou bico de bunsen por alguns segundos para diminuir ligeiramente a abertura. Aspere o FCS para revestir a ponta da pipeta. Em seguida, dissocie mecanicamente as células com a pipeta Pasteur polida a fogo e revestida com FCS, pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para evitar a geração de bolhas.

Centrifugue as células dissociadas por cinco minutos a quatro graus Celsius a 340 vezes G.Remova o sobrenadante com uma pipeta, adicione um milímetro de meio de proliferação e ressuspenda as células usando uma pipeta. Remova o PBS da placa pré-tratada com Poli-D-Lisina. Em seguida, desenhe um sinal na parte inferior da placa que possa ser usado como referência para determinar o ponto zero.

Depois de ressuspender as células em meio de proliferação pela segunda vez, prepare uma diluição de um para um da suspensão celular usando uma solução de azul de tripano a 0,4%. Carregue nas lâminas da câmara de contagem e conte o número de células viáveis não coradas. As células não viáveis serão azuis.

Dilua as células em meio de proliferação para obter 10 a sextas células por milímetro. Adicione 500 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para obter imagens de células transduzidas por retrovírus, coloque a placa de cultura de tecidos em uma câmara de imagem conectada a controladores de temperatura e dióxido de carbono para manter as células em condições constantes de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Selecione uma posição no eixo xy para servir como um ponto zero e calibrar o ponto zero. Selecione 10 a 15 posições por poço para serem fotografadas com ampliação de 10 vezes. Configure o software para exigir imagens de contraste de fase a cada cinco minutos e imagens de fluorescência a cada três horas para diminuir a fototoxicidade.

Verifique e ajuste o foco nas primeiras três horas do experimento, pois ele pode mudar enquanto a temperatura se equilibra. Após sete dias, interrompa a aquisição e prossiga para a imunocitoquímica pós-imagem. Inicie o software de rastreamento de celular e escolha um nome de usuário.

Clique em escolha seu nome de usuário e continue. Navegue e selecione a pasta de trabalho tTt para salvar árvores de linhagem, estatísticas e imagens exportadas. Em seguida, selecione o experimento a ser analisado e carregado.

Se as imagens foram convertidas anteriormente pelo conversor tTt, clique em conversor de arquivos de log e especifique o número de segundos entre dois pontos de tempo consecutivos na janela do conversor de arquivos de log. Clique em converter arquivos de log para todo o experimento. Selecione e carregue as imagens desejadas manualmente ou usando a opção exibida no programa.

Selecione o arquivo, abra, nova colônia. Clique em rastreamento, seguido de iniciar rastreamento para iniciar o rastreamento em uma posição escolhida. Uma janela de filme aparecerá.

Selecione a célula usando o círculo de rastreamento e pressione a tecla zero. O software irá para o próximo quadro. Continue posicionando o círculo de rastreamento ao redor da célula de rastreamento usando o mouse e clique em zero em cada quadro para adicionar uma marca de rastreamento na célula.

Use as teclas um e três para mover para o quadro anterior ou seguinte. Para excluir uma marca de trilha, basta clicar na posição correta para marcar e pressionar zero. Se a célula foi dividida, selecione rastreamento, motivo da parada, divisão e continue rastreando uma célula filha selecionando uma das células na janela do editor de células, selecione rastreamento, inicie o rastreamento.

Para rastrear a segunda célula filha, selecione-a no editor de células e pressione F2. Se a célula morreu durante a microscopia de vídeo, selecione apoptose. Se a célula sair do campo de observação ou se misturar com células vizinhas, impedindo o rastreamento, selecione perdida. Para interromper o rastreamento e continuar mais tarde, clique em interromper.

Na janela do editor de células, uma árvore será gerada durante o rastreamento. Para salvar a árvore de linhagem, selecione arquivo, salvar, árvore atual na janela do editor de células. Para exportar o filme com os dados de rastreamento, desative o modo de rastreamento e, na janela do filme, selecione exportar filme.

Configure o intervalo de formatos de quadros, número de quadros por segundo e taxa de bits. Clique em iniciar exportação. As fotomicrografias a seguir mostram contraste de fase em imagens fluorescentes GFP de uma cultura de células primárias do córtex cerebral.

A expressão de GFP está ausente durante as primeiras horas de imagem. O número de células que expressam GFP aumenta com o tempo e a intensidade da fluorescência GFP aumenta, conforme indicado pela seta amarela nessas imagens. Esta imagem de maior ampliação na região encaixotada da imagem anterior mostra as células que expressam GFP em detalhes.

Essas imagens de contraste de fase mostram um exemplo de divisão celular. O arredondamento das células progenitoras é visto aqui, seguido pela constrição da membrana celular e, por último, pela conclusão da mitose. Este é um exemplo de uma única árvore de linhagem celular.

As setas coloridas indicam diferentes modos de divisão celular, a divisão proliferativa simétrica é mostrada pela seta amarela. A divisão assimétrica é indicada pela seta azul. A divisão terminal simétrica é mostrada pela seta vermelha e o X indica a morte celular.

Os números indicam a duração do ciclo celular das células progenitoras. Essa técnica pode ser feita em uma a duas horas se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como mostrar o comportamento celular durante a progressão da linhagem celular de células-tronco para neurônios ou células gliais.