Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos
7 de julho de 2017
Nós fornecemos protocolos simples e robustos para o processamento de materiais de biópsia de várias espécies, embriões de organismos modelo biomédico e amostras de outros tecidos orgânicos para permitir a geração de dados de volume digital com o método de microscopia episcópica de alta resolução.
O objetivo geral deste procedimento é gerar dados de volume digital de materiais orgânicos. Exemplos são embriões e tecidos embrionários de organismos modelo biomédicos, blocos de tecido colhidos de animais adultos e humanos, incluindo biópsias de pele ou músculo e materiais como papel não revestido e substitutos da pele. O HREM ajuda a responder a questões fundamentais nos campos da medicina e da pesquisa biomédica.
Permite a análise tridimensional e a visualização de órgãos e tecidos de, por exemplo, embriões de camundongos geneticamente modificados ou embriões de pintinhos manipulados. Também permite a análise de modelos de câncer, bem como biópsias retiradas de tecidos humanos ou animais. A principal vantagem do HREM é que ele fornece uma maneira simples de gerar pilhas de imagens com qualidade quase histológica.
A implicação dessa técnica se estende à pesquisa de cicatrização de feridas usando modelos animais, bem como tecendo e consertando patologias teciduais em humanos. Demonstrando o procedimento estarão a BMR Marlene Rodler e Johannes Gunther. Ambos da Universidade Médica de Viena, Divisão de Anatomia.
Comece com embriões fixos ou tecido embrionário de no máximo 5 x 5 x 5 mililitros cúbicos. Remova o fixador. E adicione PBS.
Lave a quatro graus Celsius com balanço constante por 24 horas. Adicione 70% de etanol aos tubos que contêm o tecido e coloque as amostras em um rotador a quatro graus Celsius. Após duas a três horas, continuar a desidratar as amostras em soluções de etanol de concentração crescente por duas a três horas de cada vez.
Enquanto as amostras desidratam, prepare a solução de infiltração adicionando 0,3125 gramas de peróxido de benzoíla e 0,1 gramas de ESN a 25 mililitros de solução A em um béquer. Agite em uma placa de agitação magnética a quatro graus Celsius por duas a três horas até que o ESN e o catalisador estejam totalmente dissolvidos. Coloque as amostras em solução de infiltração.
E agite ou gire as amostras por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius. Comece preparando a solução de incorporação. Adicione um mililitro ou solução B a 25 mililitros de solução de infiltração fresca.
Depois de preparar as bandejas de copo de moldagem, preencha a cavidade profunda dos moldes com solução de incorporação. Transfira as amostras para os moldes usando uma colher. Certifique-se de que a amostra esteja totalmente coberta com solução de incorporação para evitar o aprisionamento de ar.
Oriente a amostra dentro do molde usando agulhas ou pinças. É fundamental otimizar a orientação da amostra durante a incorporação e marcar sua posição precisa na superfície do bloco. Desta forma, a região de interesse pode ser mantida pequena e a objetiva com a maior ampliação possível pode ser usada.
Assim que a solução de embutir começar a ficar viscosa, coloque um porta-blocos em cima do molde e adicione a solução de embutimento através do orifício central do porta-blocos até que a solução de embutimento suba de um a dois milímetros acima da base do porta-blocos. Sele a bandeja do copo de moldagem cobrindo-a com cera de parafina líquida e espere até que esteja endurecida antes de movê-la. Deixe os blocos terminarem a polimerização armazenando as bandejas de copos de moldagem seladas por um a dois dias em temperatura ambiente.
Para o processamento de pós-polimerização, coloque as bandejas de copos de moldagem com os blocos polimerizados em um forno de laboratório padrão e asse a 70 a 80 graus Celsius por no mínimo um a dois dias. Remova os blocos dos moldes. Em seguida, identifique o campo de visão direcionando a luz branca obliquamente para a superfície do bloco.
Trace a sombra da amostra com o marcador preto na superfície do bloco. Monte o bloco de resina com o campo de visão indicado no micrótomo e mova o suporte do bloco para sua posição de parada. Inicie a câmera digital e o software de geração de dados e adquira uma imagem ao vivo.
Escolha uma objetiva com ampliação apropriada para cobrir a região de interesse. Mova a óptica para cima e para baixo e o micrótomo lateralmente até que a região de interesse corresponda ao campo de visão exibido na tela do computador. Secione o bloco até que as primeiras estruturas da amostra se tornem visíveis.
Mova o micrótomo para organizar a superfície do bloco no plano focal da ótica. Escolha uma espessura de seção entre 0,5 a cinco mícrons. Depois de configurar o software de acordo com as instruções do fabricante, inicie o software e inicie a captura de dados.
Esta imagem de seção HREM mostra uma seção sagital através de um embrião de camundongo colhido no dia embrionário 9.5. Este modelo 3D renderizado em volume mostra a superfície deste embrião. Esta imagem mostra uma seção sagital virtual através de um modelo renderizado em volume do pescoço do embrião de camundongo colhido no dia embrionário 15.5.
O modelo de superfície destaca o lúmen do sistema cardiovascular em uma renderização de volume de todos os tecidos de um embrião de galinha, um desenvolvimento de Hamburger Hamilton Estágio 18. Esta imagem mostra uma seção HREM através de um nervo humano. A incrustação amplia a seção desta imagem.
Esta imagem mostra parte de uma imagem de seção HREM através do fígado suíno. Esta imagem mostra um modelo 3D renderizado em volume de uma biópsia retirada de um polegar humano. Esta imagem mostra os modelos renderizados na superfície de artérias, veias e nervos dérmicos em frente a uma ressecção virtual por meio de dados HREM.
Esta animação mostra um modelo renderizado em volume de pele grossa de uma almofada de polegar humana. Diferentes limiares e, portanto, diferentes estruturas dérmicas, como vasos sanguíneos, fibras nervosas, glândulas sudoríparas e ductos das glândulas sudoríparas. O HREM permite a visualização rápida da arquitetura do material fibroso.
Esta imagem mostra um modelo renderizado em volume de material substituto dérmico nativo. Esta animação mostra o modelo renderizado de volume do material substituto dérmico. Observe a forma diferente e o calibre das fibras.
As amostras precisam ser desidratadas, infiltradas e incorporadas em resina, de modo que todo o procedimento pode levar vários dias, mas inclui apenas duas a três horas de trabalho operacional para preparar soluções, trocar soluções e assim por diante. A geração de dados em si é totalmente automatizada no aparelho HREM e 1000 imagens podem ser produzidas em duas a três horas. Após seu desenvolvimento, o HREM abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento pontuarem com precisão o fenótipo de embriões de camundongos mutantes.
Um exemplo são os mecanismos de decifração de distúrbios do desenvolvimento ou projeto DMDD, onde HREM é usado fenotipagem, embriões de camundongos embrionariamente letais em detalhes ainda desconhecidos. Descobriu-se que o HREM também é uma excelente alternativa à microscopia de luz posicional para examinar vasos sanguíneos, nervos ou arquitetura de fibras em amostras de tecido humano.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para o processamento de materiais de biópsia e tecidos orgânicos com o objetivo de gerar dados de volume digital utilizando microscopia episcópica de alta resolução (HREM). O método permite a visualização e análise tridimensionais de diversas amostras biológicas, incluindo embriões e biópsias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa biomédica
- Histologia
- Técnicas de microscopia
Contexto
- A MREH fornece imagens de qualidade próxima à histológica.
- É aplicável a diversos materiais orgânicos, incluindo tecidos humanos e animais.
- A técnica auxilia na compreensão de questões médicas fundamentais.
- Apoia pesquisas em áreas como cicatrização de feridas e modelos de câncer.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver protocolos robustos para o processamento de tecidos.
- Facilitar a geração de dados volumétricos digitais de alta resolução.
- Aprimorar a análise tridimensional de amostras biológicas.
Métodos Utilizados
- Desidratação e infiltração de amostras de tecido.
- Inclusão de amostras em resina para corte.
- Utilização de um micrótomo para corte preciso.
- Captura automatizada de dados para geração de pilhas de imagens.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de modelos 3D a partir de diversos tipos de tecidos.
- Visualização de estruturas complexas, como vasos sanguíneos e nervos.
- Demonstração da técnica em tecidos de camundongo e humanos.
- Aquisição rápida de imagens com saída de alta qualidade.
Conclusões
- A MREH é uma ferramenta valiosa para a pesquisa biomédica.
- Os protocolos estabelecidos são simples e eficazes.
- Este método aprimora a compreensão da arquitetura tecidual.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia episcópica de alta resolução (HREM) permite que equipes de P&D biofarmacêuticas gerem dados tridimensionais em volume de qualidade próxima à histológica a partir de espécimes orgânicos, auxiliando na redução de riscos mecanicistas no estágio inicial de descoberta. O método fornece confiança preditiva na validação de alvos ao permitir a visualização de arquiteturas teciduais complexas, como vasculatura e inervação, em modelos relevantes para doenças. Essa capacidade auxilia na triagem de portfólios ao reduzir ambiguidades biológicas na seleção de candidatos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização tridimensional de estruturas organotípicas em embriões geneticamente modificados e biópsias humanas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao esclarecer as relações espaciais em modelos de patologia tecidual.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na identificação de compostos líderes mediante a fenotipagem de modelos letais embrionários com detalhamento subcelular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz dados padronizados e reprodutíveis de volume digital, permitindo comparação quantitativa entre diferentes condições experimentais.
- Valor Operacional: Facilita a preparação de ensaios por meio da captura automatizada de imagens, gerando mais de 1000 seções alinhadas em 2 a 3 horas.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diversos materiais orgânicos, incluindo embriões, biópsias e biomateriais fibrosos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e fluxos de trabalho pré-clínicos ao permitir o seccionamento virtual e a modelagem tridimensional de biópsias de tecido humano e modelos animais de doenças.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia o desenvolvimento translacional de biomarcadores mediante a visualização de fenótipos estruturais em modelos de cicatrização de feridas e câncer.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados arquitetônicos de alta fidelidade para desoneração mecanicista.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A MREH integra-se ao continuum de descoberta, desde a biologia inicial até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, fornecendo leituras quantitativas tridimensionais que apoiam a verificação de hipóteses e a análise de vias.
- Biologia da Descoberta: Permite testes de hipóteses e desvio biológico por meio do fenotipagem tridimensional de embriões mutantes e modelos de doenças.
- Triagem: Fornece pilhas de imagens prontas para ensaios, reprodutíveis e de qualidade próxima à histológica, para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera saídas quantitativas volumétricas e renderizadas por superfície que permitem às equipes comparar fenótipos estruturais entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da visualização tridimensional de biópsias humanas e arquiteturas de tecidos animais.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a diversos tipos de espécimes orgânicos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva na validação de alvos por meio da visualização tridimensional de alta resolução da microestrutura tecidual.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da captura automatizada de dados e do alinhamento intrínseco das imagens.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados por meio da eliminação precoce de riscos mecanicistas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em risco ao fornecer leituras estruturais claras para decisões de prosseguir ou interromper.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em histologia, processamento de tecidos e microscopia para o preparo e orientação ideais das amostras.
- Depende de infraestrutura com micrótomo, câmera de vídeo digital e software de visualização 3D para a geração de dados.
- Necessita padronização entre equipes na orientação do inclusão e na marcação da região de interesse para resultados consistentes.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes sistemas modelo devido a variações no tamanho, densidade e propriedades de coloração dos tecidos.
- Limitado pelas dimensões da amostra (até 5x5x7 mm) e pela faixa de espessura das secções (0,5–5 μm), o que pode restringir a aplicação em órgãos maiores.
