Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos

O objetivo geral deste procedimento é gerar dados de volume digital de materiais orgânicos. Exemplos são embriões e tecidos embrionários de organismos modelo biomédicos, blocos de tecido colhidos de animais adultos e humanos, incluindo biópsias de pele ou músculo e materiais como papel não revestido e substitutos da pele. O HREM ajuda a responder a questões fundamentais nos campos da medicina e da pesquisa biomédica.

Permite a análise tridimensional e a visualização de órgãos e tecidos de, por exemplo, embriões de camundongos geneticamente modificados ou embriões de pintinhos manipulados. Também permite a análise de modelos de câncer, bem como biópsias retiradas de tecidos humanos ou animais. A principal vantagem do HREM é que ele fornece uma maneira simples de gerar pilhas de imagens com qualidade quase histológica.

A implicação dessa técnica se estende à pesquisa de cicatrização de feridas usando modelos animais, bem como tecendo e consertando patologias teciduais em humanos. Demonstrando o procedimento estarão a BMR Marlene Rodler e Johannes Gunther. Ambos da Universidade Médica de Viena, Divisão de Anatomia.

Comece com embriões fixos ou tecido embrionário de no máximo 5 x 5 x 5 mililitros cúbicos. Remova o fixador. E adicione PBS.

Lave a quatro graus Celsius com balanço constante por 24 horas. Adicione 70% de etanol aos tubos que contêm o tecido e coloque as amostras em um rotador a quatro graus Celsius. Após duas a três horas, continuar a desidratar as amostras em soluções de etanol de concentração crescente por duas a três horas de cada vez.

Enquanto as amostras desidratam, prepare a solução de infiltração adicionando 0,3125 gramas de peróxido de benzoíla e 0,1 gramas de ESN a 25 mililitros de solução A em um béquer. Agite em uma placa de agitação magnética a quatro graus Celsius por duas a três horas até que o ESN e o catalisador estejam totalmente dissolvidos. Coloque as amostras em solução de infiltração.

E agite ou gire as amostras por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius. Comece preparando a solução de incorporação. Adicione um mililitro ou solução B a 25 mililitros de solução de infiltração fresca.

Depois de preparar as bandejas de copo de moldagem, preencha a cavidade profunda dos moldes com solução de incorporação. Transfira as amostras para os moldes usando uma colher. Certifique-se de que a amostra esteja totalmente coberta com solução de incorporação para evitar o aprisionamento de ar.

Oriente a amostra dentro do molde usando agulhas ou pinças. É fundamental otimizar a orientação da amostra durante a incorporação e marcar sua posição precisa na superfície do bloco. Desta forma, a região de interesse pode ser mantida pequena e a objetiva com a maior ampliação possível pode ser usada.

Assim que a solução de embutir começar a ficar viscosa, coloque um porta-blocos em cima do molde e adicione a solução de embutimento através do orifício central do porta-blocos até que a solução de embutimento suba de um a dois milímetros acima da base do porta-blocos. Sele a bandeja do copo de moldagem cobrindo-a com cera de parafina líquida e espere até que esteja endurecida antes de movê-la. Deixe os blocos terminarem a polimerização armazenando as bandejas de copos de moldagem seladas por um a dois dias em temperatura ambiente.

Para o processamento de pós-polimerização, coloque as bandejas de copos de moldagem com os blocos polimerizados em um forno de laboratório padrão e asse a 70 a 80 graus Celsius por no mínimo um a dois dias. Remova os blocos dos moldes. Em seguida, identifique o campo de visão direcionando a luz branca obliquamente para a superfície do bloco.

Trace a sombra da amostra com o marcador preto na superfície do bloco. Monte o bloco de resina com o campo de visão indicado no micrótomo e mova o suporte do bloco para sua posição de parada. Inicie a câmera digital e o software de geração de dados e adquira uma imagem ao vivo.

Escolha uma objetiva com ampliação apropriada para cobrir a região de interesse. Mova a óptica para cima e para baixo e o micrótomo lateralmente até que a região de interesse corresponda ao campo de visão exibido na tela do computador. Secione o bloco até que as primeiras estruturas da amostra se tornem visíveis.

Mova o micrótomo para organizar a superfície do bloco no plano focal da ótica. Escolha uma espessura de seção entre 0,5 a cinco mícrons. Depois de configurar o software de acordo com as instruções do fabricante, inicie o software e inicie a captura de dados.

Esta imagem de seção HREM mostra uma seção sagital através de um embrião de camundongo colhido no dia embrionário 9.5. Este modelo 3D renderizado em volume mostra a superfície deste embrião. Esta imagem mostra uma seção sagital virtual através de um modelo renderizado em volume do pescoço do embrião de camundongo colhido no dia embrionário 15.5.

O modelo de superfície destaca o lúmen do sistema cardiovascular em uma renderização de volume de todos os tecidos de um embrião de galinha, um desenvolvimento de Hamburger Hamilton Estágio 18. Esta imagem mostra uma seção HREM através de um nervo humano. A incrustação amplia a seção desta imagem.

Esta imagem mostra parte de uma imagem de seção HREM através do fígado suíno. Esta imagem mostra um modelo 3D renderizado em volume de uma biópsia retirada de um polegar humano. Esta imagem mostra os modelos renderizados na superfície de artérias, veias e nervos dérmicos em frente a uma ressecção virtual por meio de dados HREM.

Esta animação mostra um modelo renderizado em volume de pele grossa de uma almofada de polegar humana. Diferentes limiares e, portanto, diferentes estruturas dérmicas, como vasos sanguíneos, fibras nervosas, glândulas sudoríparas e ductos das glândulas sudoríparas. O HREM permite a visualização rápida da arquitetura do material fibroso.

Esta imagem mostra um modelo renderizado em volume de material substituto dérmico nativo. Esta animação mostra o modelo renderizado de volume do material substituto dérmico. Observe a forma diferente e o calibre das fibras.

As amostras precisam ser desidratadas, infiltradas e incorporadas em resina, de modo que todo o procedimento pode levar vários dias, mas inclui apenas duas a três horas de trabalho operacional para preparar soluções, trocar soluções e assim por diante. A geração de dados em si é totalmente automatizada no aparelho HREM e 1000 imagens podem ser produzidas em duas a três horas. Após seu desenvolvimento, o HREM abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento pontuarem com precisão o fenótipo de embriões de camundongos mutantes.

Um exemplo são os mecanismos de decifração de distúrbios do desenvolvimento ou projeto DMDD, onde HREM é usado fenotipagem, embriões de camundongos embrionariamente letais em detalhes ainda desconhecidos. Descobriu-se que o HREM também é uma excelente alternativa à microscopia de luz posicional para examinar vasos sanguíneos, nervos ou arquitetura de fibras em amostras de tecido humano.