Name: Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a gerar dados volumétricos digitais de alta resolução usando microscopia episcópica (HREM) para análise tridimensional de tecidos biológicos, embriões e biópsias. Este método robusto permite visualizar arquitetura tecidual com qualidade próxima à histológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem Tim Mohun por suas contribuições invalubale no desenvolvimento de HREM e Petra Heffeter para fornecer amostras.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com diretrizes éticas na Universidade Médica de Viena. 1. Preparação da amostra <ol><li> Preparando embriões e tecidos embrionários (até 5 x 5 x 5 mm 3 ) <ol><li> Corrija os embriões ou partes dos embriões em 4% de PFA / PBS ou fixador de Bouin a 4 ° C durante pelo menos 16 a 24 h sob balanço constante. NOTA: podem ser utilizados embriões de várias espécies e de vários estádios de desenvolvimento, como peixe-zebra de 48 h, pintainho e codorna de 19 h, e também embriões de rato pré-natal, que foram utilizados aqui (ver resultados representativos ). Os espécimes foram colhidos e transferidos para PBS à temperatura ambiente para estadiamento, antes de serem colocados em fixador. Se necessário, corte os espécimes com micro-tesoura ou bisturis antes da fixação para encaixar nos moldes de encaixe. </li><li> Remova o fixador e lave o tecido embrionário em PBS a 4 ° C sob rocha constanteG por 24 h (2-3 mudanças). </li><li> Desidratar as amostras em 70%, 80%, 90%, 96% de etanol a 4 ° C durante 2 a 3 h cada. Coloque tubos contendo as amostras em um rotador. NOTA: Para pequenas amostras (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ), o tempo que uma amostra repousa em cada etanol pode ser reduzido para 60 min. Para grandes amostras (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ), pode ser estendido para 4 h. </li><li> Execute as seguintes etapas de infiltração sob uma chaminé com luvas de proteção. <ol><li> Prepare a solução de infiltração adicionando 1,25 g de peróxido de benzoílo (catalisador plastificado) e 0,4 g de eosina a 100 mL de solução A (para mais detalhes, ver Tabela de Materiais ). Mexa-o num copo numa placa de agitação magnética a 4 ° C até que a eosina e o catalisador estejam completamente dissolvidos (2 a 3 h). </li><li> Coloque as amostras durante 12 a 24 h na solução de infiltração. Mantenha-o a 4 ° C sob balanço contínuo ou rotação. Substitua a solução de infiltração com solução fresca após 3 e 12H. NOTA: Estenda o tempo de infiltração para 48 h para grandes embriões (&gt; 1 cm de coroa / comprimento de nádega). </li></ol></li></ol></li><li> Preparando amostras de tecidos adultos (até 5 x 5 x 7 mm 3 ) <ol><li> Corrigir os tecidos em 2% de PFA / PBS contendo 4% de ácido carbólico a 4 ° C durante pelo menos 3 dias. NOTA: A amostra de tecido proveniente de pele, fígado, pâncreas, rim, tireóide, coração, músculo estriado, cérebro, nervos e modelos tumorais de vários humanos, roedores, porcos, moscas da fruta e peixes neonatais e adultos podem ser consertados nesta solução E depois processados ​​para imagens HREM (demonstramos a fixação das amostras, ver resultados representativos ). Esqueça as amostras de tecido com bisturis, tesouras ou socos de biópsia e transfira-os diretamente para o fixador. Para fixação de tecido nervoso, 4% de PFA / PBS. </li><li> Remova o fixador e lave o tecido sob a água da torneira durante 3-6 h. </li><li> Desidratar as amostras posteriormenteEm 70%, 80%, 90%, 96% de etanol, misturado com 0,4 g de eosina por 100 mL (2 a 3 h cada). Mantenha as soluções com amostras a 4 ° C sob balanço constante ou em um rotador. NOTA: Para pequenas amostras (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ), o tempo que uma amostra repousa em cada etanol pode ser reduzido para 60 min. Para grandes amostras (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ), pode ser prolongado para 4-8 h. </li><li> Execute todas as seguintes etapas de infiltração sob uma chaminé com luvas de proteção. <ol><li> Prepare a solução de infiltração adicionando 1,25 g de peróxido de benzoílo (catalisador plastificado) e 0,4 g de eosina a 100 mL de Solução A (para mais detalhes, ver Tabela de Materiais ). Agitar um copo numa placa de agitação magnética a 4 ° C até a eosina e o catalisador serem totalmente dissolvidos (2 a 3 h). </li><li> Coloque as amostras na solução de infiltração durante 24 a 36 h. Mantenha-o a 4 ° C sob balanço contínuo ou rotação. Substitua a solução de infiltração por solução fresca após 3 e12 h. NOTA: Para grandes amostras (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ), estenda o tempo de infiltração até 48 h. </li></ol></li></ol></li><li> Preparando outro material orgânico NOTA: Corte os substitutos da pele e o papel com o tamanho desejado com uma tesoura comum. Não é necessária nenhuma fixação. <ol><li> Passo de fixação, lavagem e desidratação. </li><li> Execute todas as seguintes etapas de infiltração sob uma chaminé com luvas de proteção. <ol><li> Prepare a solução de infiltração adicionando 1,25 g de peróxido de benzoílo (catalisador plastificado) e 0,4 g de eosina a 100 mL de Solução A (para mais detalhes, ver Tabela de Materiais ). Acrescente uma taça a 4 ° C numa placa de agitação magnética até que a eosina e o catalisador estejam totalmente dissolvidos (2 a 3 h). </li><li> Coloque amostras em solução de infiltração por 3-12 h. Mantenha-o a 4 ° C sob balanço contínuo ou rotação. Substitua a solução de infiltração com solução fresca após 1 e 2 - 4 h. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. Incorporação NOTA: Execute todas as etapas sob uma chaminé com luvas de proteção. <ol><li> Prepare a solução de infiltração fresca conforme descrito acima (etapa 1.1.4.1). Adicione 4 mL de Solução B (para detalhes, veja Tabela de Materiais ) a 100 mL de solução de infiltração para preparar a solução de incorporação. NOTA: Se for necessária uma orientação precisa da amostra nos moldes de incorporação e permitir a incorporação de várias amostras em paralelo, diminua a polimerização da solução de reserva colocando o copo em um banho de gelo. </li><li> Use moldes para copos (para detalhes, veja Tabela de Materiais ) com moldes com um volume de rotina de 6 x 8 x 5 mm 3 ou 13 x 19 x 5 mm 3 , ou moldes personalizados com volumes de até 8 x 10 x 15 mm 3 ( Figura 2 ). </li><li> Encha os moldes com solução de encaixe e transfira a amostra para o molde usandouma colher. Durante a transferência assegure-se de que a amostra esteja totalmente coberta com solução de encaixe para evitar a captura de ar. NOTA: Isso pode ser feito a temperatura ambiente, se iniciado imediatamente após a coleta das amostras e a solução de encaixe da geladeira. <ol><li> Oriente a amostra dentro do molde usando agulhas ou fórceps. </li><li> Assim que a solução de incorporação começar a tornar-se viscosa, coloque um suporte de bloco (veja Tabela de Materiais ) em cima do molde e adicione solução de encaixe através do furo central do suporte do bloco até a base do suporte do bloco ser coberta com 1 - 2 Mm de solução de encaixe. </li><li> Selar a bandeja do copo de moldagem, cobri-la com parafina líquida e aguardar até que ela se endureça. Alternativamente, coloque uma segunda bandeja de copo de moldagem de cabeça para baixo na bandeja do copo de moldagem com amostras e selá-la com fita adesiva para a prova de ar. </li></ol></li><li> Permita que os blocos terminem a polimerização armazenando as bandejas de copos de moldagem seladas para 1 -2 dias à temperatura ambiente. </li><li> Para o processamento pós-polimerização, coloque as bandejas dos copos de moldagem com os blocos polimerizados em um forno de laboratório padrão e asse em 70 a 80 ° C por um período mínimo de 1 a 2 dias até ficar vermelho escuro. Colete as bandejas do forno e remova os blocos do molde. NOTA: O cozimento pode ser feito em condições ambientais normais. A bandeja de copos de moldagem de cobertura, que garante a vedação a prova de ar na primeira fase após a incorporação, pode ser removida para permitir a verificação da cor da resina após 10 h. Imediatamente após o cozimento, a resina é macia e os blocos podem ser facilmente removidos da bandeja do copo de moldagem. Dentro de 2 a 3 horas são difíceis e podem ser armazenados à temperatura ambiente por vários meses. </li></ol> 3. Geração de dados NOTA: O protótipo HREM 18 , 25 usado aqui compreende os seguintes itens: (i) Microtome rotativo com um suporte de blocoQue pára após cada corte em seu ponto de viragem superior. (Ii) Faca de micrótomo padrão não descartavel, metal duro, perfil D (para detalhes, veja Tabela de Materiais ). (Iii) Cabeça de microscópio composto de fluorescência com revólver de objetivo e um cubo de filtro GFP (excitação 470/40; filtro de emissão 525/50) em seu eixo óptico. O eixo óptico é organizado perpendicularmente à superfície recém-cortada de um bloco montado no microtomo e é mantido por um dispositivo que permite movimento ascendente e descendente. (Iv) Mesa cruzada motorizada que transporta o microtome. A tabela pode ser deslocada na direção do eixo óptico e lateralmente. (V) Câmera de vídeo digital anexada ao microscópio composto fluorescente. (Vi) Fonte de luz monocromática (470 nm). (Vii) Computador conectado à câmera, com software de geração de dados (para detalhes, veja Tabela de Materiais ). <ol><li> Procedimento <ol><li> Indique a região de interesse. <ol><li> Use o laboratório padrão liGht source (veja Tabela de Materiais ) para dirigir a luz branca obliquamente para a superfície do bloco. </li><li> Identifique os contornos do material incorporado à medida que ele se projeta na superfície do bloco. Indique a região de interesse e posterior campo de visão na superfície do bloco usando uma caneta ou lâmina de barbear. NOTA: Esta etapa é obrigatória para definir a extensão do campo de visão antes da seção. </li></ol></li><li> Defina o campo de visão. <ol><li> Monte o bloco de resina com amostra no microtomo. </li><li> Mova o suporte do bloco para sua posição de parada (ponto de rotação superior da excursão do suporte do bloco). </li><li> Inicie a câmera digital e o software de geração de dados, e adquira uma imagem ao vivo. </li><li> Escolha uma lente objetiva, com uma ampliação adequada para cobrir a região de interesse indicada na superfície do bloco. NOTA: Objetivos com ampliação 2.5X, 5X, 10X, 20X e aberturas numéricas entre 0,07 e 0,40 são comumente usados. </li&gt; <li> Mova a óptica para cima e para baixo e o micrótomo lateralmente usando a mesa cruzada motorizada até a região de interesse corresponder ao campo de exibição exibido na tela do computador. </li></ol></li><li> Foco. <ol><li> Execute a seção manual passo a passo até que as primeiras estruturas da amostra se tornem visíveis. </li><li> Organize a superfície do bloco no plano de foco da óptica, movendo o microtome na direção do eixo óptico. </li><li> Escolha a espessura da seção; Recomenda-se espessuras de seção de 0,5 a 5 μm. </li></ol></li></ol></li><li> Geração e processamento de dados <ol><li> Inicie a rotina de software que orquestra a seção e a captura de imagens. Siga as instruções documentadas do software de captura de imagens. </li><li> Pare a rotina do software e coloque um slide de escala na frente da superfície do bloco assim que a amostra estiver completamente seccionada. </li><li> Capture uma imagem de forma interativa para calibração posteriorÇão. NOTA: Isso deve ser feito sempre que um objetivo é usado em uma configuração recentemente organizada. </li><li> Converta a série de imagens para imagens de escala de cinza de 8 bits no formato .jpg. </li><li> Carregue séries de imagens no software de visualização 3D e ajuste os contrastes. NOTA: A conversão de imagens e a visualização 3D podem ser feitas com vários pacotes de software padrão comercial ou livremente disponíveis, seguindo as instruções do respectivo software. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+laser+mass+spectrometry+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution laser mass spectrometry bioimaging.</a> Methods. 104, 118-126 (2016).</li>
<li>Holzlechner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Characterization+of+Tissue-Resident+Immune+Cells+by+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging.</a> J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).</li>
<li>Elsayad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrally+coded+optical+nanosectioning+%28SpecON%29+with+biocompatible+metal-dielectric-coated+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).</li>
<li>Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+normal+anatomy%2C+and+neural+and+adrenal+malformations+in+mouse+embryos+using+magnetic+resonance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy.</a> J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+new+tool+for+studying+embryo+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy.</a> J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+A+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+high-resolution+imaging+of+mouse+development+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero.</a> J Biomed Opt. 16 (4), 046004(2011).</li>
<li>Zhang, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+photoacoustic+and+optical+coherence+tomography+scanner+using+an+all+optical+detection+scheme+for+3D+morphological+skin+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging.</a> Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).</li>
<li>Singh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability%2C+usability%2C+and+limitations+of+murine+embryonic+imaging+with+optical+coherence+tomography+and+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography.</a> Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).</li>
<li>Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+episcopic+method+for+rapid+3-D+reconstruction%3A+applications+in+anatomy+and+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology.</a> Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+transgenic+embryos%3A+a+rapid+3-D+screening+method+based+on+episcopic+fluorescence+image+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing.</a> Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).</li>
<li>Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Reconstructing embryonic development.</a> Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micro-MRI+analysis+of+cerebral+artery+development+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos.</a> Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+modality+optical+coherence+and+whole-body+photoacoustic+tomography+imaging+of+chick+embryos+in+multiple+development+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages.</a> Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+heart+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The morphology of heart development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+episcopic+microscopy%3A+a+rapid+technique+for+high+detailed+3D+analysis+of+gene+activity+in+the+context+of+tissue+architecture+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol%22%5BJournal%5D)">High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology.</a> Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+Embryos+for+High-Resolution+Episcopic+Microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).</li>
<li>Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vertebrate+embryos+with+episcopic+3D+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques.</a> ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).</li>
<li>Bruneel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+zebrafish+dentition%3A+from+traditional+approaches+to+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies.</a> Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bloomsbury+report+on+mouse+embryo+phenotyping%3A+recommendations+from+the+IMPC+workshop+on+embryonic+lethal+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening.</a> Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).</li>
<li>Heddleston, J. M., Chew, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopes%3A+Novel+imaging+toolbox+for+visualizing+life%27s+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes.</a> Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).</li>
<li>Powell, K. A., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+imaging+modalities+for+phenotyping+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice.</a> Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).</li>
<li>Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ingentaconnect.com/content/ben/cbiot/2012/00000001/00000004/art00002">High resolution episcopic microscopy - current applications.</a> Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+diameters+of+the+great+arteries+and+semi-lunar+valves+of+chick+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos.</a> J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).</li>
<li>Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="https://www.growkudos.com/publications/10.2174%252F1877609401204010001">Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain.</a> The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Episcopic+Microscopy+Data-Based+Measurements+of+the+Arteries+of+Mouse+Embryos%3A+Evaluation+of+Significance+and+Reproducibility+under+Routine+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions.</a> Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).</li>
<li>Geyer, S. H., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+Mice+Feature+5th+Pharyngeal+Arch+Arteries+and+Double-Lumen+Aortic+Arch+Malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations.</a> Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).</li>
<li>Kee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+finger+protein+inhibits+muscle+differentiation+by+modulating+serum+response+factor+and+enhancer+of+polycomb1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1.</a> Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).</li>
<li>Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dermal+arteries+of+the+human+thumb+pad%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The dermal arteries of the human thumb pad.</a> J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).</li>
<li>Geyer, S. H., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metric+characterization+of+the+aortic+arch+of+early+mouse+fetuses+and+of+a+fetus+featuring+a+double+lumen+aortic+arch+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation.</a> Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).</li>
<li>Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chick+Embryo+With+a+yet+Unclassified+Type+of+Cephalothoracopagus+Malformation+and+a+Hypothesis+for+Explaining+its+Genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Histol+Embryol%22%5BJournal%5D)">A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis.</a> Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).</li>
<li>Geyer, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Episcopic+Microscopy+%28HREM%29%3A+A+Tool+for+Visualizing+Skin+Biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies.</a> Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).</li>
<li>Geyer, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+episcopic+microscopy+%28HREM%29%3A+A+useful+technique+for+research+in+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care.</a> Ann Anat. 197, 3-10 (2015).</li>
<li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).</li>
<li>Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+anatomy+and+patterning+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The dynamic anatomy and patterning of skin.</a> Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).</li>
<li>Jenner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryogenesis+of+the+equine+femorotibial+joint%3A+The+equine+interzone%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone.</a> Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).</li>
<li>Wiedner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+dermal+matrix+and+autologous+split-thickness+skin+graft+transplantation+in+a+porcine+wound+model%3A+a+three-dimensional+histological+analysis+of+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization.</a> Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).</li>
<li>Mohun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Mechanisms+of+Developmental+Disorders+%28DMDD%29%3A+a+new+programme+for+phenotyping+embryonic+lethal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice.</a> Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).</li>
<li>Wilson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+variable+penetrance+of+abnormal+phenotypes+in+embryonic+lethal+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Res%22%5BJournal%5D)">Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice.</a> Wellcome Open Res. 1, 1(2016).</li>
<li>Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+mechanisms+of+developmental+disorders%3A+phenotype+analysis+of+embryos+from+mutant+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines.</a> Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).</li>
<li>Dickinson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+novel+developmental+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of novel developmental phenotypes.</a> Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).</li>
<li>Pieles, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microMRI-HREM+pipeline+for+high-throughput%2C+high-resolution+phenotyping+of+murine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos.</a> J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).</li>
<li>Weninger, W. J., Geyer, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+3D+Imaging+Methods%3A+Tools+for+Researching+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function.</a> Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).</li>
<li>Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://dmdd.org.uk/">https://dmdd.org.uk/</a> (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

HREM é um método microscópico altamente robusto que é ideal para visualizar um amplo espectro de materiais orgânicos utilizados em biomedicina e indústria 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37. 38 , 39 , 40 . Pode ser empregado como uma modalidade de imagem exclusiva, como atualmente usado pelo programa Mecanismos de Distúrbios do Desenvolvimento (DMDD) 41 , 42 <suP&gt;, 43 , 44 , ou como uma parte integrativa de pipelines de imagens multimodais 45 . Um aparelho de geração de dados HREM totalmente operacional pode ser montado a partir de componentes de laboratório convencionais e compreende um micrótomo motorizado, microscópio, mesa cruzada motorizada e um computador com software apropriado 25 . É fundamental usar um microtomo equipado com um suporte de bloco que pára de forma reprodutiva após cada seção em uma posição definida e cubos de filtro GFP dentro da via óptica. No entanto, soluções integrantes totalmente abrangentes podem ser compradas em empresas como a Indigo Scientific. HREM enfrenta as mesmas limitações que todas as técnicas histológicas, exceto que nenhum artefato é introduzido durante a seção ou a montagem da seção. No entanto, existem limitações, que resultam da necessidade de manchar amostras antes da seção eDas características do material de incorporação. A penetração de eosina através de todo o espécime é necessária para obter contrastes de tecido suficientes; Material muito denso, tecidos adiposos e substâncias anorganicas efetivamente impedem a penetração de eosina e isso resulta em tecidos não corados no centro dos objetos. O uso de fixadores especiais ajuda a manchar os espécimes da pele, mas ainda não existe um método adequado para superar o problema. Outra limitação é que as resinas que bloqueiam mais de 2 cm tendem a quebrar durante a seção. Isso pode ser parcialmente evitado cortando os espécimes e processando partes separadamente. O posicionamento correto de pequenas amostras ou amostras com superfícies irregulares nos moldes durante a incorporação é muitas vezes problemático. Cobrindo as amostras com agarose e processando os blocos de agarose, conforme descrito no protocolo, geralmente resolve essa questão 19 . Uma abordagem alternativa, que também ajuda a bloquear os blocos durante o sectioLigando, é remover o bloco já endurecido de seu suporte e incorporá-lo de novo, seguindo o procedimento de encadernação descrito. Um conjunto de dados HREM típico compreende 500 a 3.000 imagens individuais. Sua resolução numérica é determinada pela distância entre as imagens sucessivas ( ou seja , por espessura de seção), a característica do alvo da câmera e as propriedades da óptica utilizada. Utilizamos espessuras de seção entre 1 μm e 5 μm e conseguimos bons resultados, embora os protocolos apresentados não elimine completamente o brilho dos artefatos 20 , 46 . Esses artefatos são causados ​​por tecidos intensamente corados localizados profundamente dentro do bloco, resultando em desfocagem de informações de tecido sobre as superfícies do bloco. As câmeras tinham dimensões alvo de 2,560 x 1,920 pixels 2 , 2,048 x 2,048 pixels 2 e 4,096 x 4,096 pixels 2 e eram combiNed com lentes objetivas de 1.25X, 2.5X, 5X, 10X e 20X. Isso resultou em tamanhos de pixels numéricos entre 0,18 x 0,18 μm 2 e 5,92 x 5,92 μm 2 , o que se mostrou suficiente para a análise em 3D da arquitetura de tecido e formas de células, e mesmo para visualização de núcleos. Dada a alta resolução numérica, outras organelas celulares também devem ser visíveis. Os contrastes insuficientes devido à coloração simples de eosina e as propriedades ópticas dos objetivos reduzem dramaticamente a possibilidade de discriminar estruturas. A máxima resolução espacial máxima dos dados HREM, que leva em consideração a abertura numérica, é de aproximadamente 1 x 1 x 1 μm 3 e, portanto, só permite a discriminação efetiva de estruturas maiores do que aproximadamente 3 x 3 x 3 μm 3 . Um problema comum para todas as técnicas de imagem digital é a compensação entre o tamanho do campo de visão, que define a parte do espécime que pode ser exibidaD no alvo da câmera e a resolução numérica da imagem. Quanto maior o campo de visão, menor a resolução numérica máxima máxima 46 . A configuração HREM usada aqui permite a geração de dados HREM com um campo de visão entre 0,74 x 0,74 mm 2 (objetivo 20X) exibido em uma resolução numérica de 0,18 x 0,18 μm 2 e 12,12 x 12,12 mm 2 (objetivo de 1,25X) exibido em Uma resolução numérica de 2,96 x 2,96 μm 2 . As configurações alternativas e comercializadas podem fornecer campos maiores de visualizações, mas ao custo da resolução verdadeira. No entanto, eles fornecem excelentes resultados, como é óbvio a partir dos dados exibidos na página inicial do programa DMDD 47 .

A análise estrutural de materiais orgânicos e anorganicos é o primeiro passo para entender suas propriedades e funções físicas. A base para essa análise é, muitas vezes, a informação bidimensional (2D) obtida por observação cuidadosa de seções histológicas, com uma variedade de métodos de imagem simples e sofisticados que extraem detalhes de arquitetura de tecido, morfologia celular e topologia, composição molecular e propriedades biomecânicas 1 , 2 , 3 . No entanto, a informação em 2D não é adequada para pesquisar arranjos espacialmente complexos. Assim, um número crescente de métodos in vivo e ex vivo que permitem a geração de dados de volume digital foram estabelecidos nas últimas décadas 4 e muitos mais estão em desenvolvimento. O princípio metódico da maioria dos métodos de geração de dados de volume é a geração de pilhas virtuaisDe imagens digitais que exibem seções obtidas por trechos físicos ou virtuais de um objeto. Se as imagens da seção estiverem alinhadas corretamente, isso cria um volume, que pode ser re-seccionado em planos de seção virtual, ou usado para criar modelos 3D de superfície e volume renderizados. As técnicas populares para visualizar seres humanos e espécimes biológicos maiores são a tomografia por ressonância magnética (MRT), tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT). Os espécimes pequenos são geralmente visualizados usando imagens de ressonância micro-magnética (μMRI), tomografia de projeção óptica (OPT), tomografia de coerência óptica (OCT), tomografia fotoacústica (PAT), métodos baseados em secções histológicas, microscopia confocal e tomografia eletrónica 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Uma técnica de geração de dados de volume relativamente nova, que produz dados digitais de pequenos espécimes e amostras de tecido histológico, é o método HREM, que foi desenvolvido em estreita cooperação com Tim Mohun 18 , 19 . É uma técnica baseada em microscópio simples, que gera dados de volume digital de material incorporado em resina que é seccionado em um microtomo. Os dados facilitam a análise detalhada da arquitetura dos tecidos e das distribuições celulares, bem como a análise métrica de pequenos recursos em um nível microscópico microscópico intermediário. HREM produz pilhas de imagens digitais inerentemente alinhadas que aparecem como se fossem capturadas de eSeções histológicas manchadas com osina. O contraste de tecido e a resolução de dados em relação ao campo de visão excedem os dados produzidos com μCT, μMRI e OPT, mas são inferiores aos alcançáveis ​​com microscopia confocal, de chapa leve e eletrônica 20 . No entanto, em contraste com o último, o HREM é capaz de visualizar espécimes com volumes relativamente grandes de até 5 x 5 x 7 mm 3 em qualidade histológica. Uma série de estudos recentes fornecem caracterizações detalhadas e comparações de vantagens e desvantagens das técnicas de imagem única e, por uma questão de objetividade, nos referimos a informações adicionais sobre suas limitações e campos potenciais de aplicações 4 , 21 , 22 , 23 , 24 . Este estudo enfoca o método de imagem HREM e visa fornecerProtocolos muito simples para gerar dados HREM de um amplo espectro de materiais orgânicos, bem como exemplos de sua aplicação. O fluxo de trabalho para criar dados HREM é simples e aplica-se a todos os materiais que podem ser incorporados em resina de metacrilato ( Figura 1 ). No entanto, existem diferenças específicas de tecidos na preparação da amostra, que precisam ser consideradas. Fornecemos, portanto, três protocolos padrão para a preparação de várias amostras. As etapas de incorporação e protocolo de geração de dados são idênticas para todos eles.

<table><tbody><tr><td>O kit de incorporação JB-4 Plus</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>18570-1</td><td>inclui peróxido de benzoíla, plastificado (catalisador) e solução Bandejas</td></tr><tr><td>de copo de polietileno A+B, hexágono de 6 x 8 x 5 mm (9 cavidades)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177A-3</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de copo de polietileno, 13 x 19 x 5 mm (9 cavidades)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Suportes de bloco de plástico</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>15899-50</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Waldeck GmbH & Co. KG, Divisão Chroma</td><td>1A-196</td><td></td></tr><tr><td>Microtec CUT 4060E</td><td></td><td></td><td>micrótomo rotativo</td></tr><tr><td>Leica DM LM, microscópio composto de fluorescência</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros GFP</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td>11090937180000</td><td></td></tr><tr><td>Mesa cruzada motorizada</td><td>Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG</td><td>KT5-LSMA</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de vídeo digital SPOT-FLEX</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>precisExcite LED de alta potência</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>fonte de luz</td></tr><tr><td>VisiView 2.1.4</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>Faca</td></tr><tr><td>de metal duro (carboneto de tungstênio), perfil D</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KL 2500 LCD</td><td>Schott AG</td><td></td><td>fonte de luz</td></tr></tbody></table>

microscopia episcopática de alta resolução (hrem) - protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Nós fornecemos protocolos simples para gerar dados de volume digital com o método de microscopia episcópica de alta resolução (HREM). O HREM é capaz de imaginar materiais orgânicos com volumes até 5 x 5 x 7 mm 3 em resoluções numéricas típicas entre 1 x 1 x 1 e 5 x 5 x 5 μm 3 . Os espécimes são incorporados em resina de metacrilato e seccionados em um microtomo. Após cada seção, uma imagem da superfície do bloco é capturada com uma câmera de vídeo digital que fica no fototubo conectado à cabeça do microscópio composto. O eixo óptico passa através de um cubo de filtro de proteína fluorescente verde (GFP) e está alinhado com uma posição, na qual o braço do suporte da bomba fica em repouso após cada seção. Desta forma, são produzidas uma série de imagens digitais inerentemente alinhadas, que exibem superfícies de bloco subsequentes. Carregar tal série de imagens em software de visualização tridimensional (3D) facilita a conversão imediata para dados de volume digital, o que permite virtual sEm vários planos ortogonais e oblíquos e a criação de modelos computacionais de volume e superfície. Apresentamos três protocolos simples e específicos para o tecido para o processamento de vários grupos de espécimes orgânicos, incluindo embriões de peixes de rato, pintos, codornas e zebras, material de biópsia humana, papel não revestido e material de substituição da pele.

HREM gera séries de imagens digitais inerentemente alinhadas com contrastes semelhantes às imagens de seções histológicas manchadas de hematoxilina / eosina. Ao contrário das imagens de seção 2D, pilhas de imagens HREM permitem a visualização e análise da arquitetura de tecido, morfologia e topologia de uma ampla variedade de materiais orgânicos em 3D. O alto contraste muitas vezes facilita a visualização 3D rápida e simples de modelos computacionais volumosos e descobertas semiautomáticas do contorno para a geração de modelos renderizados de superfície. O tamanho dos dados HREM varia de acordo com o tamanho do alvo da câmera, o modo de captura de imagem (8, 12, 16 bits, escala de cinza, cor) eo número de imagens de face de bloco único. Conjuntos de dados menores de 1.000 imagens de escala de cinza de 8 bits.jpg de 2.048 pixels x 2.048 pixels têm um tamanho de cerca de 900 MB. Conjuntos de dados maiores de 3.000 imagens de escala de cinza de 8 bits.jpg de 4.096 pIxel x 4,096 pixels tem volumes de aproximadamente 20 GB. Os protocolos fornecidos são simples e robustos, e durante a última década, eles foram empregados para gerar dados HREM de diferentes espécimes. A seção de protocolo 1.1 foi otimizada para o processamento de embriões inteiros de organismos modelo biomédicos com um comprimento de até 1 cm e amostras de tecido embrionário com uma dimensão de até 5 x 5 x 5 mm 3 ; Usamos esse método para produzir dados HREM de embriões das seguintes espécies: mouse ( Mus musculus) , pintinho ( Gallus gallus ), peixe zebra ( Danio rerio ), codorna ( Coturnix coturnix) , sapo africano com garras ( Xenopus laevis ), cavalo ( Equus ferus caballus ), bug de amido de amendoa ( Oncopeltus fasciatus ), crocodilo ( Crocodylia ) e polvo ( Octopus vulgaris ). Os dados de todas as espécies foram de excelente qualidade ( por exemplo , Figura 3 ) <p clAss = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; A seção de protocolo 1.2 foi otimizada para o processamento de amostras de tecido juvenil e adulto com dimensões até 5 x 5 x 7 mm 3 e empregada para visualizar amostras de tecido do Pele, fígado, pâncreas, rim, tireóide, coração, músculo estriado, cérebro, nervos e modelos tumorais colhidos de humanos ( Homo sapiens ), camundongos ( Mus musculus ), ratos ( Rattus norvegicus ), porcos ( Sus scrofa domestica ) furão ( Mustela Furo ), mosca da fruta ( Drosophila melanogaster ) e peixe zebra ( Danio rerio ). Enquanto os resultados foram excelentes com a maioria dos espécimes ( por exemplo , Figura 4 , Animação 1 ), as partes muito centrais da pele (com epiderme) e espécimes cerebrais maiores que 3 x 3 x 3 mm 3, muitas vezes permanecem não mantidas devido à penetração insuficiente de eosina através Esses tecidos. Protocolo sA eção 1.3 foi otimizada para o processamento de material orgânico fibroso e empregada para visualizar a arquitetura de fibra de papel revestido, papel não revestido, material substitutivo dérmico nativo e material substituto dermico semeado de células-tronco. Essas amostras foram fáceis e rápidas de processar. Os dados do papel não revestido e a maioria dos substitutos da pele foram de boa qualidade ( Figura 5 , Animação 2 ). Ocorreram problemas no processamento do papel revestido, quando o material anorganico dificultou a penetração da eosina. Outra questão ocorreu ao processar os substitutos da pele com base em ágar porque eles foram parcialmente digeridos pela solução de infiltração. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> Figura 1: fluxo de trabalho. Os passos mostrados nas caixas vermelhas exigem modificações de acordo com as características da amostra. Passos nas caixas verdes são aqueles queSão semelhantes em todas as amostras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> Figura 2: Moldes personalizados. Os moldes podem ser adaptados cortando um furo no molde original, inserindo a lâmpada de uma pipeta Pasteur e selando-a com material de modelagem. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> Figura 3: Embriões exemplificativamente visualizados. (A, B) Embrião de rato colhido no dia embrionário, E = 9,5. A imagem da seção HREM é mostrada em (A) </Forte&gt;. O modelo 3D representado por volume mostrando a superfície é mostrado em (B) . (C) Secção sagital virtual através de um modelo volumétrico do pescoço de um embrião de rato E15.5. (D) Embrião de pintinho no estádio de desenvolvimento Hamburger Hamilton (HH) 18. Modelo de superfície da lumina dos componentes cardiovasculares combinado com renderização de volume de todos os tecidos embrionários. Barras de escala = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> Figura 4: Amostras de tecido adulto exemplificativamente visualizadas. (A) Parte de uma imagem da seção HREM através de um nervo humano. Inlay mostra uma seção da imagem com mais detalhes. (B) Parte de uma imagem da seção HREM através do fígado porcino. Observe o nUclei. (C) Parte de uma imagem da seção HREM de tecido linfático humano. (D, E) Pele grossa de um polegar humano. O modelo 3D em volume da biópsia completa. (D) A superfície produziu modelos de artérias, veias e nervos na frente de uma ressecção virtual através de dados HREM (E) . (F) Tumor experimental em tecido de rato adulto. Modelo voltado para o volume 3D em frente a três seções virtuais através de dados HREM. Observe as partes necróticas (pontas de seta). Barras de escala = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> Figura 5: material fibroso exemplificado. (A, B) Imagem da seção HREM de papel marrom não revestido. (B) </sTrong&gt; mostra uma seção de (A) . Observe as fibras e o seu lúmen. (C) seção HREM de papel revestido. Observe que as fibras permanecem impuras. (D) Modelo reduzido de volume de material substituto dérmico nativo. Observe o calibre diferente e a forma das fibras. Barras de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Filme 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> Animação 1: Modelo Renderizado por Volume da Pele Grosso de uma Almofada Humana Humana. O tamanho do bloco de tecido é aproximadamente 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . O tamanho do Voxel é 1,07 x 1,07 x 2 μm 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)</a> <pClass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> Animação 2: Modelo Renderizado de Volume do Material Substituto Dermico nativo. O tamanho da amostra é de aproximadamente 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . O tamanho do Voxel é de 0,54 x 0,54 x 2 μm 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)</a>

Nós fornecemos protocolos simples e robustos para o processamento de materiais de biópsia de várias espécies, embriões de organismos modelo biomédico e amostras de outros tecidos orgânicos para permitir a geração de dados de volume digital com o método de microscopia episcópica de alta resolução.

Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar dados digitais de volume de materiais orgânicos. Exemplos incluem embriões e tecidos embrionários de organismos modelo biomédicos, blocos de tecido obtidos de animais adultos e humanos, incluindo biópsias de pele ou músculo, e materiais como papel não revestido e substitutos da pele. A MREH auxilia na resposta a questões fundamentais nas áreas de medicina e pesquisa biomédica.Permite a análise e visualização tridimensionais de órgãos e tecidos, por exemplo, de embriões de camundongo geneticamente modificados ou de embriões de galinha manipulados. Também permite a análise de modelos de câncer bem como biópsias obtidas de tecidos humanos ou animais. A principal vantagem da HREM é que ela fornece uma maneira simples de gerar pilhas de imagens que possuem qualidade próxima à histológica.A implicação desta técnica estende-se à pesquisa sobre cicatrização de feridas utilizando modelos animais, bem como ao estudo de patologias de tecidos relacionadas à tração e reparação em humanos. O procedimento será demonstrado por BMR Marlene Rodler e Johannes Gunther, ambos da Universidade Médica de Viena, Divisão de Anatomia.Inicie com embriões fixados ou tecido embrionário de tamanho não superior a 5 x 5 x 5 milímetros cúbicos. Remova o fixador e adicione PBS.Lave a quatro graus Celsius com agita&ccedil;&atilde;o constante por 24 horas. Adicione etanol 70% aos tubos contendo o tecido e coloque as amostras em um rotator a quatro graus Celsius. Ap&oacute;s duas a tr&ecirc;s horas, continue a desidratar as amostras em solu&ccedil;&otilde;es de etanol de concentra&ccedil;&atilde;o crescente, por duas a tr&ecirc;s horas cada vez.Enquanto as amostras desidratam, prepare a solução de infiltração adicionando 0,3125 gramas de peróxido de benzoíla e 0,1 gramas de ESN a 25 mililitros da solução A em um béquer. Agite em uma placa de agitação magnética a quatro graus Celsius por duas a três horas até que o ESN e o catalisador estejam completamente dissolvidos. Coloque as amostras na solução de infiltração.Agite ou rotacione as amostras por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius. Comece preparando a solução de inclusão. Adicione um mililitro da solução B a 25 mililitros da solução de infiltração fresca.Após preparar as bandejas de moldagem, preencha a cavidade profunda dos moldes com a solução de inclusão. Transfira as amostras para os moldes usando uma colher. Certifique-se de que a amostra esteja completamente coberta pela solução de inclusão para evitar a formação de bolhas de ar.Oriente a amostra dentro do molde usando agulhas ou pin&ccedil;as. &Eacute; fundamental otimizar a orienta&ccedil;&atilde;o da amostra durante a inclus&atilde;o e marcar sua posi&ccedil;&atilde;o precisa na superf&iacute;cie do bloco. Dessa forma, a regi&atilde;o de interesse pode ser mantida pequena e o objetivo com a maior amplia&ccedil;&atilde;o poss&iacute;vel pode ser utilizado.Assim que a solução de inclusão começar a ficar viscosa, coloque um suporte de bloco sobre a fôrma e adicione a solução de inclusão através do orifício central do suporte até que a solução suba um a dois milímetros acima da base do suporte. Selle a bandeja de moldagem cobrindo-a com parafina líquida e aguarde até que endureça antes de movimentá-la. Deixe os blocos finalizarem a polimerização armazenando as bandejas de moldagem seladas por um a dois dias à temperatura ambiente.Para o processamento pós-polimerização, coloque as bandejas de moldagem com os blocos polimerizados em uma estufa laboratorial padrão e aqueça a 70 a 80 graus Celsius por um mínimo de um a dois dias. Remova os blocos dos moldes. Em seguida, identifique o campo de visão direcionando luz branca obliquamente à superfície do bloco.Contorne com o marcador preto a sombra da amostra na superfície do bloco. Monte o bloco de resina com o campo de visão indicado no microtomo e mova o suporte do bloco até sua posição de parada. Inicie a câmera digital e o software de geração de dados e adquira uma imagem em tempo real.Escolha uma objetiva com ampliação apropriada para cobrir a região de interesse. Mova a óptica para cima e para baixo e o micrótomo lateralmente até que a região de interesse coincida com o campo de visão exibido na tela do computador. Seccione o bloco até que as primeiras estruturas da amostra se tornem visíveis.Mova o micr&ot&oacute;mo para posicionar a superf&iacute;cie do bloco no plano focal da &oacute;ptica. Escolha uma espessura de corte entre 0,5 e cinco m&iacute;crons. Em seguida, ap&oacute;s configurar o software de acordo com as instru&ccedil;&otilde;es do fabricante, inicie o software e comece a captura de dados.Esta imagem de corte HREM mostra um corte sagital através de um embrião de camundongo colhido no 9,5º dia embrionário. Este modelo tridimensional renderizado em volume mostra a superfície desse embrião. Esta imagem mostra um corte sagital virtual através de um modelo renderizado em volume do pescoço do embrião de camundongo colhido no 15,5º dia embrionário.O modelo de superfície destaca as luzes do sistema cardiovascular em uma renderização volumétrica de todos os tecidos de um embrião de galinha, num estágio de desenvolvimento Hamburger Hamilton 18. Esta imagem mostra uma seção HREM de um nervo humano. O detalhe amplia a seção desta imagem.Esta imagem mostra parte de uma seção de RMHE através do fígado de suíno. Esta imagem mostra um modelo tridimensional renderizado por volume de uma biópsia retirada da polpa do polegar humano. Esta imagem mostra os modelos de superfície renderizada de artérias, veias e nervos dérmicos em frente a uma ressecção virtual através de dados de RMHE.Esta animação mostra um modelo renderizado em volume da pele espessa da polpa do polegar humano. Diferentes limiares e, consequentemente, diferentes estruturas dérmicas, como vasos sanguíneos, fibras nervosas, glândulas sudoríparas e os ductos das glândulas sudoríparas. A HREM permite a visualização rápida da arquitetura de material fibroso.Esta imagem mostra um modelo renderizado em volume do material nativo de substituto dérmico. Esta animação mostra o modelo renderizado em volume do material de substituto dérmico. Observe a forma diferente e o calibre das fibras.As amostras precisam ser desidratadas, infiltradas e embutidas em resina, de modo que todo o procedimento pode levar até vários dias, mas inclui apenas duas a três horas de trabalho operacional para preparar soluções, trocar soluções e assim por diante. A geração de dados propriamente dita é totalmente automatizada no aparelho HREM, e 1000 imagens podem ser produzidas em duas a três horas. Após seu desenvolvimento, a HREM abriu caminho para pesquisadores na área de biologia do desenvolvimento poderem avaliar com precisão o fenótipo de embriões de camundongos mutantes.Um exemplo é o projeto de decifração dos mecanismos de distúrbios do desenvolvimento ou DMDD, no qual a HREM é utilizada para fenotipagem de embriões de camundongo letais durante o desenvolvimento embrionário, com um nível de detalhe ainda desconhecido. Descobriu-se que a HREM também é uma excelente alternativa à microscopia de luz posicional para examinar a arquitetura de vasos sanguíneos, nervos ou fibras em amostras de tecido humano.

high-resolution-episcopic-microscopy-hrem-simple-robust-protocols-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.

Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão

Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Descrevemos um protocolo detalhado usando microscopia episcópica de alta resolução para adquirir imagens tridimensionais (3D) de embriões de camundongos. Este protocolo aprimorado utiliza um método de preparação de tecido modificado para aumentar a penetração do corante fluorescente, permitindo assim a análise morfométrica de espécimes pequenos e grandes.

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

Microscopia holográfica digital (DHM) é uma técnica volumétrica que permite amostras de imagens realizadas 50-100x mais espesso que brightfield microscopia em resolução comparável, com o foco de pós-processamento. Aqui DHM é usado para identificar, contando e acompanhamento de microorganismos em muito baixas densidades e em comparação com medições de densidade óptica, contagem de placa e contagem direta.

Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Uma instrução detalhada é descrita em como construir um altamente inclinado varrido telha (HIST) microscópio e seu uso para a imagem latente de único-molécula.

Um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.

Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.

Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica

Aprenda a gerar dados volumétricos digitais de alta resolução usando microscopia episcópica (HREM) para análise tridimensional de tecidos biológicos, embriões e biópsias. Este método robusto permite visualizar arquitetura tecidual com qualidade próxima à histológica.

Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos (Vídeo) | JoVE Journal

Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos

Explorar mais vídeos